Name: Fare Retinal Sirkülasyonunda Akış Dinamikleri Çalışmak İçin Eritrositler ve Lökositlerin Floresan Boya Etiketlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Keşfedin fare retinal dolaşımında kan hücreleri dinamiklerini canlı hücre görüntüleme ile. Tarama lazer oftalmoskop kullanarak diyabetik retinopati ve yaşla ilişkili maküler dejenerasyon mekanizmalarını araştırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Araştırma projesi Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi (NMRC), Singapur&#39;dan Yeni Araştırmacı tarafından finanse edildi. Ekip, Kasım 2012&#39;den Ekim 2014&#39;e kadar Prof. Dr. Rahibe Gül&#39;ün danışmanlığı altında Ulusal Tıbbi Araştırmalar Konseyi (NMRC) Yurtdışı Araştırma Eğitim Bursu kapsamında Gözlemevi Enstitüsü (Io), Londra Üniversitesi Koleji (UCL) üzerinde Dr Agrawal&#39;a verilen araştırma eğitimini onaylamak istiyor. David Shima. Agrawal, Dr. Shima&#39;nın laboratuvarında hücrelerin etiketlenmesi ve canlı görüntüleme konsepti ve becerileri edinmiştir. Ekip, dolayısıyla Prof. David Shima, Kenit Meissner, Dr. Peter Lundh ve Dr. Daiju Iwata&#39;nın eğitim arkadaşlığı sırasında gözetim ve rehberliği kabul etmek istiyor.

Bu çalışmada kullanılan hayvan protokolleri, SingHealth, Singapur&#39;daki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve Oftalmikte ve Vizyonda Hayvanların Kullanımı İçin Vizyon ve Oftalmoloji Araştırma Kurumu (ARVO) Beyannamesi uyarınca uyulmuştur Araştırma. 1. Eritrositlerin ve Lökositlerin Floresan Boyalarla Etiketlenmesi <ol><li> Reaktiflerin hazırlanması <ol><li> 3 mg ICG&#39;yi 1800 μL sterilize edilmiş damıtılmış suda eriterek ICG&#39;yi (1.5 mg / mL) hazırlayın. 200 uL 10x fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. </li><li> 6 mL steril damıtılmış suya 4 mL 1x PBS ekleyerek% 40 1x PBS hazırlayın. 10 ml 1x PBS 100 mg BSA ekleyerek PBS içinde% 1 sığır serum albümini (BSA) hazırlayın. BSA çözünene kadar iyice karıştırın. </li></ol></li><li> Deriştirme gradyanı santrifüjü kullanılarak eritrositler ve lökositler izolasyonu <ol><li> Fareleri uyuşturun (vahşi tay(50 mg / kg) ve ksilazin hidroklorit (0.5 mg / kg) kombinasyonunu kullanarak (ARVO kılavuz ilkeleri uyarınca program 1&#39;e göre), pe C57BL / 6) Pedal çekme refleksiyle anestezi onaylayın ( yani , ayak parmağı çimdiktir). </li><li> 29 gauge iğneyi (1 mL&#39;lik şırıngaya bağlı) kalbe doğru kostal bir açı ile yavaşça yerleştirin. İğnenin kalpte olduğunu doğrulamak için, pistonu hafifçe çekin ve kanın şırıngaya çekilip kesilmediğini kontrol edin. Kalpten doğrudan 0.8 - 1 mL kan çıkarın. </li><li> Hemen kanı, kan alma tüpünü içeren bir etilen diamin tetra asetik asit (EDTA) (1.8 mg / mL kan) içine aktarın ve kan pıhtılaşmasını önlemek için nazikçe karıştırın. </li><li> Fareler, intraperitoneal enjeksiyon ile pentobarbital (80 mg / kg) uygulayarak euthanize edin. </li><li> 2 mL&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpü ve santrifüjde tüm kanı bir polisükroz ve sodyum diatrizoat çözeltisinin (1: 1 oranında, yoğunluk 1.077 g / mL) üzerine kat edinLökositlerin ve eritrositlerin plazmadan ayrılmasına izin vermek için fuge (450 xg, 30 dakika). </li><li> Bir pipet kullanarak süpernatanı (plazma) çıkarın ve atın. Tampon katını (lökositler) ve eritrositleri (kırmızı kan hücresi tabakası) pipetleri kullanarak dikkatli bir şekilde yeni ve ayrı tüplere aktarın. </li></ol></li><li> Eritrositlerin ICG (% 1.5) etiketlenmesi <ol><li> Herhangi bir kirleticiyi çıkarmak için eritrositleri 1x PBS ile yıkayın. % 50 hematokrit yapmak için eritrositleri 1x PBS (1: 1) içinde tekrar süspanse edin. Mikro santrifüj tüplerine 0.5 mL% 50 hematokrit (~ 250 uL paketlenmiş eritrositler) ilave edin. Eritrositler (750 xg, 5 dakika) santrifüjleyin ve süpernatantı atın. </li><li> Pelleted eritrositler 200 mcL% 40 1x PBS ekleyin, iyice karıştırın ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Eritrosit süspansiyonuna 100 μL ICG (1.5 mg / mL) ilave edin, tüp ters çevirerek yavaşça karıştırın ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. 1x PBS 300 mcL ekleyin ve inkübe edin.37 ° C&#39;de bir çalkalayıcı inkübatöründe 60 dakika süre ile inkübe edildi. </li><li> Taşıyıcı eritrositler (750 xg, 3 dakika) santrifüjleyin ve 1 mL 1x PBS&#39;de süspansiyon haline getirin. </li><li> Süpernatant berrak olana kadar (adım 1.3.3), hücreleri 1x PBS ile 3 - 5 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra süpernatantı boşaltın ve% 50 hematokrit (1.25 x 108 hücre / mL) ICG etiketli eritrosit elde etmek için önceden şişmiş kırmızı eritrositlere% 1 BSA PBS (1: 1) ekleyin. </li></ol></li><li> Lökositlerin sodyum fluorescein (% 1) etiketlenmesi <ol><li> Yoğunluk gradyanlı santrifüj (adım 1.2.6&#39;dan) ile tampon katın kandan ayrıldıktan sonra, herhangi bir bulaşmayı gidermek için 10 dakika boyunca 450 x g&#39;de 10 dakika santrifüj ederek hücreleri bir kez 10 mL 1x PBS ile yıkayın. Pelleti 1x PBS&#39;nin 900 μL&#39;sinde tekrar süspanse edin. </li><li> Lökosit süspansiyon 900 mcL 100 mcL% 10 sodyum fluorescein ekleyin ve 2 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Etiketli hücreleri üç kez 10 mL 1X PBS ile santrifüjle yıkayın(450 xg, 10 dakika). Hücreleri 100 uL 1x PBS içine tekrar süspanse edin. </li></ol></li></ol> 2. Floresanla Etiketli Hücrelerin Canlı Görüntüsü <ol><li> ICG etiketli eritrositlerin canlı hücre görüntülemesi <ol><li> Sırasıyla kuyruk damarı veya retro-orbital yolu ile enjeksiyon için hücreler hazırlamak için sırasıyla% 5 ve% 1 hematokrit hücreleri yapmak için 1x PBS ile ICG etiketli eritrositlerin% 50 hematokritini 10 kat ve 50 kat seyreltin. </li><li> Kuyruk damarını dilate bırakmak için fare kızılötesi ışığın (250W yoğunluk) 5 dakika boyunca yerleştirin. Fare, intraperitonal enjeksiyon yoluyla ketamin hidroklorür (50 mg / kg) ve ksilazin hidroklorür (0.5 mg / kg) ile anestezi altına alın (burada, tarifname 1&#39;e göre ARVO kuralları uyarınca). </li><li> Her göz bebeğini% 0.5 tropikamid ve% 2.5 fenilefrin hidroklorür damlasıyla dilate edin. </li><li> Görüntüleme için kontak lensi tek gözün üzerine yerleştirin. Görüntüleme ve kuru oluşumları önleme aracı olarak oftalmik jel kullanınKornea s. Fare göz kırılmasını telafi etmek için konfokal lazer tarama oftalmoskopi (SLO) kamerayı +25 diopter lens ile düzeltin. </li><li> Fareyi SLO görüntüleme platformunun üzerine yerleştirin. Fare korneasının SLO makinesinin optik kafasına doğru baktığından emin olun. </li><li> Görüntüleme modülünü açın. İlgili görüntüleme modülü yazılımını kullanarak, &quot;Yeni Hasta&quot; düğmesine tıklayın ve fare kulak etiketi numarası, doğum tarihi, floresan boyanın yüzdesi ve etiketli hücre türünün hayvan tanımlama ayrıntılarını ekleyin. <ol><li> Görüntüleme modülünü manevra ettirerek hayvanın optik sinirini görüntüleme ekranının ortasına yerleştirin. İlgili görüntüleme modülü yazılımını kullanarak 30 ° veya 15 ° açılı görüntü ayarıyla kızılötesi (IR) fundus görüntüsünü almak için &quot;Acquire&quot; düğmesine tıklayın. Retinanın merkezini, öğrenciyi ve lazerin optik yolunu en iyi kalitede görüntü elde etmek için hizalandırın. <br/&gt; NOT: En net görüntüyü elde etmek ve en iyi ışık kaynağını elde etmek için optik yol joystick&#39;i manevra ile hizalanır. </li></ol></li><li> ICG fundus videosunu al. <ol><li> ICG filtresini (790 nm) açın, kamerayı 30 ° veya 15 ° görüş açısı ile yüksek hızlı moda getirin ve standartlaştırma için tüm okumalar için ICG yoğunluğunu 85&#39;e ayarlayın. Videoyu (ana kontrol) 8.8 / 15 kare / saniye hızında 1 dakika boyunca almak için kontrol panelinde &quot;Acquire&quot; düğmesine tıklayın. </li></ol></li><li> ICG etiketli eritrositler 100 mcL&#39;yi 30 gauge iğneye bağlı bir insülin şırınga içine yükleyin. <ol><li> Kuyruk damarı yolu üzerinden enjeksiyon için iğne şevini kuyruk damarına yerleştirin. Şırınganın içine kan akışını kontrol ederek damar içi erişimi doğrulayın ve etiketli hücreleri dolaşıma enjekte edin. </li><li> Retro-orbital yol yoluyla enjeksiyon için iğneyi gözün bitişiğinde retro-yörünge aralığa yerleştirine. Kanın geri akışını şırınga içine kontrol ederek retro-yörünge erişimi teyit edin ve etiketli hücreleri dolaşıma enjekte edin. </li></ol></li><li> Enjeksiyondan sonra fareyi yeniden konumlandırın ve IR fundus görüntüsünü (adım 2.1.6.1&#39;e bakın) ve videoyu ICG filtresini kullanarak alın (bkz. Adım 2.1.7.1). Retinal dolaşımdaki etiketli hücreler, hücrelerin enjeksiyonundan hemen sonra görselleştirilebilir. </li><li> Video karelerini elde ettikten sonra, SLO görüntüleme modülü yazılımını kullanarak videoyu dışa aktarırken .tiff biçimini seçerek video dizilerinin .tiff görüntülerini ayıklayın. Dosyaları istediğiniz klasöre kaydedin. </li><li> Kontakt lensi çıkarın, diğer gözün üzerine yerleştirin ve görüntülemeyi adımlar 2.1.4 - 2.1.7&#39;de açıklandığı gibi tamamlayın. </li><li> Görüntüleme sonrasında, anesteziden kurtulana kadar vücut ısısını korumak için anestezi altındaki hayvanı kızılötesi ışığın (250W) altına koyun. Hayvan tamamen kurtarıldığında fareyi tutma kafesine geri koyun.</li></ol></li><li> % 1 sodyum fluorescein ile işaretlenmiş lökositlerin canlı hücre görüntülemesi <ol><li> Fareyi hazırlayın ve cihazı, bölüm 2.1&#39;de açıklandığı gibi kurun. </li><li> Fareyi konumlandırın ve IR fundus görüntülerini adımlar 2.1.4 - 2.1.6&#39;da açıklandığı gibi alın. <ol><li> Standartlaştırma için tüm okumalar için 30 ° veya 15 ° açı ve standart fluorescencein yoğunluğu 85 olan yüksek hızlı kamera modu ile fluorescein filtresi (488 nm) kullanarak fare floresein anjiyogramını elde edin. Videoyu 8.8 / 15 kareye / s&#39;ye kaydedin (bkz. Adım 2.1.7.1). NOT: Burada, birden fazla video parçası (1 dak video) farklı zaman aralıklarında elde edilmiştir. </li></ol></li><li> Bölüm 2.1.8&#39;de açıklandığı gibi kuyruk damarı veya retro-orbital enjeksiyon yoluyla fare içine 100 mcL etiketli lökositler enjekte edin. </li><li> Enjeksiyondan hemen sonra fareyi konumlandırın ve IR fundus görüntüsünü alın (bkz. Adımlar 2.1.5 ve 2.1.6) ve fluoFare anjiyogramını ressein (bkz. Bölüm 2.2.2). </li><li> Görüntüleme modülü üzerindeki odaklama düğmesini çevirerek tarama lazerinin odak noktasını ayarlayarak retina veya koroid kan damarlarındaki etiketli hücrelere dikkat edin. </li><li> SLO görüntüleme modülü yazılımını kullanarak video kareleri ve görüntüleri elde edin (bkz. Adım 2.1.10) ve istenen bir klasöre kaydedin. </li><li> Prosedürden sonra, hayvan bakımı için 2.1.12. Adıma dikkat edin. </li></ol></li><li> MtrackJ yazılımı ile görüntü analizi <ol><li> ImageJ&#39;de &quot;Dosya&quot; yı tıklayarak resim sırasını açın. &quot;Al&quot; ı seçin ve &quot;Resim sekansı&quot; nı seçin, istediğiniz görüntü klasörünü seçin ve &quot;Aç&quot; ı tıklayın. Ekranda &quot;Sıra seçenekleri&quot; adlı bir açılır pencere belirecektir. &quot;Tamam&quot; ı tıklayın; Görüntü sırası açılacaktır. </li><li> Resim videosunun çerçeve aralığını &quot;Resim&quot; i tıklayarak seçin ve hız ölçümleri için &quot;Özellikler&quot; i seçin. Burada, 8.8 çerçevees / s. </li><li> &quot;Eklentiler&quot; i seçerek MTrackJ eklentisini açın. &quot;İzleme&quot; yi seçin ve ardından &quot;MtrackJ&quot; öğesini seçin. Bir menü görünmelidir. </li><li> İzleme ayarlarını yapmak için, &quot;İzleme&quot; yi (menü altında) seçin ve &quot;Nokta ekledikten sonra bir sonraki çerçeve dizinine taşı&quot; kutusunu işaretleyin. </li><li> İlk hücrenin yolunu izleyin. <ol><li> Bir hücreyi bulun ve sonraki hücrelerde aynı hücrenin izini takip edin. Menüde yeni bir parça eklemek için &quot;Ekle&quot; yi tıklayın. </li><li> İmleci imajın üzerine getirin (+ işareti) ve uygun hücrenin üzerine tıklayın. NOT: MTrackJ otomatik olarak sonraki zaman aralığına atlar ve yörüngenin ilk noktasının konumunu işaretleyen küçük bir daire ekler. </li><li> Görüntü sırası çerçeveleri arasında gezinirken hücrenin geçerli konumunu tıklayarak devam edin. NOT: Bazen, yörüngedeki önceki noktaları işaretleyen daireler, geçerli konumu görüntüleme yeteneğini etkiler. Bu gerçekleşirse,Adım 2.3.5.3.1&#39;e geçin. <ol><li> Yörüngenin görüntüleme seçeneğini, menüde &quot;Görüntüleme&quot; yi tıklayarak ve &quot;şu andaki saatte yalnızca iz noktalarını göster&quot; seçeneğini belirleyerek değiştirin. Tüm yörüngeleri görmek için bu seçeneğin seçimini kaldırın. </li></ol></li><li> İlk hücrenin yörüngesi görene kadar tıklaymaya devam edin. Daha sonra &quot;Kaydet&quot; i tıklayarak parçayı kaydedin. </li></ol></li><li> İkinci hücrenin yolunu izleyin. <ol><li> Menüde yeni bir parça başlatmak için &quot;Ekle&quot; yi tıklayın. Yeni hücreyi izlemek için 2.3.5.1 - 2.3.5.4 adımlarını tekrarlayın. İkinci parçayı kaydetmek için &quot;Kaydet&quot; i tıklayın. </li><li> Gözlemlenebilir tüm izlenebilir hücreler için bu adımları uygulayın. Hücreleri takib ettikten sonra, sonuçları almak için menü sekmesindeki &quot;Ölçme&quot; ve &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. NOT: Bir sonuç penceresi otomatik olarak açılır; daha fazla analiz için kaydedilebilir ve bir elektronik tabloya açılabilir. </li></ol></li></ol></li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok. Mali veya çıkar çatışması yok.

Birçok oküler hastalığın patofizyolojisini anlamak için retinal ve koroid sirkülasyonundaki hemodinamiğin araştırılması hayati önem taşımaktadır. Retinal dolaşımdaki kan akımı dinamikleri Fourier domain optik koherens tomografi (FD-OCT), lazer speckle flowgraphy (LSFG) ve retinal oksimetre ile incelenebilir. Bu yöntemler, retinal dolaşımdaki toplam kan akışını incelemek için farklı yaklaşımlar kullansalar da, 40 , 41 , 42 ...

Retina ve koroid sirkülasyonunda kan hücrelerinin akış dinamiklerini incelemek, görme engelli göz hastalıkları ve diğer oküler inflamatuvar durumların patogenezini anlamak için şarttır. Bununla birlikte, floresan boyaların plazma proteinlerine bağlanmasını içeren geleneksel anjiyografi teknikleri, eritrositlerin veya lökositlerin dinamikleri ile ilgili herhangi bir bilgi sağlamaz 1 . Eritrosit retina akışı dinamikleri, çeşitli inflamatuar koşullarda hücre göçü, tanıma, adezyon ve yıkımı anlamak için retinadaki metabolik olarak etkili dolaşımı ve lökosit akış dinamiğini incelemek için önemlidir 2 . Çeşitli hücre tiplerinin tanımlanmasında ve tanımlanmasında kullanılan çeşitli floresan molekülleri vardır 3 . Kan hücrelerinin hemodinamiği, uygun floresanla boyanarak ölçülebilirSent boyalar ve uygun görüntüleme tekniklerinin uygulanması 4 . Yaşa bağlı maküler dejenerasyon (AMD) ve diyabetik retinopati (DR) gibi göz içi hastalıklarında inflamatuar yanıtların varlığı, hastalıklı bölgedeki lenfosit birikimini içerir 5,6 . Dokulardaki bağışıklık hücrelerinin takibi, hastalık patogenezi mekanizması içerisinde yer alan karmaşık olayları anlamaya yardımcı olabilir. Erken çalışmalarda hücre izleyicileri olarak 51 Cr ve 125 I gibi radyoaktif izotoplar kullanılmıştır. Bu boyalar toksiktir ve hücre yaşayabilirliğini etkiler. Radyoaktif işaretleyiciler 3 H ve 14 C, düşük emisyon enerjileri nedeniyle hücrelere karşı daha az toksik olmasına rağmen, sistemdeki sinyallerini algılamak zordur 7,8. Bir dizi florokrom boyası, w ile ilgili potansiyel problemlerin üstesinden gelmek için getirildi.İth radyoaktif işaretleyiciler ve flöresif mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak in vitro lenfosit göçünü izlemek 9,10. Hoechst 33342 ve thiazole orange, in vivo olarak lenfositleri izlemek için kullanılan DNA bağlayıcı flüoresan boyalardır . Hoechst 33342, DNA&#39;daki AT zengini bölgelere bağlanır, membrana geçirgentir, flüoresan sinyallerini 2-4 gün korur ve söndürmeye dirençlidir 9 , 10 . Hoechst 33342 ve tiazol portakalın dezavantajları, sırasıyla lenfosit proliferasyonunun inhibisyonu 11 ve kısa yarılanma ömrüdür. Calcein-AM, floresein diasetat (FDA), 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-karboksietil) -5- (ve-6) -karboksifloresen, asetoksimetil ester (BCECF-AM), 5- (ve-6) - Karboksiflüoresein diasetat (CFDA) ve 5- (ve-6) -karboksiflüoresein diasetat asetoksimetil ester (CFDA-AM)Lenfosit migrasyon çalışmaları için kullanılan sitoplazmik floresan boyalardır. Bununla birlikte, FDA, CFDA ve CFDA-AM, hücrelerde daha düşük saklama süresine sahiptir 9 . BCECF-AM proliferatif yanıtı azaltır ve kemotaksi ve süperoksit üretimini etkiler 9,12. Calcein-AM flüoresan bir boyadır ve kısa süreli in vivo lenfosit göç çalışmaları için yararlıdır. Güçlü floresan sinyalleri yayar, hücresel işlevlerin çoğuna müdahale etmez ve floresan sinyallerini 3 güne kadar korur 12,13. Floresan izotiyosiyanat (FITC) ve karboksiflüoresein diasetat sukkinimidil ester (CFDA-SE), lenfosit migrasyon çalışmaları için kullanılan kovalent bağlama floresan boyalarıdır. FITC, hücre canlılığı üzerinde herhangi bir etki göstermez ve B lenfositleri ile T lenfositlerine kıyasla daha güçlü bir afiniteye sahiptir. 14 , 15 </sup&gt;. CFDA-SE etiketli lenfositler 8 haftalık ve 8 hücre bölünmesi 9 , 16&#39;ya kadar in vivo izlenebilir. C18 DiI (1,1&#39;-dioktadesil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetrametilindokarbosiyanin perklorat), DiO (3,3&#39;-dioktadesiloksakarbosiyanin perklorat), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 ve PKH26, Lökositler ve eritrositlerin etiketlenmesinde kullanılan floresan lipofilik karbosiyanin boyalarının yerleştirilmesi. C18 Dil ve DiO, hücre zarına dahil edildiğinde daha yüksek sinyaller verirler ve nispeten toksik olmayan 12,17 dir. PKH2, PKH3 ve PKH26 etiketli hücreler, flüoresan sinyallerinin iyi tutulmasını, daha az toksisite 18 , 19 , 20 , 21 , 22 ile sergilemektedir. Bununla birlikte, PKH2, CD62L ekspresyonunu düzenler ve<html> Mfosit canlılığı 23 . Yukarıda bahsedilen çalışmaların çoğu, lenfatiklerde lenfosit göçü ve proliferasyonunun izlenmesi ve oküler olmayan dolaşımdaki etiketli eritrositlerin incelenmesi için yapılmıştır. Oküler dolaşımdaki kan hücrelerini incelemek için etiketleme tekniklerini uygulayan çok az çalışma bulunmaktadır. Taramalı lazer oftalmoskopinin (SLO) uygulanması, fundus anjiyografi vasıtasıyla in vivo retinal ve koroid sirkülasyonundaki etiketli hücrelerin incelenmesinde büyük bir avantaja sahiptir. Retinal dolaşımdaki lökositleri incelemek için kullanılan ICG, akridin portakalı, FITC, sodyum floresein ve CFDA gibi birkaç floresan boyası, 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = &quot;xref&quot;&gt; 31 , 32 , 33 , 34 . Akridin portakal 26 , 27&#39;nin fototoksisite ve karsinojenisitesi, FITC&#39;nin hücresel aktiviteye müdahalesi ve retinal ve koroidal kan damarlarının çözünürlüğü için intravasküler kontrast madde gereksinimi, in vivo hayvan deneylerinde uygulamalarını sınırlar 29 . Sodyum fluorosein ve ICG toksik değildir, Gıda ve İlaç İdaresi tarafından onaylanmıştır ve insanlardaki testler 32 , 35 için güvenlidir. Akışın dinamik çalışmalarının çoğu, lökositlerin veya eritrositlerin etiketlenmesi ve retinal ve koroidal kan damarlarında görselleştirilmesi ile ilgilidir 36,37,38,39 </s&gt; Yukarı. Burada, eritrositlerin ICG etiketlemesinin standartlaştırılmış bir protokolünü, lökositlerin sodyum fluorescein etiketlemesini ve SLO kullanılarak fare retinal dolaşımında görselleştirilmiş etiketli hücrelerin izlenmesini anlatacağız.

<table><tbody><tr><td>Cardiogreen polimetin boyası (İndosiyanin yeşili)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>12633-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Floresein 100 mg / mL</td><td>Novartis</td><td>U1705A / H-1330292</td><td></td></tr><tr><td>10x Fosfat tamponlu salin (PBS) Ultra Saf Sınıf</td><td>1. BASE</td><td>BUF-2040-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>K2E (K2EDTA) içeren mikrotainer tüpler - EDTA konsantrasyonu - 1.8 mg / mL kan</td><td>BD, ABD</td><td>REF</td><td></td></tr> 365974 <tr><td>Histopaque 1077 çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>05-413-401</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri 2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-CS</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>Insta BioAnalytik pte. ltd</td><td>İNCE GİRDAP</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalayıcı inkübatör</td><td>Lab Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceva Ketamin enjeksiyonu (Ketamin hidroklorür 100 mg/mL)</td><td>Ceva</td><td>KETALAB03</td><td></td></tr><tr><td>ILIUM XYLAZIL-20 (Ksilazin hidroklorür 20 mg/Ml)</td><td>Troy Laboratories PTY. Sınırlı</td><td>LI0605</td><td></td></tr><tr><td>%1 Midriasil 15 mL (Tropikamid: %1)</td><td>Alcon&nbsp; Laboratuvarlar, Inc. ABD</td><td>NDC&nbsp; 0998-0355-15</td><td></td></tr><tr><td>%2,5 Mydfrin 5 mL (Fenilefrin hidroklorür %2,5)</td><td>Alcon&nbsp; Laboratuvarlar, Inc. ABD</td><td>NDC&nbsp; 0998-0342-05</td><td></td></tr><tr><td>İğneli Terumo şırınga 1 cc/mL Tüberkülin</td><td>Terumo (Filipinler) Corporation, Filipinler</td><td>SS-01T2613</td><td></td></tr><tr><td>Vidik Jel 10 G</td><td>Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkollü bezler</td><td>Tıbbi tek kullanımlık malzemeleri garanti eder</td><td>7M-004-L-01</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal lazer taramalı anjiyografi sistemi (Heidelberg Retina Anjiyografi 2)</td><td>Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hiedelberg Spectralis Görüntüleme Modülü yazılımı, v4.0</td><td>Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskop</td><td>ZEISS</td><td>Model: axio görüntüleyici z1</td><td></td></tr></tbody></table>

fare retinal sirkülasyonunda akış dinamikleri Çalışmak İçin eritrositler ve lökositlerin floresan boya etiketlenmesi

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Retinal ve koroidal kan akımı dinamikleri, glokom, diyabetik retinopati, yaşla ilişkili maküla dejenerasyonu (AMD) ve diğer oküler inflamatuvar durumlar gibi çeşitli göz hastalıklarının patofizyolojisi ve sekeli hakkında fikir sağlayabilir. Ayrıca, gözdeki terapötik tepkilerin izlenmesine yardımcı olabilir. Etiketlenmiş hücrelerin canlı hücre görüntülemesi ile birleştirilmiş kan hücrelerinin doğru şekilde etiketlenmesi, retina ve koroid sirkülasyonundaki akış dinamiğinin incelenmesine olanak tanır. Burada, sırasıyla, farelerde eritrositler ve lökositler için% 1.5 indosiyanin yeşili (ICG) ve% 1 sodyum fluorescein&#39;in standart protokollerini açıklıyoruz. Taramalı lazer oftalmoskopi (SLO), C57BL / 6J farelerinin (vahşi tip) retina dolaşımındaki etiketli hücreleri görselleştirmek için uygulandı. Her iki yöntem fare retinal dolaşımında farklı floresanla etiketlenmiş hücreler gösterdi. Bu etiketleme yöntemleri çeşitli oküler hastalıklarda daha geniş uygulamalara sahip olabilirmodelleri.

% 1.5 ICG ile etiketlenmiş eritrositler, C57BL / 6J farelerinin (vahşi tip) retinal dolaşımında görselleştirildi. Retinal dolaşımda,% 1.5 ICG etiketli eritrositlerden% 1 ve% 5 hematokrit ayırdedilebilirdi. Bununla birlikte, bireysel etiketli hücreler,% 1.5 ICG ile etiketlenmiş eritrositlerin% 1&#39;lik hematoktriti ile daha net görselleştirildi ( Şekil 1 ). % 5 hematokritte, retina damarlarındaki çok sayıda etiketlenmiş hücre yüzünden, tek tek hücreleri işar...

Göz dolaşımındaki etiketli kan hücrelerinin canlı hücre görüntülemesi, diyabetik retinopati ve yaşla ilişkili maküler dejenerasyonda inflamasyon ve iskemi hakkında bilgi sağlayabilir. Kan hücrelerini etiketlemek ve retinal dolaşımda etiketli hücreleri imal etmek için bir protokol tarif edilmiştir.

Fare Retinal Sirkülasyonunda Akış Dinamikleri Çalışmak İçin Eritrositler ve Lökositlerin Floresan Boya Etiketlenmesi

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Bu prosedürün genel amacı, taramalı lazer oftalmoskop kullanarak farede kan hücrelerinin retinal dolaşımını görselleştirmektir. Bu yöntem, WBC'lerin ve RBC'lerin retinal taban dinamikleri nelerdir ve akış dinamikleri hastalık patogenezine nasıl katkıda bulunur gibi retinal hastalıklarla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, farklı hastalık fenotiplerini yansıtabilmesi ve uygulanmasının oldukça kolay olmasıdır.Bu prosedür ekip üyelerimiz Praveen, Bo Bo ve Neha tarafından gösterilecektir. Fare kan hücreleri tabakasını izole etmek için, taze toplanmış tam kanı iki mililitrelik bir tüp içinde 1:1 polisükroz ve sodyum diatrizoat çözeltisinin üzerine ekleyin. Ardından tüpü 30 dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından plazma süpernatantını aspire edin ve atın. Sonra, lökositlerden oluşan buffy coat tabakasını ve altındaki eritrosit tabakasını ayrı tüplere dikkatlice toplayın. Ardından, kontaminantları gidermek için eritrositleri 1XPBS ile yıkayın ve bir hacim PBS içinde yeniden süspande edin.Ardından, süspansiyondan yarım mililitrelik alikotları mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Alikotları çöktürün, süpernatanı uzaklaştırın ve peletlenmiş eritrositlere yaklaşık 200 microliters %40 1XPBS ekleyin. İyice karıştırın.Ve bunları oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Beş dakika sonra, her süspansiyona 100 µL ICG ekleyin. Tüpleri altüst ederek karıştırın ve ardından oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin.Ardından 300 µL 1XPBS ekleyin ve 37 °C'de hafif ajitasyonla bir saat boyunca inkübe edin. Sonra süspansiyonları santrifüjleyin, çöken hücreleri muhafaza edin ve bunları 1 mL 1XPBS içinde yeniden süspanse edin. Süpernatan berraklaşana kadar hücreleri 1XPBS ile yıkamaya devam edin.Süpernatan dekante edildikten sonra, ICG işaretli eritrositlerin %50 hematokrit değerine ulaşması için bir hacim %1 BSA ve PBS ekleyin. Ardından bafy katmanı (buffy coat) toplama işlemini gerçekleştirin. Öncelikle, kontaminantları gidermek için hücreleri 10 milliliters 1XPBS ile bir kez yıkayın.Örnekleri tekrar santrifüjleyin ve ardından peleti 900 µL 1XPBS içinde yeniden süspanse edin. Sonra 100 µL %10 sodyum floresein ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin. Son olarak, işaretlenmiş lenfositleri 10 mL 1XPBS ile üç kez yıkayın.Santrifüj edin ve 100 µL 1XPBS içerisinde yeniden süspande edin. Enjeksiyon için ICG ile işaretlenmiş eritrositleri hazırlamak amacıyla, önce enjeksiyon için bir alikotu %5 veya %1 hematokrit seviyesine kadar seyreltin. Fareyi anestezi altına alın ve pupillalarını dilate edin.Ardından her iki göze oftalmik pomad uygulayın. Gözlerden birinin üzerine bir kontakt lens yerleştirin. Şimdi, gözün refraksiyonunu dengelemek için pozitif 25 diyoptri bir lens kullanarak konfokal SLO kamera ile farenin görüntüsünü alın.Korneayı SLO cihazının optik başlığına doğru tam olarak yönlendirin. Ardından görüntüleme modülünü açın ve optik sinir görüntüleme ekranının merkezine gelene kadar modülü hareket ettirin. Daha sonra 30 derecelik bir açıyla kızılötesi fundus görüntülerini alın.Ardından bir kızılötesi fundus videosu çekin. 790 nanometre ICG filtresini açın, kamera modunu yüksek hıza ayarlayın ve görüş açısını 15 ila 30 derece arasında tutun. Daha sonra, tüm okumalar için ICG yoğunluğunu 85 olarak ayarlayın.Kontrol panelinde, saniyede 8,8 ile 15 kare hızında bir dakika boyunca bazal video kaydı yapmak için acquire butonuna tıklayın. Ardından, 30 gauge iğneli bir insülin şırıngasına 100 µL ICG işaretli eritrosit yükleyin ve hücreleri kuyruk venine veya retroorbital olarak enjekte edin. Enjeksiyondan hemen sonra, yeni bir kızılötesi fundus görüntüsü ve yeni bir ICG filtre videosu alın.Videoları elde ettikten sonra, görüntü analizi için bunları TIFF formatında dışa aktarın. Görüntüleri, ücretsiz olarak sunulan MHJ görüntüleme yazılım paketi ile işleyin. Dosyayı açtıktan sonra, hız ölçümleri için görüntü videosunun kare aralığını ayarlayın.Ardından MtrackJ eklentisini açın. Menüden tracking seçeneğini belirleyin ve bir nokta ekledikten sonra bir sonraki zaman çerçevesi indeksine geçme seçeneğini etkinleştirin. Şimdi ilgilenilen bir hücreyi bulun ve her bir çerçeve boyunca takip edin.Menüden, yeni bir izleme yolu eklemek için ekle'ye tıklayın ve ardından seçilen hücrenin üzerine tıklayın. Görüntüler kareden kareye ilerledikçe, hücrenin mevcut konumuna tıklamaya devam edin. İzleme işlemi tamamlandığında, görüntüleme seçeneklerinden yörünge için görüntüleme seçeneğini değiştirin ve yalnızca mevcut zamandaki izleme noktalarının görüntülenmesini seçin.Hücrenin yörüngesi görüntülenene kadar tıklamaya devam edin ve ardından izi kaydedin. Şimdi, ekle komutuyla başlayarak ve ilk hücrede yaptığınız işlemleri tekrarlayarak bir sonraki hücrenin takibine geçin. İlgilenilen tüm hücrelerin takibi tamamlandıktan sonra, ölçüm seçeneğini kullanarak tüm iz ölçümlerinin görüntüsünü açın.Ardından, çıktıyı daha sonraki analizler için kaydedin. %1,5 ICG ile işaretlenmiş eritrositler, %1 veya %5 hematokrit kullanılarak C57 black 6J farelerinin retinal dolaşımında görüntülenmiştir; hücreler ayırt edilebilmekteydi ancak %1 hematokrit ile işaretli hücreler daha kolay görüntülenmiştir. Enjekte edilen her iki konsantrasyonda da parapapiller bölgede bir miktar eritrostaz gözlemlenmiş olup, bu durum %5 hematokrit ile daha belirgin hale gelmiştir.Lökositler %1 sodyum floresein ile işaretlenmiş ve floresan mikroskobu kullanılarak yeşil işaretli hücreler olarak görüntülenmiştir. Bir miktar kümelenme gözlemlenmiştir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde altı saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedür uygulanırken, kaliteli retinal görüntüler ve videolar elde etmek için gözlerin dilate edilmesi önemlidir.

fluorescent-dye-labeling-erythrocytes-leukocytes-for-studying-flow

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Intravital mikroskopi pial mikrosirkülasyon zamansal ve mekansal hemodinamik ve inflamatuar olayları takip etmek.

Kapalı Kranial Pencere kullanarak Fare Beyin Mikrosirkülasyon intravital Mikroskopi

Yakın kızılötesi floresans (NIRF) kullanarak en son geliştirilen görüntüleme teknikleri lenfatik sistem kanseri metastazı oynadığı rol, immün yanıt, yara onarımı ve diğer lenfatik ilişkili hastalıkların ortaya çıkmasına yardımcı olabilir.

Bir Mouse Lenfatik damarları Non-invaziv Optik Görüntüleme

Bu video, bir fare gözünde intravitreal doğumdan sonra floresan biyopartiküllerin mikroglial alımını ölçmek için akış sitometrisini göstermektedir. Akış sitometrisi, CD11b'yi eksprese eden canlı hücreleri tespit eder ve yeşil floresan sergileyen fagositik mikroglia hücrelerini, Ly6C eksprese eden monositler ve Ly6G eksprese eden nötrofiller dahil olmak üzere diğer miyeloid hücrelerden ayırır.

Akış Sitometrisi Kullanılarak İntravitreal Olarak Verilen Floresan Partiküllerin Mikroglial Alımının Ölçülmesi

İntravital mikroskopi, hayvanlarda retina vasküler çaplarını, kan dolaşım hızlarını ve toplam retinal kan akışını görselleştirmek ve ölçmek için kullanılabilir.

Farelerde Retinal Kan Akışının İntravital Video Mikroskobu Ölçümleri

doku homeostazında ve yetersiz fagositik fonksiyonunun korunması patolojisinde dahil olmuştur için mikrogliyal fagositoz kritiktir. Ancak, in vivo mikroglia fonksiyonunu değerlendirmede teknik olarak zordur. Biz tam izleme ve fizyolojik bir ortamda mikroglia fagositik potansiyelini ölçülmesi için basit ama güçlü bir teknik geliştirdiler.

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

İn vivo görüntüleme, sağlık ve hastalıkta biyoloji çalışmaları için güçlü bir araçtır. Bu protokol, standart iki foton mikroskobu ile fare retinasının transpupiller görüntülemesini tanımlar. Ayrıca, retinanın birden fazla hücresel kohortunu floresan olarak etiketlemek için farklı in vivoimaging yöntemleri göstermektedir.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

Bu protokol, farelerin retinal düz montajlarının hazırlanması ve immünofloresan boyanması ve analizi için ayrıntılı bir yöntemi açıklamaktadır. Floresein fundus anjiyografinin (FFA) fare yavruları ve görüntü işleme için kullanımı da ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Oksijene Bağlı Retinopati Fare Modelinde Retina Damarlarının Dinamik Büyümesinin İzlenmesi

İntravital floresan mikroskopi, lökosit-endotel etkileşimlerini ve kılcal perfüzyonu gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılabilir. Bu protokol, vakumla stabilize edilmiş bir akciğer görüntüleme sistemi kullanarak pulmoner mikrosirkülasyondaki bu parametreleri görüntüleme ve ölçme yöntemlerini açıklar.

Vakumla Stabilize Edilmiş Bir Görüntüleme Sistemi Kullanılarak Deneysel Akut Akciğer Hasarında Pulmoner Mikrosirkülasyonun İntravital Geniş Alan Floresan Mikroskopisi

Fare retinal damar sistemi, vasküler patern oluşumunun mekanizmalarını anlamada özellikle ilgi çekicidir. Bu protokol, optik diskten sabit bir mesafede floresan anjiyografi fundus görüntülerinden fare retina damarlarının çapını otomatik olarak ölçer.

Fare Floresan Anjiyografi Görüntülerinden Retina Damar Çapının Ölçülmesi

Retina vaskülatürünün duvarlarını ve yapışık lökositleri etiketlemek için bir yöntem gösteriyoruz. Bu yapışık lökositler daha sonra bir floresan mikroskobu altında bir inflamasyon parametresi veya bu inflamasyonun tedavilere yanıtı olarak sayılabilir.

Retinal Vaskülatürde Diyabete Bağlı Yapışık Lökositlerin Miktar Tayini

Keşfedin fare retinal dolaşımında kan hücreleri dinamiklerini canlı hücre görüntüleme ile. Tarama lazer oftalmoskop kullanarak diyabetik retinopati ve yaşla ilişkili maküler dejenerasyon mekanizmalarını araştırın.

Fare Retinal Sirkülasyonunda Akış Dinamikleri Çalışmak İçin Eritrositler ve Lökositlerin Floresan Boya Etiketlenmesi

Daha fazla video keşfet