Name: Enzimatik olarak aktif G4 Resolvase1 saflaştırılması için bir G-dörtlüsü DNA eğilim yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Öğrenin, bakteriyel sistemlerden G4 Resolvase1 proteinini ATP bağımlı saflaştırma adımı kullanarak izole etme yöntemini. Bu teknik, katalitik olarak aktif enzim elde ederek çeşitli biyokimyasal analizler için güvenilir kaynak sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz (JPV için) Aktarma Vakfı cömert bir hediye de dahil olmak üzere, bizim finansman kaynaklarını teşekkür etmek istiyorum, (PJS için) (PJS kadar) HealthGrant T32-CA079448 ve Ball State University başlangıç ​​fonları National Institutes of. fon çalışma dizaynı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı, ya da yazının hazırlanmasında hiçbir rolü vardı.

<ol><li>Qin, Y., Hurley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures%2C+folding+patterns%2C+and+functions+of+intramolecular+DNA+G-quadruplexes+found+in+eukaryotic+promoter+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions.</a> Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).</li>
<li>Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+and+understanding+the+stability+of+G-quadruplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes.</a> Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).</li>
<li>Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+prevalent+putative+quadruplex+sequence+motifs+in+human+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA.</a> Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).</li>
<li>Huppert, J. L., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+quadruplexes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence of quadruplexes in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).</li>
<li>Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+G-quadruplex+propensity+with+G4Hunter%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter.</a> Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).</li>
<li>Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M. Jr, Mergny, J. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26883636">G-quadruplexes and helicases.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).</li>
<li>Huppert, J. L., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplexes+in+promoters+throughout+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G-quadruplexes in promoters throughout the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).</li>
<li>Eddy, J., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+function+correlates+with+potential+for+G4+DNA+formation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).</li>
<li>Eddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+motifs+correlate+with+promoter-proximal+transcriptional+pausing+in+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).</li>
<li>Vaughn, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEXH+protein+product+of+the+DHX36+gene+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+unwinds+a+G4-quadruplex+in+human+telomerase+RNA+and+promotes+the+formation+of+the+P1+helix+template+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary.</a> Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).</li>
<li>Creacy, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+binds+both+DNA+and+RNA+tetramolecular+quadruplex+with+high+affinity+and+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+and+G4-RNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).</li>
<li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li>
<li>Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU+binds+an+intramolecular+RNA+G-quadruplex+in+TERC+and+associates+with+telomerase+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme.</a> Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).</li>
<li>Sexton, A. N., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+guanosine+tracts+of+human+telomerase+RNA+are+recognized+by+the+G-quadruplex+binding+domain+of+the+RNA+helicase+DHX36+and+function+to+increase+RNA+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation.</a> Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).</li>
<li>Smaldino, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Dissection+of+Telomeric+DNA+Binding+Requirements+of+G4+Resolvase+1+Shows+that+G4-Structure+and+Certain+3%27-Tail+Sequences+Are+Sufficient+for+Tight+and+Complete+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3'-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding.</a> PLoS One. 10 (7), e0132668(2015).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+suppresses+expression+of+the+transcription+factor+PITX1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1.</a> Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+contains+G-quadruplex+structures+in+its+promoter+and+5%27-UTR+and+its+expression+is+modulated+by+G4+resolvase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1.</a> Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).</li>
<li>Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+mRNA+deadenylation+and+decay+by+the+exosome-bound%2C+DExH+protein+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU.</a> Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).</li>
<li>Yoo, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHX36+enhances+RIG-I+signaling+by+facilitating+PKR-mediated+antiviral+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation.</a> PLoS Pathog. 10 (3), e1004012(2014).</li>
<li>Lai, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+helicase+RHAU+is+an+essential+gene+and+critical+for+mouse+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis.</a> Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDX1%2C+DDX21%2C+and+DHX36+helicases+form+a+complex+with+the+adaptor+molecule+TRIF+to+sense+dsRNA+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells.</a> Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).</li>
<li>Kim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartate-glutamate-alanine-histidine+box+motif+%28DEAH%29%2FRNA+helicase+A+helicases+sense+microbial+DNA+in+human+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).</li>
<li>BD Biosciences. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf">http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf</a> (2016).</li>
<li>Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+G4+quadruplex+telomerase+RNA+unwinding+by+the+RNA+helicase+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU.</a> Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).</li>
<li>Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+amino+terminal+RHAU-specific+motif+in+the+recognition+and+resolution+of+guanine+quadruplex-RNA+by+the+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU.</a> Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol, DHX36 gen ürününün, G4 Resolvase1 (ayrıca RHAU ve DHX36 adı G4R1) (Şekil 1) izole edilmesi için son derece etkili bir ekspresyonu, saflaştırılması, ve miktar şemasını temsil etmektedir. G4-DNA-konjuge boncuk His-tag afinite kobalt afinite boncuklar üzerinde arınma ve enzimatik saflaştırma: Bu protokol, iki arıtma adımları kullanır. İkinci adım, rG4R1 G4 yapılar için vardır sıkı afinite, yüksek özgüllük ve katalitik açma faaliyeti yararlanır olduğu benzersizdir. G4 yapılarının sıkı afinite (...

G4 yapılar DNA ve RNA&#39;nın guanin zengini bölgeler içinde formu son derece kararlı bir nükleik asit ikincil yapılardır. G4 yapılar Hoogsteen-bağlanma etkileşimleri yoluyla stabilize önemli ölçüde G4 yapıları 1, 2, termal stabilitesi katkı tek değerli katyonların (örneğin. K +, Na +) merkezi boşluk içinde bağlama koordinat. Erken biyoinformatik çalışmalar insan genomu&gt; 375000 &quot;potansiyel G4 oluşturan motifler&quot; 3, 4 içerdiğini ileri sürdü. Daha yakın tarihli bir çalışma tahminleri başka bir çalışma insan genomunda 6 716.310 farklı potansiyel G4 oluşturan dizileri tahmin ederken G4 motifleri sayısı 2-5 5 faktör daha yüksek olduğunu göstermektedir. G4-şekillendirme dizileri evrimsel korunmuş ve rastgele dağılmış değilGenom. G4 motifleri gen kodlama bölgelerinde zenginleştirilmiş ve tüm gen promoteri% 40 yukarı doğru G4 motifleri 7 içerir. İlginç bir şekilde, bir gen G4 motifleri takviye derecesinin genin fonksiyonunu önermek gösterilmiştir. Örneğin, gelişiminde rol oynayan proto-onkogenler ve genler tümör baskılayıcı genlerin 8, 9 den G4 yapılarının önemli ölçüde daha fazla zenginleştirme var. yüksek termal kararlılıkları sayesinde, genom boyunca neredeyse her yerde bulunması, ve önemli ölçüde büyük hücresel süreçleri etkileme potansiyeli, hücre bu yapıları yönetmek için enzimler gelişti bulmak için şaşırtıcı değildir. , Insan (HeLa) hücreleri 10 tetramolecular G4-DNA çözülmesi aktivitesi çoğunluğunun kaynağı olarak karakterize edilen Böyle bir enzim G4 Resolvase1 (ayrıca RHAU ve DHX36 adı G4R1) &#39;dir. O zamandan beri, bu gösterilmiştir that G4R1 biçimde bağlanır ve bir katalitik G4-bağlayıcı protein, 11, 12, 13 sıkı bildirilen Kd ile tetramolecular ve tek moleküllü G4 DNA ve G4 RNA unwinds. Buna ek olarak, G4R1 G4-çözme aktivitesi Telomer / telomeraz biyoloji 11, 14, 15, 16, transkripsiyon ve ekleme 17, 18, 19, 20, geliştirme 21 hematopoez içeren biyokimyasal ve hücresel süreçlerin, geniş bir yelpazede implike edilmiştir 21 ve bağışıklık düzenleme 22, 23. G4 dizilerinin bir üstünlüğü özellikle genom ve çeşitli hücresel p boyunca yer alan ileG4R1 geçenlerde ifade ve verimli bu proteinin biyokimyasal mekanizmaları ve davranışları ortaya çıkması için rG4R1 son derece önemli olacaktır son derece aktif arındırmak yeteneği ile ilgili olduğu karıştığı edildiğini rocesses. Burada, yeni bir ifade ve verimli bir şekilde aktif enzim izole etmek rG4R1 ATP&#39;ye bağımlı, G4-çözme aktivitesi yararlanır saflaştırma şeması (Şekil 1) göstermektedir. G4R1 olduğu gibi bu şema, enzimatik reaksiyonun ürünü artık bağlanması için bir substrat olan diğer ATP bağımlı nükleik asit enzimleri saflaştırmak için uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>TriEx4-DHX36 plazmid</td><td>Addgene</td><td>68368</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta2 (DE3) plysS yetkili hücreler</td><td>Novagen</td><td>71403-4</td><td></td></tr><tr><td>SOC orta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Difco Müthiş Et Suyu</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>35 & mikro; bakteri plakalarında / büyük kültürlerde g / mL</td></tr><tr><td>Karbenikilin (bitki hücre kültürü test edilmiştir)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C3416</td><td>50 & mikro; bakteri plakalarında / büyük kültürlerde g / mL</td></tr><tr><td>İzopropil ve beta;-D-1-tiyokalaktopiranosit (IPTG)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Lizozim (tavuk yumurtası beyazından)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1963-B</td><td>veya standart kaynaktan</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1966</td><td>veya standart kaynaktan</td></tr><tr><td>1.5 M Tris-HCl, pH 8.8</td><td></td><td></td><td>Döküm çözme jeli için (protein kantitasyon jeli için); Standart kaynaktan</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 6.8</td><td></td><td></td><td>Döküm istifleme jeli için (protein kantitasyon jeli için); Standart kaynaktan</td></tr><tr><td>1 M Tris-Asetat, pH 7.8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1981</td><td>veya standart kaynaktan</td></tr><tr><td>% 70 Etanol</td><td></td><td></td><td>Standart kaynaktan</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür (1 &nbsp; M çözümü)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1665</td><td>veya standart kaynaktan</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol (2-BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin hemisülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin paramanyetik boncuklar</td><td>Promega</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8&nbsp;</td><td>Evrensel Bilimsel Tedarik A.Ş.</td><td>0718</td><td>veya standart kaynaktan</td></tr><tr><td>0.2 M EDTA, pH 6</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td></td><td>Standart kaynaktan; başlangıçta NaOH ile pH'ı ayarlayın, ardından HCl ile pH'ı tekrar ayarlayın. &nbsp;</td></tr><tr><td>A-laktalbümin (sığır sütünden Tip 1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5385</td><td></td></tr><tr><td>Kobalt metal afinite boncukları</td><td>Clonetech</td><td>635502</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit, buzul</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5'-Trifosfat (bakteri kaynağından)</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>% 40 akrilamid / Bis çözeltisi (37.5: 1)</td> <td>Biorad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>protein jeli çalıştırma tamponu yapmak için (192 mM glisin, 25 mM Tris Bazı,% 0.1 SDS)</td></tr><tr><td>% 10 Sodyum dodesil sülfat (SDS)</td> <td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>Protein</td><td>jeli çalışan tampon yapmak için 1667 (192 mM glisin, 25 mM Tris Baz,% 0.1 SDS); veya standart kaynaktan</td></tr><tr><td>10x TBE&nbsp;</td>Protein jeli çalışma tamponu yapmak için <td>Sigma-Aldrich</td><td>11666703001</td><td>veya standart kaynak</td></tr><tr><td>Tris bazından</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1'den</td><td>(192 mM glisin, 25 mM Tris Bazı,% 0.1 SDS); Standart kaynak</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>411019</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat (APS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Geniş Aralıklı Protein MW belirteçleri</td><td>Promega</td><td>V8491</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinillenmiş Z33 oligo ("Z33-Bio")</td> <td>Oligolar Vb</td><td></td>. <td>5' AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3'</td></tr><tr><td>TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM")</td> <td>Oligolar vb</td><td></td>. <td>5' TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'</td></tr><tr><td>Flor kaplı TLC plaka</td><td>Life Technologies</td><td>AM10110</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>H2O</td></tr><tr><td>Coomassie R-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27816</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td> içinde %30 <td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Çok Bantlı UV lambası</td><td></td><td></td><td>365 nm'de</td></tr> <tr><td>UV ışığı yayabilirMasa üstü santrifüj (sallanan kova rotorlu)</td><td></td><td></td> <td>4 ° C'ye kadar soğutulabilir; C</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td></td><td></td><td>4 ° C'ye kadar soğutulabilir; C</td></tr><tr><td>Digital Sonfier</td><td>Branson</td><td></td><td>Veya sonikasyon darbeleri verebilen eşdeğeri (% 30 genlik, 2 s AÇIK / 2 s KAPALI)</td></tr> <tr><td>50 & derece; C su banyosu</td><td></td><td></td><td>Z33'ün dörtlü</td></tr><tr><td>37 & derece şeklinde oluşumu için; Bakteriler</td><td></td><td></td> için C inkübatörü <td>TriEx4-DHX36 37 & derece ile dönüştürülmüş büyük Rosetta2 E. coli kültürlerinin bakteriyel dönüşümleri ve ilk gece büyümesi için</td></tr><tr><td>; C/14&nbsp; &deg; Bakteriler için C çalkalama</td><td>inkübatörü TriEx4-DHX36 ile dönüştürülmüş büyük Rosetta2 kültürlerinin büyümesi ve protein indüksiyonu için E</td>. coli OD600 okuyabilen; Baz dizisine dayalı oligomer konsantrasyonlarını okuyabilme (Biorad SmartSpec 3000 gibi)Termometre Standart kaynak PCR şerit tüplerinden <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Standart kaynaktan</td></tr><tr><td>15 ve 50 mL santrifüj tüpleri (polipropilen)</td><td></td><td></td><td>Standart kaynaktan</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri (2,0 mL)</td><td></td><td></td><td>Standart kaynaktan</td></tr><tr><td>500 mL santrifüj şişelerinden (polipropilen)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0500</td><td></td></tr><tr><td>Standart pipet uçları ve serolojik pipetler</td><td></td><td></td> dizisi <td>Standart kaynaktan</td></tr><tr><td>Jel yükleme uçları</td><td></td><td></td><td>Standart kaynaktan</td></tr><tr><td>Otomatik tekrarlayan pipet</td><td></td><td></td><td>rG4R1'in hızlı bir şekilde alıntılanması için; Standart kaynaktan</td></tr><tr><td>Termal döngüleyici</td><td></td><td></td><td>Standart kaynaktan</td></tr><tr><td>Sıvı Nitrojen</td><td></td><td></td><td>Standart kaynaktan</td></tr><tr><td>Kuru buz</td><td></td><td></td><td>Standart kaynaktan</td></tr><tr><td>Laemlli numune tamponu&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Büyük levha jellerini çalıştırmak için aparat</td><td>Biorad</td><td></td><td>Biorad Magnet Life Technologies 12301D'den Protean II xi hücre cihazını kullandık</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>One Lambda'dan (Şimdi bir Thermo Fisher Scientific markası) bir mıknatıs kullanıyoruz; ve Life aynı zamanda Thermo'nun bir yan kuruluşudur ve bu nedenle burada listelenen mıknatıs uygun bir yedek</td></tr><tr><td>olmalıdır Tıraş bıçakları</td><td></td><td></td><td>Standart kaynaktan</td></tr><tr><td>Filtre kağıdı ve huni</td><td></td><td></td><td>Standart kaynaktan</td></tr><tr><td>Cam güveç kabı</td><td></td><td></td><td>Standart kaynaktan</td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı</td><td></td><td></td><td>Standart kaynaktan</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td>Standart kaynaktan</td></tr><tr><td>Şeffaf tabaka koruyucular</td><td></td><td></td><td>Standart kaynaktan</td></tr><tr><td>Tarayıcı ve ilgili TWAIN yazılımı</td><td></td><td></td><td>Standart kaynaktan</td></tr><tr><td>Fuji</td><td>Multiguage veya eşdeğeri</td>Microsoft Excel veya eşdeğeri gibi görüntü analiz yazılımı<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

enzimatik olarak aktif g4 resolvase1 saflaştırılması için bir g-dörtlüsü dna eğilim yaklaşım

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Yüksek mertebeden DNA&#39;nın yapısı hem DNA ve RNA guanin zengini bölgelerde oluşabilir G-quadruplexes (G4s, G4 yapılar) olarak adlandırılan ve son derece termal stabildir. Orada, insan genomunda&gt; 375.000 putatif G4-oluşturucu dizileri vardır ve bunlar promoter bölümleri, çevrilmemiş bölgeleri (UTRs) &#39;de zenginleştirilmiştir ve telomerik tekrarlama olan. Nedeniyle bu yapıları replikasyon ve transkripsiyon gibi hücresel süreçleri etkileyecek potansiyeli, hücre onları yönetmek için enzimler gelişti. Böyle bir enzim, biyokimyasal ve laboratuar Nagamine ve arkadaşları tarafından ortaklaşa karakterize G4 resolvaz 1 (G4R1) &#39;dir. ve son derece sıkı bir şekilde (düşük uM aralığında Kd) her iki G4 DNA ve G4-RNA bağlanma bulundu. G4R1 HeLa hücre lizatlarında G4 çözme aktivitesinin çoğunun nedeni bu yana telomer metabolizması, lenf geliştirme, gen transkripsiyonu, hematopoiezin ve bağışıklık takibinde rol oynadığı işaret edilmiştir. ef becerisificiently ifade ve katalitik olarak aktif G4R1 G4 yapıları ve G4-çözme enzimlerin kinetik etkileşim içine daha fazla anlamada ilgilenen laboratuarlar için önem taşımaktadır arındırmak. Burada, rekombinant G4R1 (rG4R1) saflaştırılması için ayrıntılı bir yöntemi açıklanmaktadır. anlatılan prosedür, bir C-terminali histidin etiketli enzim geleneksel afinite bazlı saflaştırma bağlanan ve bir ATP son derece aktif enzim saflaştırmak için G4 DNA gevşemeye rG4R1 yeteneğinin kullanımı ile insan kodon optimize bakterilerde ifade kapsar bağımlı elüsyon adımı. protokol, rG4R1 enzimatik aktivitesi G4 DNA gevşemeye saflaştınlmış enzim yeteneği incelenerek ölçüldüğü bir kalite kontrol adımı içerir. Bir yöntem olup saflaştırılmış rG4R1 ölçümü sağlar tanımlanmaktadır. Bu protokolün alternatif uyarlamaları tartışılır.

Bu protokol, (Şekil 1) düzenli olarak hemen hemen saf, katalitik olarak aktif rG4R1 verir. RG4R1 0.013 uL aralığında (Şekil yukarıda belirtilen G4 aktivitesi deneyi ile analiz edilmiş olarak, - TAMRA etiketli tetramolecular G4-DNA, 0.2 pmol 50% 0.2 olan monomerlere dönüştürülür enzim etkinliğinin bir ölçüsü olarak, tipik olarak görülmektedir 2). Saflaştırılmış rG4R1 Coomassie boyama G4 DNA boncukları bağlamak ve bir ATP-bağımlı elüte kabiliyetini muhafaza ettiği rG4R1 k...

G4 Resolvase1 G4-bağlama proteini için dar bildirilen afinite ile G-dörtlüsü (G4) yapılara bağlanan ve HeLa hücreleri G4-DNA ayırma aktivitesinin çoğunluğunu temsil eder. Biz özellikle, katalitik olarak aktif yeniden birleştirici G4R1 saflaştırmak için afinite ve G4 Resolvase1 ATP&#39;ye bağımlı açma aktivitesi koşum yeni bir protokol açıklar.

Enzimatik olarak aktif G4 Resolvase1 saflaştırılması için bir G-dörtlüsü DNA eğilim yaklaşım

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Bu yöntemin genel amacı, neredeyse saf ve katalitik olarak aktif enzimi izole etmek için benzersiz bir ATP bağımlı saflaştırma adımı kullanarak G-quadruplex helikaz G4 Resolvase1 proteinini bakteriyel bir ekspresyon sisteminden izole etmektir. Bu yöntem, araştırmacıların geniş bir yelpazedeki in vitro biyokimyasal analizlerde kullanabilmeleri için neredeyse saf ve katalitik olarak aktif rekombinant G4 Resolvase1 proteini elde etmelerine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yanlış katlanmış veya başka şekilde katalitik olarak inaktif olan enzimleri protein preparasyonunun dışında bırakmasıdır.G-kuadrupleks helikazını elüe etmek için ATP kullanma fikri, çok yüksek tuz konsantrasyonlarında bile katalitik olarak aktif enzimi G4 boncuklarından elüe edememenin ardından ortaya çıkmıştır. Metin protokolünde açıklandığı şekilde, G-kuadrupleks Resolvase1 veya G4R1 eksprese eden geniş bakteriyel kültürler hazırlayın ve büyütün. Bakteriyel peleti, oda sıcaklığında üç mililitre TN tamponu içinde çözün.Şişeleri elinizde tutun ve bakteriyel peleti çözmek ve yeniden süspande etmek için döndürün. Çözüldükten ve nispeten homojen bir şekilde süspande edildikten sonra, hacmi TN tamponu ile b

a-g-quadruplex-dna-affinity-approach-for-purification-enzymatically

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Protein-DNA kompleksleri Kristal yapısı, protein işlevi, etki mekanizması, aynı zamanda, belirli bir etkileşimin doğasını ilişkin bilgi sağlayabilir. Burada ile birlikte kristalleşme için uzunluk, sekans ve dupleks DNA uçları optimize etmek için...

SeqA-DNA kompleksleri kristalleşmesi için DNA dupleksler optimizasyonu İteratif

Bakteriyofaj T7'nin replikasyon proteinlerini kullanarak gecikmeli iplik başlatmanın kinetiğini incelemek için hassas, jel bazlı süreksiz tahlilleri tanımlıyoruz.

Kaplama DNA sentezinin kinetiği<em&gt; İn Vitro</em&gt; Bakteriyofaj T7 çoğaltma Proteinler tarafından

Büyük ölçekli gRNA kitaplıkları oluşturmak için yöntemleri basit, verimli ve maliyet-etkin olmalıdır. Biz gRNA kütüphaneler hedef DNA Enzimatik sindirim üzerinde dayalı üretim için bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu yöntem CORALINA (kapsamlı gRNA Kütüphane üretimi kontrollü nükleaz faaliyetleri ile) pahalı özel Oligonükleotid sentezi için bir alternatif sunuyor.

Büyük ölçekli gRNA Kütüphane üretim herhangi bir DNA kaynaktan için evrensel bir iletişim kuralı

G-quadruplexes işlemek için bir tek molekül manyetik cımbız platform, G4 istikrar ve yönetmelik çalışması için izin veren çeşitli proteinler tarafından bildirilmektedir.

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Mevcut protokol, hedefleri tespit etmek için hızlı, 3 aşamalı, aptamer tabanlı üstel amplifikasyon testinin kullanımını göstermektedir. Numune hazırlama, sinyal amplifikasyonu ve renk gelişimi, kafein üzerinde teofilin varlığını tanımak için bu sistemi uygulamak için ele alınmıştır.

Aptamer tabanlı hedef tespiti, 3 aşamalı G-dörtlü izotermal üstel amplifikasyon reaksiyonu ile kolaylaştırılmıştır

Bis-3-kloropipiperidinler (B-CeP'ler), in vitro DNA şablonlarındaki G-dörtlü yapıları tanımlamak ve karakterize etmek için yararlı kimyasal problardır. Bu protokol, B-CeP'ler ile sondalama reaksiyonları gerçekleştirme ve reaksiyon ürünlerini yüksek çözünürlüklü poliakrilamid jel elektroforezi ile çözme prosedürünü detaylandırır.

In Vitro G-Quadruplex DNA Yapılarının Bis-3-Kloropiperidinler ile Kimyasal Haritalanması

CRISPR gibi teknolojilerin önündeki önemli bir engel, hayati genleri bozabilecek hedef dışı olaylardır. 'Dizileme ile Bölünme Etkilerinin İn Vitro Raporlaması için Döngüselleştirme' (CIRCLE-seq), istenmeyen bölünme bölgelerini belirlemek için tasarlanmış bir tekniktir. Bu yöntem, CRISPR-Cas9'un genom çapındaki aktivitesini yüksek hassasiyetle ve önyargısız olarak haritalandırır.

Hedef Dışı Gen Düzenlemenin Sorgulanması için CIRCLE-Seq

Bu protokol, CMG sarmal ile çözülen DNA'nın canlı görselleştirilmesi için tek moleküllü bir testin gerçekleştirilmesini gösterir. (1) bir DNA substratının hazırlanmasını, (2) floresan etiketli Drosophila melanogaster CMG helikazının saflaştırılmasını, (3) toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu için bir mikroakışkan akış hücresinin hazırlanmasını ve (4) tek moleküllü DNA çözme tahlilini açıklar.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Bu protokol, DNA polimerazlar ve G-dörtlü yapılar gibi engeller arasındaki etkileşimlerin gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlayan floresan mikroskobu tabanlı tek moleküllü DNA replikasyon testini ana hatlarıyla belirtir.

G-Dörtlülerinde DNA Polimeraz Dinamiğinin Tek Moleküllü Floresan Görselleştirmesi

Çeşitli uygulamalarda uygulama için gelişmiş enzim stabilitesi sağlayan enzim paketli dış zar veziküllerinin (OMV) üretimi, saflaştırılması ve kullanımı için bir protokol sunulmaktadır.

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Tasarım, Üretim ve Arıtma

Öğrenin, bakteriyel sistemlerden G4 Resolvase1 proteinini ATP bağımlı saflaştırma adımı kullanarak izole etme yöntemini. Bu teknik, katalitik olarak aktif enzim elde ederek çeşitli biyokimyasal analizler için güvenilir kaynak sağlar.

Enzimatik olarak aktif G4 Resolvase1 saflaştırılması için bir G-dörtlüsü DNA eğilim yaklaşım

Daha fazla video keşfet