Name: Channelrhodopsinsteki İyon Seçiciliğinin Elektrofizyolojik Olarak Belirlenmesi için Tam Hücreli Yama Kelepçesi Kayıtları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Öğrenin, HEK293 hücrelerinde tam hücreli yama kelepçesi kayıtlarıyla kanalrodopsinlerin klorür seçiciliğini elektrofizyolojik olarak belirlemeyi. Bu yöntem, biyofiziksel kanal aktivitesinin doğrudan okunmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Mükemmel teknik yardım için Maila Reh, Tharsana Tharmalingam ve özellikle Altina Klein&#39;e teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Alman Araştırma Vakfı (DFG) (SFB1078 B2, PH için FOR1279 SPP1665) ve Kataliz, UniCat, BIG-NSE (JV) ve E4 (PH) Kavramlarını Birleştiren Kümeler tarafından desteklendi.

<ol><li>Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algal+sensory+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Algal sensory photoreceptors.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-1%3A+a+light-gated+proton+channel+in+green+algae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae.</a> Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).</li>
<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+contractile+function+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle.</a> Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).</li>
<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+heart+muscle+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo.</a> Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+noninvasive+activation+and+inhibition+of+neural+and+network+activity+by+vertebrate+rhodopsin+and+green+algae+channelrhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).</li>
<li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li>
<li>Wietek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+channelrhodopsin+into+a+light-gated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel.</a> Science. 344 (6182), 409-412 (2014).</li>
<li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+foundations+of+optogenetics%3A+Determinants+of+channelrhodopsin+ion+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).</li>
<li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).</li>
<li>Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+selectivity+and+competition+in+channelrhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ion selectivity and competition in channelrhodopsins.</a> Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).</li>
<li>Prigge, M. Über die elektrophysiologische Untersuchung und Entwicklung von farbverschobenen Kanalrhodopsinchimären aus der Grünalge Volvox carteri. , Diss. Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476">http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476</a> (2012).</li>
<li>Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Channelrhodopsin+with+a+Red-Shifted+Spectrum+and+Rapid+Kinetics+from+Mesostigma+viride%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride.</a> MBio. 2 (3), 1-9 (2011).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+highly+efficient+blue-shifted+channelrhodopsin+from+the+marine+alga+Platymonas+subcordiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis.</a> J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).</li>
<li>Hou, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+Chlamydomonas+Channelrhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins.</a> Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li>
<li>Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+excitation%2Finhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).</li>
<li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a, Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-stable+neural+state+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bi-stable neural state switches.</a> Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).</li>
<li>Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-Guided+Transformation+of+Channelrhodopsin+into+a+Light-Activated+Chloride+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel.</a> Science. 344 (6182), 420-424 (2014).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomonas+sulcata+ACR1%3A+A+Fast+Anion+Channelrhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin.</a> Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).</li>
<li>Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Natural+Green+Light+Absorbing+Chloride+Conducting+Channelrhodopsin+from+Proteomonas+sulcata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata.</a> J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+light-gated+anion+channels%3A+A+family+of+microbial+rhodopsins+for+advanced+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics.</a> Science. 349 (6248), 647-650 (2015).</li>
<li>Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+patch+clamp%3A+A+method+for+resolving+currents+through+individual+open+channels+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes.</a> Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch.+Eur.+J.+Physiol.+Arch.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JPCalc%2C+a+software+package+for+calculating+liquid+junction+potential+corrections+in+patch-clamp%2C+intracellular%2C+epithelial+and+bilayer+measurements+and+for+correcting+junction+potential+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements.</a> J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).</li>
<li>Amtmann, A., Sanders, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+procedure+for+the+correction+of+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments+on+endo-+and+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes.</a> J. Exp. Bot. 48, (Special) 361-364 (1997).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+laboratory+techniques%3A+plating+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).</li>
<li>Felgner, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).</li>
<li>Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.utdallas.edu/~tres/microelectrode/microelectrodes_ch01.pdf">Using microelectrodes.</a> Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).</li>
<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).</li>
<li>Pusch, M., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+diffusional+exchange+between+small+cells+and+a+measuring+patch+pipette%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette.</a> Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).</li>
<li>Berndt, A. Mechanismus und anwendungsbezogene Optimierung von Channelrhodopsin-2. , Diss Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100191266">http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100191266</a> (2011).</li>
<li>Prigge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color-tuned+channelrhodopsins+for+multiwavelength+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics.</a> J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).</li>
<li>Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3325117/">Rectification of the channelrhodopsin early conductance.</a> Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).</li>
<li>Beppu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+countering+of+glial+acidosis+suppresses+glial+glutamate+release+and+ischemic+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage.</a> Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).</li>
<li>Wietek, J., Prigge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+Channelrhodopsins%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhancing Channelrhodopsins: An Overview.</a> Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).</li>
<li>Ferenczi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+approaches+addressing+extracellular+modulation+of+neural+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability.</a> Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red-shifted+optogenetic+excitation%3A+a+tool+for+fast+neural+control+derived+from+Volvox+carteri%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri.</a> Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).</li>
<li>Sugiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocurrent+attenuation+by+a+single+polar-to-nonpolar+point+mutation+of+channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).</li>
<li>Kleinlogel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/neuro/journal/v14/n4/full/nn.2776.html">Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh.</a> Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+differentiating+photocurrent+properties+of+two+channelrhodopsins+from+chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas.</a> J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).</li>
<li>Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eNpHR%3A+a+Natronomonas+halorhodopsin+enhanced+for+optogenetic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications.</a> Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).</li>
<li>Berglund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminopsins+integrate+opto-+and+chemogenetics+by+using+physical+and+biological+light+sources+for+opsin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Tanımlanmış iyonik ve elektrik koşullarındaki ters potansiyellerin saptanması, ChRs&#39;in ışık aktivasyonu sonrasında taşınan iyon türleri hakkında bilgi verir. Tek bir iyon türü karmaşık bir fizyolojik ortamda çeşitlenirse ve elde edilen ters potansiyel teorik Nernst potansiyeline göre değişirse, bu iyon türü taşınan tek sayıdır. Bununla birlikte, ChR&#39;ler için, ters potansiyel kaymalar, farklı iyonik türlere geçirgenlik ve ayrıca iletken iyonlar arasındaki rekabet nedeniyle Nernst denk...

Channelrhodopsins (ChR), hareketli yeşil alglerin göz noktasında bulunan ve fototaksis ve fobik reaksiyonlar için birincil fotosensör olarak işlev gören ışık geçmeli iyon kanallarıdır. 2002&#39;deki ilk tanımından bu yana, ChRs ortaya çıkan optogenetik alanın yolunu açtı ve iskelet kasları, kalp veya beyin 3 , 4 , 5 gibi çeşitli uyarılabilir hücrelerde uygulanabilir. ChR&#39;lerin hedef hücrelerde ekspresyonu ilgili hücrenin ışık kontrollü iyon geçirgenliğine neden olur. Nöronal bağlamda, bu, aktarılan iyona bağlı olarak, hareket potansiyeli (AP) tetiklemenin 6 , 7 , 8 veya inhibisyon 9 , 10&#39;un mekansal ve zamansalIşık hassasiyeti, bir ChR varyantının iyon seçiciliğinin optogenetik uygulamasını nasıl belirlediğini vurgular. Chlamydomonas reinhardtii ve Volvox carteri&#39;den keşfedilen ilk ChRs, protonlara , ayrıca sodyum, potasyum gibi monovalent katyonlara ve daha az oranda kalsiyum ve magnezyum gibi iki değerlikli katyonlara karşı geçirgendir11,12,13. Bugün, 70&#39;den fazla doğal katyon ileten kanalrodopsin (CCR) 14 , 15 , 16 , 17 ve değişik özelliklere sahip 18 , 19 , 20 değişik mühendislik varyasyonları Fotokupi boyutu, spektral duyarlılık, kinetik ve katyon seçiciliği mevcuttur. Nörobilimde, CCR&#39;lerHücreleri harekete geçirmek ve AP&#39;leri tetiklemek için kullanıldığında ışık tahrikli mikrobiyal pompalar yıllardır nöronları susturmak için mevcut tek antagonistti. 2014&#39;te, iki grup aynı anda CCR&#39;lerin, moleküler mühendislik 9 , 21 aracılığıyla varsayılan iyon iletken gözenek boyunca polaritenin değiştirilmesi yoluyla anyon ileten kanalrodopsinlere (ACR&#39;ler) dönüştürülebileceğini gösterdi. Daha sonra doğal ACR&#39;ler birkaç kriptofit alg içinde tanımlandı 22 , 23 , 24 . En önemlisi, ACR&#39;lerin hafif aktivasyonu, erişkin nöronlardaki klorür akımlarına aracılık eder ki, emilen foton başına yalnızca tek yükleri taşıyan mikrobik pompalardan çok daha düşük ışık yoğunluklarında nöronal aktivitenin engellenmesine izin verir. ChR aktivitesi doğrudan HEK293 hücrelerindeki ışık kaynaklı akımların elektrofizyolojik yama-klemp kayıtları ile ele alınabilir. Yama kelepçesiTekniği başlangıçta 1970&#39;lerin sonlarında geliştirildi ve Hamill ve ark. Tarafından daha da geliştirildi . , Yüksek akım çözünürlüğü ve membran voltajının doğrudan kontrolü ile küçük bir hücreden (bütün hücre modu) akımların varlığının kayıt edilmesine izin verir 26 . Hücre kültürüne uygulanan bu teknik, iyonik ve elektrik kayıt koşullarını doğru bir şekilde kontrol eder ve iyon seçiciliğinin yanı sıra toplam akımın iyonların görece katkısı ile çalışılmasını sağlar. Burada, Proteomonas sulcata&#39;nın ( Ps ACR1) 22 , 23&#39;ün anyon iletken kanal rehidopsiyonu için iyon seçiciliğinin incelenmesini, yüksek klorür iletkenliğini kanıtlamak için çeşitli hücre dışı klorür konsantrasyonları altındaki akım-voltaj ilişkilerinin kaydı inceleyerek örnekleyeceğiz.

<table><tbody><tr><td>HEK293 hücreleri</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85120602</td><td>İnsan embriyonik böbrek hücreleri</td></tr><tr><td>Retinal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2500</td><td>all-trans retinal</td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td>Transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrome</td><td>FG 0445</td><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta</td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Roth</td><td>3810</td><td>Agar köprüleri</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239</td><td>CaCl2 2H2O</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Biomol</td><td>2452</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Roth</td><td>3054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biyokrom</td><td>S0615</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Roth</td><td>HN06</td><td>D (+) - Glikoz</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>2189</td><td>MgCl2 6H2O</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957</td><td></td></tr><tr><td>NMG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>N-Metil-D-glukamin</td></tr><tr><td>Na-Aspartat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6683</td><td>L-Aspartik asit sodyum tuzu monohidrat</td></tr><tr><td>Sitrik asit</td><td>Roth</td><td>6490</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER1462</td><td>Restriksiyon enzimi</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0695</td><td>Restriksiyon enzimi</td></tr><tr><td>NheI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0975</td><td>Restriksiyon enzimi</td></tr><tr><td>XL1Blue E. coli</td><td>Agilent Technologies</td><td>200249</td><td>Kemokompetif E. coli</td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Lizojeni et suyu ortamı</td><td>Roth</td><td>X964</td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>Roth</td><td>6494</td><td>Agar plakaları</td></tr><tr><td>Plazmid saflaştırma kiti</td><td>Marchery-Nagel</td><td>740727.25</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Biyokrom</td><td>A 2213</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Poli-D-lizin hidrobromür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>Kapak kayma kaplaması</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Özel yapım</td><td></td><td>Yangın parlatma</td></tr><tr><td>Serolojik pipetler</td><td>TPP</td><td></td><td>Farklı boyutlar</td></tr><tr><td>Temiz tezgah</td><td>Kojair</td><td>Biowizard SL130</td><td></td></tr><tr><td>Karıştırıcı</td><td>IKA</td><td>RCT klasik</td><td></td></tr><tr><td>Gümüş tel</td><td>Bilim Ürünleri</td><td>AG-T25; AG-T10</td><td>Elektrotlar, 0,64 mm (banyo); 0,25 mm (elektrot)</td></tr><tr><td>pH ölçer</td><td>Knick</td><td>765 Kalimetrik</td><td></td></tr><tr><td>Ozmometre</td><td>Vogel</td><td>OM 815</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>ID03</td><td>Yangın parlatma</td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>Bağlayıcı</td><td>CB150</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü kapları</td><td>TPP</td><td>93040</td><td>34 mm iç çap</td></tr><tr><td>Kapak kızakları</td><td>Roth</td><td>P232</td><td>15 mm çap</td></tr><tr><td>Termometre</td><td>R&ouml; ssel Messtechnik</td><td>MTM12</td><td></td></tr><tr><td>Işın ayırıcı</td><td>Chroma</td><td>21011</td><td>90/10 iletim</td></tr><tr><td>Pipet tutucu</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>PPH-1P-AXU-0-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Amplifikatör</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>AxoPatch200B</td><td></td></tr><tr><td>Sayısallaştırıcı Moleküler</td><td>Cihazlar</td><td>DigiData1400</td><td>Dijital analog dönüştürücü</td></tr><tr><td>Işık kaynağı</td><td>TILL Fotonik</td><td>Polikrom V</td><td>540 nm tam yoğunluğa ayarlayın</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 100</td><td></td></tr><tr><td>Deklanşör</td><td>Vincent Associates</td><td>VS25</td><td></td></tr><tr><td>Deklanşör sürücüsü</td><td>Vincent Associates</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr><tr><td>Cam kapilarries</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-3</td><td>Ateşle parlatılmış uçları olan boresilikat kılcal damarlar OD 1,5 mm İç çap 0,86 mm</td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme Sutter</td><td>Instruments</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>Banyo işleyicisi</td><td>Lorenz Messger&auml; tebau</td><td>MPCU</td><td></td></tr><tr><td>Üç Bantlı filtre seti</td><td>Chroma</td><td>69008</td><td>Floresan filtresi&nbsp; ECFP/EYFP/mKiraz&nbsp;</td></tr><tr><td>CCD kamera</td><td>Watec</td><td>Wat-221SCCD</td><td></td></tr><tr><td>Optometre</td><td>Gigahertz Optik</td><td>P9710</td><td>Işık yoğunluklarını ölçün</td></tr><tr><td>Objektif</td><td>Carl Zeiss</td><td>421462-9900-000</td><td>W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>Kayıt odası</td><td>Özel yapım</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Güç kaynağı</td><td>Manson</td><td>HCS-3202</td><td>Mikroskoptan kaynaklanan elektriksel gürültüyü önler dahili güç kaynağı</td></tr><tr><td>Titreşim yalıtımlı masa</td><td>Newport</td><td>M-VW-3636-OPT-01</td><td></td></tr><tr><td>Faraday kafesi</td><td>Özel yapım veya herhangi bir ticari eşleştirme masası</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hortumlar</td><td>Herhangi bir ticari; örneğin Roth</td><td></td><td>Banyo kullanımı ve pipet basıncının uygulanması için farklı boyutlar ve malzemeler; agar köprüleri</td></tr><tr><td>Doğrusal çalkalayıcı</td><td>Sunlab Instruments</td><td>SU 1000</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı bağlantı potansiyeli hesaplayıcısı</td><td>Moleküler Cihazlar veya doğrudan Peter H. Barry</td><td></td><td>Program, Clampex edinim yazılımına dahildir veya şu adresten edinilebilir: p.barry@unsw.edu.au</td></tr><tr><td>Veri toplama yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Clampex 10.X</td><td></td></tr><tr><td>Veri değerlendirme yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Clampfit 10.X</td><td></td></tr><tr><td>PsACR1</td><td>GenBank veya Addgene</td><td>KF992074.1 veya Addgene plazmid #85465</td><td>PsACR1 için gen kodlaması</td></tr><tr><td>Amplifikatör kılavuzu</td><td>Moleküler</td><td>Cihazlar Akson Kılavuzu</td><td></td></tr></tbody></table>

channelrhodopsins&#39;teki İyon seçiciliğinin elektrofizyolojik olarak belirlenmesi için tam hücreli yama kelepçesi kayıtları

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Geçtiğimiz on yıl boyunca, kanalhodopsinler nörobilimsel araştırmalarda vazgeçilmez bir unsur haline geldi ve hedef hücrelerdeki elektrik süreçlerini invaziv olmayan bir şekilde manipüle etmek için kullanılan araçlar haline geldi. Bu bağlamda, bir kanalhodopsinin iyon seçiciliği özellikle önem taşımaktadır. Bu makale, HEK293 hücrelerindeki elektrofizyolojik yama-klemp kayıtları yoluyla Proteomonas sulcata&#39;nın yakın zamanda tanımlanmış bir anyon iletici kanallıdopsininin klorür seçiciliğinin araştırmasını açıklamaktadır. Işık geçitli fotokroallerinin ölçülmesine yönelik deneysel prosedür, hızlı bir şekilde değiştirilebilir - ideal olarak monokromatik bir ışık kaynağı gerektirir, aksi halde geleneksel bir patch-clamp tertibatının mikroskopta birleştirilir. Deneyden önce preparatif prosedürler, tamponlanmış solüsyonların hazırlanması, sıvı bağlantı potansiyelleri üzerine düşünceler, hücrelerin tohumlanması ve transfeksiyonu ve yama pipetlerinin çekilmesi ile ilgili olarak özetlenmektedir. Akım-gerilim ilişkisinin gerçek kaydıS farklı klorür konsantrasyonları için reversal potansiyelleri belirlemek için transfeksiyondan 24 saat sonra 48 saat gerçekleşir. Son olarak, elektrofizyolojik veriler, klorür iletiminin teorik düşüncelerine göre analiz edilir.

<html> Şekil 2 , tarif edilen protokolden sonraki ölçümlerden elde edilen temsili sonuçları göstermektedir. Yeşil ışık ile aydınlatma esnasında, Ps ACR1 hızlı bir geçici akım içerir ve bu hızla sabit bir akım seviyesine kadar azalır. Işık kapatıldıktan sonra, fotokupiller milisaniye içinde sıfıra iner ( Şekil 2A ). Ekstrasellüler klorür konsantrasyonunun değişimi, elde edilen fotokupl izlerinde doğrudan görülebilen ters potansiyelin kaymasına ned...

Bu makale, channelrhodopsinin iyon seçiciliğinin, HEK293 hücreleri kullanılarak elektrofizyolojik tam hücre yama-klemp kayıtlarıyla nasıl belirlendiğini açıklamaktadır. Burada, anyon seçici bir channelrhodopsinin klorür seçiciliğini araştırmak için deneysel prosedür gösterilmiştir. Bununla birlikte, prosedür farklı seçiciliğe sahip diğer channelrhodopsinlere aktarılabilir.

Channelrhodopsins&#39;teki İyon Seçiciliğinin Elektrofizyolojik Olarak Belirlenmesi için Tam Hücreli Yama Kelepçesi Kayıtları

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Bu deneyin genel amacı, yeni ışık kapılı iyon kanallarının klorür seçiciliğini belirlemektir. Bu yöntem, fotoakım genlikleri, kinetik ve iyon seçiciliği gibi channelrhodopsinlerin biyofiziğindeki temel soruları cevaplayabilir. Bu tekniğin ana avantajı, hızlı ve kopyalanması kolay olan biyofiziksel kanal aktivitesinin doğrudan okunmasıdır.Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü HEK hücrelerinin hazırlanmasından foto akımların kaydedilmesine kadar deneysel prosedürün her adımının optimize edilmesi gerekir. HEK hücrelerinin tohumlanması ve transeksiyonu Altina Klein tarafından gösterilecektir. Bu işleme başlamak için, katı bileşenleri 100 mililitre hücre içi ve 500 mililitre hücre dışı tamponlu çözeltiler için ayrı beherlerde tartın.Ve sonra hazırlanan stok çözeltilerinin ilgili miktarını ekleyin. Daha sonra ultra saf su ekleyin ve asitleri ve bazları kullanarak pH'ı dikkatlice ayarlayın. Daha sonra hücre içi ve hücre dışı çözeltiler için glikoz ile ozmolariteyi sırasıyla 290 miliosmol ve 320 miliosmole ayarlayın.Bu prosedürde, 35 milimetrelik bir Petri kabına yan yana üç adede kadar lizin kaplı cam kapak kayışı yerleştirin. Daha sonra,% 10 FBS ve her tab

whole-cell-patch-clamp-recordings-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu Xenopus laevis oosit kelepçe kayıt yama için bir giriş olarak tasarlanmıştır. Vitellin membran, bir gigaohm mühür (gigaseal) oluşumu ve dış topoloji yama isteğe bağlı dönüşüm kapsar.

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

İşte biz elektrofizyolojik kayıtlar için fare retina karanlık adapte dilim üretmek için bir prosedür açıklanmaktadır.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

BK kanalları İyonik akım yama klemp teknikleri kullanılarak kaydedildi. BK kanalları ifade edilmiştir.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında Mauthner nöronlarının ve diğer retikülospinal hücrelerin elektriksel özelliklerini incelemek için bir yöntem olan tam hücre yama kelepçesi elektrofizyolojisi adı verilen bir tekniği tanımlar.

Tüm Hücre Yama Kelepçesi Elektrofizyolojisi: Nöronların Elektriksel Özelliklerini İncelemek İçin Bir Yöntem

Video, bir tam hücre konfigürasyonu oluşturarak Drosophila'nın ommatidiumunun fotoreseptör nöronlarındaki elektriksel aktivitenin kaydedilmesini göstermektedir. Geçici reseptör potansiyel kanallarının ışık darbeleri ile aktivasyonunu vurgular ve ölçülebilir kuantum çarpmalarına neden olur.

Drosophila Fotoreseptörlerinden Tüm Hücre Voltaj Kelepçesi Kayıtları

Bu videoda, bir floresan raportör ile kaynaşmış ışığa bağımlı iyon kanalı proteinlerini ifade eden embriyonik böbrek hücresi kültürleri, ışığın iyon hareketi üzerindeki etkisini göstermektedir. Tüm hücre yama kelepçesi, iyonların hareketini izlemek için kullanılır.

Işığa Bağımlı İyon Kanallı Hücrelerin Optogenetik Elektrofizyoloji Kaydı

Biz su kaplan semender (gelen ince retina dilim hazırlanması...

Bir Amfibi Retina Dilim hazırlanması Fotoreseptörler ve İkinci dereceden nöronlar eş zamanlı tam hücreli Kayıtlar

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Drosophila melanogaster fotoreptörlerinden alınan bütün hücreli kayıtlar, çeşitli koşullar altında kendiliğinden oluşan karanlık yumruları, kuantum darbeleri, ışığa karşı makroskopik tepkileri ve akım-voltaj ilişkilerini ölçebilir. D. melanogaster genetik manipülasyon araçları ile birlikte bu yöntem, her yerde bulunan inositol-lipid sinyal yolunu ve TRP kanalının hedefini incelemeyi mümkün kılar.

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</emPhotoreceptors

Bu videonun amacı yetişkin zebrafish iç kulak organları sağlıklı, bozulmamış saç hücreleri elde etmek ve daha sonra kendi voltaj kapılı kanallar biyofiziksel özelliklerini karakterize yönelik yama klemp çalışmaları için bunları kullanarak prosedürleri göstermektir.

İç Kulak Saç Hücreleri Patch Clamp Kayıtlar İzole Zebrafish gelen

Öğrenin, HEK293 hücrelerinde tam hücreli yama kelepçesi kayıtlarıyla kanalrodopsinlerin klorür seçiciliğini elektrofizyolojik olarak belirlemeyi. Bu yöntem, biyofiziksel kanal aktivitesinin doğrudan okunmasını sağlar.

Channelrhodopsins'teki İyon Seçiciliğinin Elektrofizyolojik Olarak Belirlenmesi için Tam Hücreli Yama Kelepçesi Kayıtları

Daha fazla video keşfet