Enzimatik olarak aktif G4 Resolvase1 saflaştırılması için bir G-dörtlüsü DNA eğilim yaklaşım

Bu yöntemin genel amacı, neredeyse saf ve katalitik olarak aktif enzimi izole etmek için benzersiz bir ATP bağımlı saflaştırma adımı kullanarak G-quadruplex helikaz G4 Resolvase1 proteinini bakteriyel bir ekspresyon sisteminden izole etmektir. Bu yöntem, araştırmacıların geniş bir yelpazedeki in vitro biyokimyasal analizlerde kullanabilmeleri için neredeyse saf ve katalitik olarak aktif rekombinant G4 Resolvase1 proteini elde etmelerine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yanlış katlanmış veya başka şekilde katalitik olarak inaktif olan enzimleri protein preparasyonunun dışında bırakmasıdır.

G-kuadrupleks helikazını elüe etmek için ATP kullanma fikri, çok yüksek tuz konsantrasyonlarında bile katalitik olarak aktif enzimi G4 boncuklarından elüe edememenin ardından ortaya çıkmıştır. Metin protokolünde açıklandığı şekilde, G-kuadrupleks Resolvase1 veya G4R1 eksprese eden geniş bakteriyel kültürler hazırlayın ve büyütün. Bakteriyel peleti, oda sıcaklığında üç mililitre TN tamponu içinde çözün.

Şişeleri elinizde tutun ve bakteriyel peleti çözmek ve yeniden süspande etmek için döndürün. Çözüldükten ve nispeten homojen bir şekilde süspande edildikten sonra, hacmi TN tamponu ile beş mililitreye tamamlayın. Ardından, kültür başına 20 miligram lizozimi 250 mikrolitre suda çözün ve yeniden süspande edilen bakterilere ekleyin.

Şişeleri elinizde dairesel hareketlerle sallayarak, lizozimin bakterileri yaklaşık beş ila 10 dakika boyunca sindirmesine izin verin. Sindirim ilerledikçe süspansiyonun rengi hafifçe açılmaya başlayacak ve süspansiyon nispeten düşük viskoziteli olacaktır. PIC olarak kısaltılan 250 µL proteaz inhibitör kokteyli ekleyin.

Ardından, bir 10 µL leupeptin alikotu ekleyin ve iyice karıştırın. Süspansiyonu buz üzerine yerleştirin ve 10 mL soğuk TN tamponu ile 22 µL beta merkaptoetanol veya BME ekleyin. Süspansiyonu 50 mL'lik bir tüpe aktarın.

%30 genliğe ayarlanmış dijital bir sonikatör ile bakterileri buz üzerinde sonikasyona tabi tutun. Bir dakika boyunca iki saniye açık ve iki saniye kapalı olacak şekilde darbeler uygulayın. Sonikasyon adımları arasında numunelerin buz üzerinde en az iki dakika soğumasına izin vererek sonikasyon işlemini üç kez tekrarlayın.

Ardından, eşit hacimde soğuk 4X sodyum sitrat salin (SSC) artı BME, PIC ve leupeptin ekleyin ve süspansiyonu karıştırın. 4 °C'ye önceden soğutulmuş bir masaüstü santrifüjde, lizatları 2.300 ×g'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra süpernatantı önceden soğutulmuş yeni 50 mL'lik tüplere aktarın.

Kültür başına bir mililitre streptavidin paramanyetik boncuk veya SPB süspansiyonu alarak 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. SPB'yi bir mıknatıs yardımıyla çöktürün. Ardından SPB'yi, iki X SSC artı beş milimolar EDTA PH8 ile iki kez yıkayın.

Ardından, yıkanmış SPB'yi aynı çözeltinin 200 microliters miktarında yeniden süspande edin. SPB süspansiyonuna, üç OD'lik bir G4 DNA alikotu ekleyin. Pipetle birkaç kez yukarı-aşağı çekerek hızlıca karıştırın.

Ardından, tüpleri bir rotatora yerleştirin ve oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca döndürün. Bu döndürme süresinin ardından, bir mililitre %0,4 laktabumin ekleyerek G4 bağlı SPB'yi bloke edin ve ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde tutun. Histidin etiketli rekombinant G4R1'i kobalt boncuklara bağlamak için, berraklaştırılmış bakteriyel lizat içeren her 50 mililitrelik tüpe bir mililitre kobalt boncuk süspansiyonu ekleyin.

Karışımı oda sıcaklığında, bir rotatör üzerinde 20 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, kobalt boncukları 4 °C'lik bir masaüstü santrifüjde 110 ×g hızda beş dakika boyunca çöktürün. Çöken kobalt boncuklarını rahatsız etmemek için birkaç mililitre sıvı bırakarak sıvıyı dikkatlice aspire edin.

Ardından, boncukları 10 ila 15 mililitre soğuk dört X SSC artı BME ile yıkayın ve boncukları daha önce olduğu gibi çöktürün. Bir sonraki berraklaştırılmış lizatı çöktürülmüş kobalt boncuklarının üzerine dökün. Rotatör üzerinde oda sıcaklığında 20 dakika daha inkübe edin ve boncukları 10 ila 15 mililitre dört X SSC artı BME ile yıkayın.

Ardından, boncukları 4 °C'de beş dakika boyunca 100 ×g'de pelletleyin. İkinci yıkamadan sonra sıvıyı aspire edin ve tüpün dibinde yaklaşık iki mililitre boncuk ve sıvı bırakın. Proteine bağlı kobalt boncuklarını, bir mililitrelik geniş ağızlı pipet ucu kullanarak önceden soğutulmuş iki mililitrelik bir tüpe aktarın.

İki mililitrelik tüpteki boncukları, dört derece santigrat sıcaklıktaki bir mikrosantrifüjde yüksek hızda kısaca santrifüjleyin. Protein bağlı kobalt boncuklarını kaybetmemeye dikkat ederek süpernatanı pipetleme yoluyla nazikçe uzaklaştırın ve atın. Boncukların üzerine 0,5 mililitre histidin elüsyon tamponu (HEB) ekleyin ve tüpü ters çevirerek boncukları yeniden süspande edin.

Ardından, kobalt boncukları soğuk odada bir rotator üzerinde beş dakika boyunca HEB içerisinde inkübe edin. Sonrasında, süspansiyonu dört °C'lik bir mikrosantrifüjde bir dakika boyunca 18,000 ×g hızında santrifüjleyin. Kobalt boncukların üzerinde az miktarda sıvı bırakacak şekilde, protein içeren süpernatanı dikkatli bir pipetleme ile nazikçe uzaklaştırın.

Süpernatantı önceden soğutulmuş 15 milliliter'lik bir tüpe aktarın. Bu adımları toplam üç HEB elüsyonu için tekrarlayın. Ardından PH 6.0'da 0.2 molar EDTA ile bir kez elüsyon yapın.

EDTA kobaltı şelatladıkça, kobalt boncuklarının rengi pembeden beyaza dönecektir. Bu dördüncü ve son elüsyon 15 mililitrelik tüpe aktarıldıktan sonra, bir mililitrelik pipet ucunun ucuna takılmış bir jel yükleme ucu kullanarak kobalt boncuklarındaki kalıntı elüsyon tamponunu pipetleyin. Ucu tüpün tabanına kadar indirerek, protein içeren kalıntı elüsyon tamponu toplanabilir.

Hazırlanan G4 SPB'yi bir mıknatıs yardımıyla tüpün kenarına çekin ve süpernatantı atın. Ardından, G4 SPB'ye bir mililitre üç X res tamponu ekleyin ve karıştırmak için pipetleyin. Üç X res tamponu içinde süspande edilen G4 SPB'yi, yaklaşık iki mililitre protein içeren HEB EDTA bulunan 15 mililitrelik tüpe pipetleyin.

Boncukların çökmemesi için ara ara çalkalayarak 37 °C'lik bir su banyosunda 15 dakika inkübe edin. Protein bağlı G4 SPB'leri metin protokolünde açıklandığı şekilde yıkadıktan sonra, G4 SPB'leri buz üzerinde bir mıknatıs yardımıyla çöktürün ve boncukları 100 µL önceden ısıtılmış elüsyon tamponunda yeniden süspanse edin. Boncukları hemen önceden ısıtılmış bir PCR tüpüne aktarın ve 37 °C'de 30 saniye boyunca inkübe edin.

Hızla 12 µL beş molar sodyum klorür ekleyin ve pipetle 20 ila 30 kez güçlü bir şekilde aşağı yukarı çekin. Elüsyon tamponunda bulunan yüksek tuz ve ATP kombinasyonu, rekombinant G4R1'in G4 boncuklarından elüe edilmesini sağlar. G4 SPB'yi bir mıknatıs yardımıyla hemen çöktürün ve protein içeren elüatı buz üzerinde temiz bir PCR tüpüne aktarın.

Elüsyon ve transfer işlemleri tekrarlandıktan sonra, nihai ürün yaklaşık 200 microliters saflaştırılmış rekombinant G4R1 içeren elüsyon tamponudur. Son olarak, yüksek aktiviteli rekombinant G4R1'in saflaştırılıp saflaştırılmadığını test etmek için metin protokolünde açıklandığı şekilde kalite kontrol enzimatik aktivite analizini gerçekleştirin. G4 analizi, rekombinant G4R1 enzimatik aktivitesinin bir ölçümünü sağlar.

Enzimde 0,2 ile 0,013 µL aralığında, tetrametilrhodamin etiketli tetramoleküler G4 DNA'nın 0,2 pmol'ünün %50'sinin monomerlere dönüştüğü tipik olarak gözlemlenir. Purifiye rekombinant G4R1'in Coomassie boyaması, beklenen 120 kDa boyutunda tek bir bant ve yaklaşık 75 kDa'da küçük bir kontaminasyon bandı göstermektedir. Bu bant, G4 DNA boncuklarına bağlanma yeteneğini koruyan ve ATP bağımlı şekilde elüe olan trunkat rekombinant G4R1'i temsil ediyor olabilir.

İlgilenilen bant, bir protein standart eğrisine karşı nicelleştirilir. Bu protokol tipik olarak, bir litre bakteri kültüründen 20 ila 100 nanomolar saflaştırılmış enzimden 200 mikrolitre elde edilmesini sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, neredeyse saf ve katalitik olarak aktif enzimi izole etmek için benzersiz bir ATP bağımlı saflaştırma adımı kullanarak, bakteriyel bir ekspresyon sisteminden G4 Resolvase1 proteininin nasıl saflaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Yöntem kavrandıktan ve dondurulmuş bakteri peletleri önceden hazırlandıktan sonra, rekombinant G4R1 saflaştırması yaklaşık altı saatte gerçekleştirilebilir. Enzimin optimal katalitik aktivitesini korumak için, aksi belirtilmedikçe hazırlığın buz üzerinde tutulması önemlidir. Her zaman proteaz inhibitörleri kullanın.

Tüplerde kabarcık oluşumundan kaçının. Saflaştırılmış enzimi hızla dondurun ve gereksiz dondurma-çözme döngülerinden kaçının. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, alandaki araştırmacıların bu proteinin geniş bir DNA ve RNA substratı yelpazesine karşı bağlanma afinitelerini ve helikaz aktivitelerini doğru bir şekilde tanımlamasına yol açmıştır.

Bu yöntem, enzimatik reaksiyon ürününün artık enzim için bağlayıcı bir substrat olmadığı diğer ATP bağımlı nükleik asit enzimlerinin saflaştırılması için de uyarlanabilir.