Channelrhodopsins'teki İyon Seçiciliğinin Elektrofizyolojik Olarak Belirlenmesi için Tam Hücreli Yama Kelepçesi Kayıtları

Bu deneyin genel amacı, yeni ışık kapılı iyon kanallarının klorür seçiciliğini belirlemektir. Bu yöntem, fotoakım genlikleri, kinetik ve iyon seçiciliği gibi channelrhodopsinlerin biyofiziğindeki temel soruları cevaplayabilir. Bu tekniğin ana avantajı, hızlı ve kopyalanması kolay olan biyofiziksel kanal aktivitesinin doğrudan okunmasıdır.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü HEK hücrelerinin hazırlanmasından foto akımların kaydedilmesine kadar deneysel prosedürün her adımının optimize edilmesi gerekir. HEK hücrelerinin tohumlanması ve transeksiyonu Altina Klein tarafından gösterilecektir. Bu işleme başlamak için, katı bileşenleri 100 mililitre hücre içi ve 500 mililitre hücre dışı tamponlu çözeltiler için ayrı beherlerde tartın.

Ve sonra hazırlanan stok çözeltilerinin ilgili miktarını ekleyin. Daha sonra ultra saf su ekleyin ve asitleri ve bazları kullanarak pH'ı dikkatlice ayarlayın. Daha sonra hücre içi ve hücre dışı çözeltiler için glikoz ile ozmolariteyi sırasıyla 290 miliosmol ve 320 miliosmole ayarlayın.

Bu prosedürde, 35 milimetrelik bir Petri kabına yan yana üç adede kadar lizin kaplı cam kapak kayışı yerleştirin. Daha sonra,% 10 FBS ve her tabakta bir mikromolar retinol ile desteklenmiş iki mililitre standart DMEM'de 1.5 kez 10 ila beşinci HEK hücresine tohumlayın. Her bir tabak için hücreleri transfekte etmek için, FBS ve altı mikrolitre transfeksiyon reaktifi olmadan 250 mikrolitre DMEM'de iki mikrogram plazmit DNA'dan oluşan bir çözelti hazırlayın.

15 dakikalık inkübasyondan sonra, çözeltiyi yavaşça hücrelere ekleyin. Ölçümden önce, bir mikropipet çektirme kullanarak bazı düşük dirençli yama pipetlerini çekin ve ateşle parlatın. Pipetleri ölçüm günü boyunca tozsuz bir kapta saklayın.

Kayıtlardan 30 dakika önce, çalışma sıcaklığına kadar ısıtmak için tüm kurulum bileşenlerini açın. Tamponların oda sıcaklığında olduğundan emin olun. Başlamak için, harici tamponun sızmasını önlemek için ölçüm odasını silikonla kapatın.

Ardından hazneye bir lamel yerleştirin ve kapatın. Hücrelerin ayrılmasını önlemek için hazneyi hücre dışı tamponla dikkatlice doldurun. Petri kabını diğer kapak fişleriyle birlikte bir sonraki deney seti için bir kuluçka makinesinde saklayın.

Ardından, hücre görselleştirme için 40X objektifi kullanarak ölçüm odasını mikroskop altına yerleştirin. Daha sonra banyo elektrodunun üzerine bir Burgu köprüsü yerleştirin ve sıvı seviye sensörü ve banyo işleyicisinin perfüzyon çıkışı ile birlikte hazneye yerleştirin. Artık kültür ortamını ve ayrılmış hücreleri çıkarmak için hücre dışı çözeltiyi iki kez bir mililitre taze harici çözelti ile değiştirin.

Hücreleri odak noktasına getirin ve diğer hücrelerden izole edilmesi gereken transfekte edilmiş bir hücre arayın. Ardından, mCherry'yi heyecanlandırmak ve görselleştirmek için üç bantlı bir filtre seti ve turuncu ışık kullanın. Ardından, çekilen pipetlerden birini hücre içi çözelti ile doldurun.

Pipeti birkaç kez çevirerek hava kabarcıklarını çıkarın. Daha sonra pipeti pipet tutucusuna monte edin ve uç tıkanmasını önlemek için biraz pozitif basınç uygulayın. Mikroskop altında yama pipetinin ucunu bulun ve mikromanipülatörü kullanarak hücreye yakın bir şekilde gezinin.

Veri toplama yazılımı içinde, membran testini Banyo modunda başlatın ve bir voltaj adımı uygulayın. Pipet direncinin istenen 1,3 ila 3,0 megaohm aralığında olup olmadığını kontrol edin. Ardından ofset akımlarını sıfırlayın ve amplifikatör üzerindeki pipet ofset düğmesini çevirerek pipet potansiyelini ayarlayın.

Tüm hücre konfigürasyonunda bir yama oluşturmak için, yama pipeti ile hücreye üstten yavaşça yaklaşın ve hücreye dokunmadan hemen önce pozitif basıncı serbest bırakın. Bazen hücreye bağlı konfigürasyon bundan sonra kendini oluşturur. Hücreye yaklaştıktan sonra, zar testini Banyo modundan Yama moduna değiştirin.

Test darbesinin düz bir yanıtını elde etmek için pipet kapasitans dengeleme düğmesini çevirerek pipet kapasitansını telafi edin. Membran testini Hücre moduna geçirin. Ardından, tam hücre onayı elde etmek için kısa negatif basınç darbeleri veya artan güçle negatif basınç uygulayarak sızdırmazlığı tahrip etmeden yamayı yırtın.

İki tam hücre parametresini, hücre kapasitansını ve seri direnci ayarlayarak seri direnç telafisini başlatın. Seri direnç kompanzasyon panelinde, %90'a kadar tahmin ve düzeltmeyi açın, ardından tüm hücre kompanzasyon anahtarını açın ve ideal olarak düz bir test contası yanıtı elde etmek için tüm hücre parametrelerini yinelemeli bir şekilde ayarlayın. Tüm hücre konfigürasyonunu kurduktan sonra, yama pipetinden hücre içi çözeltinin yeterli şekilde değiştirilmesini sağlamak için kayıttan önce en az iki dakika bekleyin.

Farklı tutma potansiyellerinde ışık kaynaklı akımları kaydedin. Daha sonra, hücre dışı tamponu, yamayı tahrip etmeden en az beş kez odadaki düşük klorürle değiştirin ve yeni klorür konsantrasyonunda başka bir akım voltajı ilişkisi kaydedin. Bu şekil, yeşil ışıkla aydınlatma sırasında PsACR1'in hızlı bir şekilde sabit bir akım seviyesine bozunan hızlı bir geçici akıma sahip olduğunu göstermektedir.

Işık kapatıldıktan sonra, foto akımlar milisaniyeler içinde sıfıra düşer. Hücre dışı klorür konsantrasyonunun azaltılması, dışa doğru yönlendirilmiş foto akımları tamamen ortadan kaldırır. Hücre dışı klorür konsantrasyonunun değiştirilmesi, bir akım voltajı grafiğinden çıkarılabilen ters potansiyelin kaymasına neden olur.

Birden fazla ölçümden elde edilen ters potansiyellerin değerlendirilmesi, harici klorür konsantrasyonunun değişmesinin neden olduğu dramatik ters potansiyel kaymasını nicelleştirir. Çarpıcı bir şekilde, ölçülen ters potansiyeller, PsACR1'in yüksek klorür seçiciliğini doğrulayan klorür için hesaplanan Nernst potansiyellerine doğrudan karşılık gelir. Bu videoyu izledikten sonra, channelrhodopsin eksprese eden HEK hücreleri üzerinde ışık kaynaklı foto akımların elektrofizyolojik kayıtlarının nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, tüm prosedür dört gün içinde yapılabilirken, foto akımların kaydı birkaç saat sürer. Bu prosedürü tamamlayıcı olarak, channelrhodopsinlerin yapısal özelliklerini ve hücresel mekanizmalarını daha iyi aydınlatmak için bölgeye yönelik mutajenez ve spektroskopik yöntemler uygulanabilir. Lovardopsin karakterizasyonu ve moleküler mühendisliği, sinirbilimdeki araştırmacıların seçilen nöronların ışıkla uyarılabilirliğini manipüle etmelerinin yolunu açtı.