Enzimatik olarak aktif G4 Resolvase1 saflaştırılması için bir G-dörtlüsü DNA eğilim yaklaşım

Bu yöntemin genel amacı, neredeyse saf ve katalitik olarak aktif enzimi izole etmek için benzersiz bir ATP'ye bağlı saflaştırma adımı kullanarak G-dörtlü helikaz G4 Resolvase1 proteinini bir bakteri ekspresyon sisteminden izole etmektir. Bu yöntem, araştırmacıların geniş bir in vitro biyokimyasal tahlillerde bizim için neredeyse saf ve katalitik olarak aktif rekombinant G4 Resolvase1 proteini elde etmelerine yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, yanlış katlanmış veya başka bir şekilde katalitik olarak aktif olmayan enzimi protein preparatından çıkarmasıdır.

G-dörtlü helikazı elüte etmek için ATP'yi kullanma fikri, son derece yüksek tuz konsantrasyonlarında bile G4 boncuklarından katalitik olarak aktif enzimi alüte edemedikten sonra ortaya çıktı. Metin protokolünde tarif edildiği gibi G-quadruplex Resolvase1 veya G4R1 eksprese eden büyük bakteri kültürlerini hazırlayın ve büyütün. Bakteri peletini oda sıcaklığında üç mililitre TN tamponunda çözdürün.

Şişeleri elinizde tutun ve bakteri peletini çözmek ve yeniden süspanse etmek için döndürün. Çözüldükten ve nispeten eşit bir şekilde askıya alındıktan sonra, TN tamponu ile hacmi beş mililitreye getirin. Daha sonra, kültür başına 250 mikrolitre su içinde 20 miligram lizozimi çözün ve yeniden süspanse edilen bakterilere ekleyin.

Şişeleri elinizde döndürürken lizozimin bakterileri yaklaşık beş ila 10 dakika sindirmesine izin verin. Sindirim ilerledikçe süspansiyonun rengi hafifçe açılmaya başlayacak ve süspansiyon nispeten viskoz olmayacaktır. 250 mikrolitre proteaz inhibitörü kokteyli kısaltılmış PIC ekleyin.

Daha sonra, 10 mikrolitrelik bir leupeptin alikotu ekleyin ve iyice karıştırın. Süspansiyonu buzun üzerine yerleştirin ve 10 mililitre soğuk TN tamponu ve 22 mikrolitre beta merkaptoetanol veya BME ekleyin. Süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

% 30 genliğe ayarlanmış bir dijital sonikatör ile buz üzerindeki bakterileri sonikleştirin. Bir dakika boyunca iki saniye açık ve iki saniye kapalı olarak vurun. Sonikasyonu üç kez tekrarlayın, örneklerin sonikasyon adımları arasında en az iki dakika buz üzerinde soğumasına izin verin.

Daha sonra, eşit hacimde soğuk dört X salin sodyum sitrat veya SSC artı BME, PIC ve leupeptin ekleyin ve süspansiyonu karıştırın. Dört santigrat dereceye kadar önceden soğutulmuş bir masa üstü santrifüjde, lizatları 20 dakika boyunca 2.300 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı önceden soğutulmuş taze 50 mililitrelik tüplere aktarın.

Kültür başına bir mililitre streptavidin paramanyetik boncuk veya SPB süspansiyonu alın ve 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. SPB'yi bir mıknatısla peletleyin. Ardından SPB'yi iki X SSC artı beş milimolar EDTA PH8 ile iki kez yıkayın.

Daha sonra, yıkanmış SPB'yi aynı çözeltinin 200 mikrolitresinde tekrar süspanse edin. SPB süspansiyonuna bir üç OD G4 DNA alikotu ekleyin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hızlı bir şekilde karıştırın.

Ardından, tüpleri bir döndürücüye yerleştirin ve oda sıcaklığında en az 30 dakika döndürün. Bu dönme periyodundan sonra, bir mililitre% 0.4 laktalbümin ekleyerek G4'e bağlı SPB'yi bloke edin ve ihtiyaç duyulana kadar buzda tutun. Histidin etiketli rekombinant G4R1'i kobalt boncuklara bağlamak için, arıtılmış bakteri lizatı içeren her 50 mililitrelik tüpe bir mililitre kobalt boncuk bulamacı ekleyin.

Karışımı bir döndürücü üzerinde oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, kobalt boncukları dört santigrat derece masa üstü santrifüjde beş dakika boyunca 110 kez G'de döndürün. Sıvıyı dikkatlice aspire edin ve peletlenmiş kobalt boncukları rahatsız etmemek için birkaç mililitre sıvı bırakın.

Ardından, boncukları 10 ila 15 mililitre soğuk dört X SSC artı BME ile yıkayın ve boncukları daha önce olduğu gibi peletleyin. Bir sonraki arıtılmış lizatı peletlenmiş kobalt boncukların üzerine dökün. Döndürücü üzerinde oda sıcaklığında 20 dakika daha inkübe edin ve boncukları 10 ila 15 mililitre dört X SSC artı BME ile yıkayın.

Ardından, boncukları dört santigrat derecede beş dakika boyunca 100 kez G'de peletleyin. İkinci bir yıkamadan sonra, sıvıyı aspire edin ve tüpün dibinde yaklaşık iki mililitre boncuk ve sıvı bırakın. Proteine bağlı kobalt boncukları, bir mililitre genişliğinde delikli pipet ucu kullanarak önceden soğutulmuş iki mililitrelik bir tüpe aktarın.

İki mililitrelik tüpteki boncukları dört santigrat derecede bir mikrosantrifüjde yüksek hızda kısaca santrifüjleyin. Proteine bağlı kobalt boncuklarını kaybetmemeye dikkat ederek pipetleme yaparak süpernatanı nazikçe çıkarın ve atın. Boncukların üzerine 0,5 mililitre histidin elüsyon tamponu veya HEB pipetleyin ve tüpü ters çevirerek yeniden süspanse edin.

Daha sonra kobalt boncukları HEB'de soğuk bir odada beş dakika boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edin. Daha sonra, süspansiyonu bir dakika boyunca dört santigrat derece mikrosantrifüjde 18.000 kez G'de santrifüjleyin. Kobalt boncukların üzerinde az miktarda sıvı bırakarak dikkatli bir pipetleme yaparak süpernatan içeren proteini nazikçe çıkarın.

Süpernatanı önceden soğutulmuş 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Toplam üç HEB elutiyonu için bu adımları tekrarlayın. Daha sonra PH 6.0'da 0.2 molar EDTA ile bir kez elüte edin.

EDTA kobaltı şelatlaladığı için kobalt boncukların rengi pembeden beyaza değişecektir. Bu dördüncü ve son elüsyon 15 mililitrelik tüpe aktarıldıktan sonra, bir mililitrelik pipet ucunun ucundaki bir jel yükleme ucu kullanarak kobalt boncuklardan kalan elüsyon tamponunu pipetleyin. Ucu tüpün dibine daldırarak, elüsyon tamponu içeren artık protein toplanabilir.

Hazırlanan G4 SPB'yi bir mıknatıs ile tüpün yan tarafına pilotlayın ve süpernatanı atın. Ardından, G4 SPB'ye bir mililitre üç çözünürlüklü X res tamponu ekleyin ve karıştırmak için pipetleyin. Üç X çözünürlüklü tamponda asılı duran G4 SPB'yi, HEB EDTA içeren yaklaşık iki mililitre protein içeren 15 mililitrelik tüpe pipetleyin.

37 derecelik bir su banyosunda 15 dakika inkübe edin ve ara sıra çalkalayın, böylece boncuklar çökmez. Proteine bağlı G4 SPB'yi metin protokolünde tarif edildiği gibi yıkadıktan sonra, G4 SPB'yi buz üzerinde bir mıknatısla peletleyin ve boncukları 100 mikrolitre önceden ısıtılmış elüsyon tamponunda yeniden süspanse edin. Boncukları hemen önceden ısıtılmış bir PCR tüpüne aktarın ve 37 santigrat derecede 30 saniye inkübe edin.

Derhal 12 mikrolitre beş molar sodyum klorür ekleyin ve 20 ila 30 kez kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin. Elüsyon tamponunda bulunan yüksek tuz ve ATP'nin kombinasyonu, G4 boncuklarından rekombinant G4R1'i ayrıştırmaya hizmet eder. G4 SPB'yi hemen bir mıknatısla pellet yapın ve elute içeren proteini buz üzerindeki taze bir PCR tüpüne aktarın.

Elüsyon ve transfer tekrarlandıktan sonra, son ürün, saflaştırılmış rekombinant G4R1 içeren yaklaşık 200 mikrolitre elüsyon tamponudur. Son olarak, yüksek derecede aktif rekombinant G4R1'in metin protokolünde açıklandığı gibi saflaştırılıp saflaştırılmadığını test etmek için kalite kontrol enzimatik aktivite testini gerçekleştirin. G4 testi, rekombinant G4R1 enzimatik aktivitesinin bir ölçüsünü sağlar.

Enzimdeki 0.2 ila 0.013 mikrolitre aralığında, tipik olarak, tetramoleküler G4 DNA'sı etiketli tetrametilrodamin 0.2 pikomolünün %50'sinin monomerlere dönüştürüldüğü gözlenir. Saflaştırılmış rekombinant G4R1'in Coomassie duruşu, beklenen 120 kilodalton boyutunda tek bir bandı ve yaklaşık 75 kilodaltonda küçük bir kirletici bandı gösterir. Bu bant, G4 DNA boncuklarını ATP'ye bağımlı bir şekilde elute bağlama yeteneğini koruyan kesilmiş rekombinant G4R1'i temsil edebilir.

İlgilenilen bant, bir protein standart eğrisine göre ölçülür. Bu protokol tipik olarak bir litre bakteri kültürü başına 200 mikrolitre 20 ila 100 nanomolar saflaştırılmış enzim elde eder. Bu videoyu izledikten sonra, neredeyse saf ve katalitik olarak aktif enzimi izole etmek için benzersiz bir ATP'ye bağlı saflaştırma adımı kullanarak G4 Resolvase1 proteininin bir bakteri ekspresyon sisteminden nasıl saflaştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan ve donmuş bakteri peletlerinin önceden hazırlanmasıyla, rekombinant G4R1'in saflaştırılması yaklaşık altı saat içinde gerçekleştirilebilir. Enzimin optimal katalitik aktivitesini korumak için, aksi belirtilmedikçe, preparatörü buz üzerinde tutmak önemlidir. Her zaman proteaz inhibitörleri kullanın.

Tüplerde kabarcık oluşumundan kaçının. Saflaştırılmış enzimi hızlı bir şekilde dondurun ve gereksiz donma çözülme döngülerinden kaçının. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, alandaki araştırmacıların, bu proteinin çok çeşitli DNA ve RNA substratlarına bağlanma afinitelerini ve helikaz aktivitelerini doğru bir şekilde tanımlamasının yolunu açtı.

Bu yöntem aynı zamanda, enzimatik reaksiyonun ürününün artık enzim için bağlayıcı bir substrat olmadığı diğer ATP'ye bağımlı nükleik asit enzimlerinin saflaştırılması için de uyarlanabilir.