Fare Retinal Sirkülasyonunda Akış Dinamikleri Çalışmak İçin Eritrositler ve Lökositlerin Floresan Boya Etiketlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, taramalı lazer oftalmoskop kullanarak farede kan hücrelerinin retinal dolaşımını görselleştirmektir. Bu yöntem, WBC'lerin ve RBC'lerin retinal taban dinamikleri nelerdir ve akış dinamikleri hastalık patogenezine nasıl katkıda bulunur gibi retinal hastalıklarla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, farklı hastalık fenotiplerini yansıtabilmesi ve uygulanmasının oldukça kolay olmasıdır.

Bu prosedür ekip üyelerimiz Praveen, Bo Bo ve Neha tarafından gösterilecektir. Fare kan hücreleri tabakasını izole etmek için, taze toplanmış tam kanı iki mililitrelik bir tüp içinde 1:1 polisükroz ve sodyum diatrizoat çözeltisinin üzerine ekleyin. Ardından tüpü 30 dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından plazma süpernatantını aspire edin ve atın. Sonra, lökositlerden oluşan buffy coat tabakasını ve altındaki eritrosit tabakasını ayrı tüplere dikkatlice toplayın. Ardından, kontaminantları gidermek için eritrositleri 1XPBS ile yıkayın ve bir hacim PBS içinde yeniden süspande edin.

Ardından, süspansiyondan yarım mililitrelik alikotları mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Alikotları çöktürün, süpernatanı uzaklaştırın ve peletlenmiş eritrositlere yaklaşık 200 microliters %40 1XPBS ekleyin. İyice karıştırın.

Ve bunları oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Beş dakika sonra, her süspansiyona 100 µL ICG ekleyin. Tüpleri altüst ederek karıştırın ve ardından oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin.

Ardından 300 µL 1XPBS ekleyin ve 37 °C'de hafif ajitasyonla bir saat boyunca inkübe edin. Sonra süspansiyonları santrifüjleyin, çöken hücreleri muhafaza edin ve bunları 1 mL 1XPBS içinde yeniden süspanse edin. Süpernatan berraklaşana kadar hücreleri 1XPBS ile yıkamaya devam edin.

Süpernatan dekante edildikten sonra, ICG işaretli eritrositlerin %50 hematokrit değerine ulaşması için bir hacim %1 BSA ve PBS ekleyin. Ardından bafy katmanı (buffy coat) toplama işlemini gerçekleştirin. Öncelikle, kontaminantları gidermek için hücreleri 10 milliliters 1XPBS ile bir kez yıkayın.

Örnekleri tekrar santrifüjleyin ve ardından peleti 900 µL 1XPBS içinde yeniden süspanse edin. Sonra 100 µL %10 sodyum floresein ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin. Son olarak, işaretlenmiş lenfositleri 10 mL 1XPBS ile üç kez yıkayın.

Santrifüj edin ve 100 µL 1XPBS içerisinde yeniden süspande edin. Enjeksiyon için ICG ile işaretlenmiş eritrositleri hazırlamak amacıyla, önce enjeksiyon için bir alikotu %5 veya %1 hematokrit seviyesine kadar seyreltin. Fareyi anestezi altına alın ve pupillalarını dilate edin.

Ardından her iki göze oftalmik pomad uygulayın. Gözlerden birinin üzerine bir kontakt lens yerleştirin. Şimdi, gözün refraksiyonunu dengelemek için pozitif 25 diyoptri bir lens kullanarak konfokal SLO kamera ile farenin görüntüsünü alın.

Korneayı SLO cihazının optik başlığına doğru tam olarak yönlendirin. Ardından görüntüleme modülünü açın ve optik sinir görüntüleme ekranının merkezine gelene kadar modülü hareket ettirin. Daha sonra 30 derecelik bir açıyla kızılötesi fundus görüntülerini alın.

Ardından bir kızılötesi fundus videosu çekin. 790 nanometre ICG filtresini açın, kamera modunu yüksek hıza ayarlayın ve görüş açısını 15 ila 30 derece arasında tutun. Daha sonra, tüm okumalar için ICG yoğunluğunu 85 olarak ayarlayın.

Kontrol panelinde, saniyede 8,8 ile 15 kare hızında bir dakika boyunca bazal video kaydı yapmak için acquire butonuna tıklayın. Ardından, 30 gauge iğneli bir insülin şırıngasına 100 µL ICG işaretli eritrosit yükleyin ve hücreleri kuyruk venine veya retroorbital olarak enjekte edin. Enjeksiyondan hemen sonra, yeni bir kızılötesi fundus görüntüsü ve yeni bir ICG filtre videosu alın.

Videoları elde ettikten sonra, görüntü analizi için bunları TIFF formatında dışa aktarın. Görüntüleri, ücretsiz olarak sunulan MHJ görüntüleme yazılım paketi ile işleyin. Dosyayı açtıktan sonra, hız ölçümleri için görüntü videosunun kare aralığını ayarlayın.

Ardından MtrackJ eklentisini açın. Menüden tracking seçeneğini belirleyin ve bir nokta ekledikten sonra bir sonraki zaman çerçevesi indeksine geçme seçeneğini etkinleştirin. Şimdi ilgilenilen bir hücreyi bulun ve her bir çerçeve boyunca takip edin.

Menüden, yeni bir izleme yolu eklemek için ekle'ye tıklayın ve ardından seçilen hücrenin üzerine tıklayın. Görüntüler kareden kareye ilerledikçe, hücrenin mevcut konumuna tıklamaya devam edin. İzleme işlemi tamamlandığında, görüntüleme seçeneklerinden yörünge için görüntüleme seçeneğini değiştirin ve yalnızca mevcut zamandaki izleme noktalarının görüntülenmesini seçin.

Hücrenin yörüngesi görüntülenene kadar tıklamaya devam edin ve ardından izi kaydedin. Şimdi, ekle komutuyla başlayarak ve ilk hücrede yaptığınız işlemleri tekrarlayarak bir sonraki hücrenin takibine geçin. İlgilenilen tüm hücrelerin takibi tamamlandıktan sonra, ölçüm seçeneğini kullanarak tüm iz ölçümlerinin görüntüsünü açın.

Ardından, çıktıyı daha sonraki analizler için kaydedin. %1,5 ICG ile işaretlenmiş eritrositler, %1 veya %5 hematokrit kullanılarak C57 black 6J farelerinin retinal dolaşımında görüntülenmiştir; hücreler ayırt edilebilmekteydi ancak %1 hematokrit ile işaretli hücreler daha kolay görüntülenmiştir. Enjekte edilen her iki konsantrasyonda da parapapiller bölgede bir miktar eritrostaz gözlemlenmiş olup, bu durum %5 hematokrit ile daha belirgin hale gelmiştir.

Lökositler %1 sodyum floresein ile işaretlenmiş ve floresan mikroskobu kullanılarak yeşil işaretli hücreler olarak görüntülenmiştir. Bir miktar kümelenme gözlemlenmiştir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde altı saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedür uygulanırken, kaliteli retinal görüntüler ve videolar elde etmek için gözlerin dilate edilmesi önemlidir.