Nükleotid Eksizyon Onarımında DNA Lezyon Tanınması için Atomik Kuvvet Mikroskopi Araştırmaları

Bu atomik kuvvet mikroskobu deneyinin genel amacı, DNA onarım proteinlerinin DNA'daki hasar bölgeleriyle etkileşimlerini çözmek ve çeşitli protein kompleksleri ile farklı DNA etkileşimlerini ayırt etmektir. Bu yöntem, belirli bir DNA onarım sisteminin DNA'daki hedef lezyonlarının tanınmasını nasıl başardığı gibi DNA onarım alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, DNA lezyonu tanıma sürecinde yer alan farklı kompleks türlerini doğrudan görebilmemiz ve analiz edebilmemizdir.

Prosedürü göstermek, lisans araştırması sırasında bu yaklaşımı kullanan Nicolas Wirth olacaktır. Başlamak için, bir plazmidde tek sarmallı bir DNA boşluğu oluşturarak uygun bir DNA substratı hazırlayın. Boşluğu modifiye edilmiş, tek sarmallı DNA oligonükleotidleri ile doldurun ve son olarak uygun kısıtlama enzimlerini kullanarak plazma DNA'sını doğrusallaştırın.

Bu deneyler için, çift sarmallı DNA substratları yaklaşık 1.000 baz çifti uzunluğundadır ve bir DNA lezyonunun yanı sıra DNA'ya protein yüklemesi için DNA kabarcığı adı verilen eşleşmemiş bir bölge içerir. Ardından, önce 10x Reaksiyon Tamponu ve suyu bir mikro reaksiyon tüpüne pipetleyerek AFM analizi için bir protein DNA örneği hazırlayın. Ardından, incelenen DNA ve proteinleri ekleyin.

Örneğin, burada, DNA örneğinin 100 nanomolar ve bir mikromolar veya ökaryotik nükleotid eksizyon onarım proteinleri XPD ve p44'ün her biri. Ardından, reaksiyonu bir ısı bloğunda 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, numuneyi kısa bir süre aşağı doğru döndürün.

Ardından, numuneyi üzerine yerleştirmek için bir mika substrat hazırlayın. Daha büyük bir şeritten bir santimetreye bir santimetrelik bir mika parçasını kesmek için bir neşter kullanın. Ardından, temiz, düz, anatomik olarak pürüzsüz bir alt tabaka yüzeyi ortaya çıkarmak için mika'nın üst katmanlarını çıkarmak için bir parça yapışkan bant kullanın.

Protein DNA örneğini AFM biriktirme tamponunda elli ila yüz kat genişletin ve seyreltilmiş numunenin 20 mikrolitresini hemen mika yüzeyine bırakın. Seyreltme faktörü numune konsantrasyonuna bağlıdır. Numuneyi mika yüzeyine bıraktıktan hemen sonra, numuneyi birkaç mililitre filtrelenmiş, deiyonize su ile üç ila dört kez durulayın ve fazla sıvıyı kurulayın.

Numuneyi kurutmak için hafif bir nitrojen akışı kullanın. Son olarak, numuneyi kenarlarından bir mikroskop lamına sabitlemek için yapışkan bant kullanın. Numuneyi AFM aşamasının ortasına yerleştirin ve mikroskop lamını sahneye sabitlemek için manyetik pedler kullanın.

Ardından, AFM ucunu uç tutucuya yerleştirin. Vidayı parmak sıkılığında olacak şekilde sıkarak ucu bir kelepçe altında tutucuya sabitleyin. Sabitlendikten sonra, uç tutucuyu AFM ölçüm kafasına girin.

Numuneyi merkezi bir konumda hareket ettirmek için konumlandırma vidalarını kullanın. AFM ölçüm başlığını numunenin üzerine yerleştirin ve başlığın bacakları sahne girintilerinin içinde olacak şekilde sabit bir şekilde durduğundan emin olun. Ardından, optimum sinyal gücü için AFM lazerini konsolun arkasına hizalayın.

Lazeri kaba bir şekilde konumlandırmak için AFM video penceresindeki yansıma sinyalini izleyin. Bu AFM modelinde, AFM lazerin X ve Y konumlarını ayarlamak ve onu konsolun ucuna merkezi olarak yönlendirmek için AFM ölçüm kafasının sağ tarafındaki ve arkasındaki tekerlekleri çevirin. Ardından, iki tekerlekle lazer konumuna ince ayar yaparak dedektör toplam sinyalini optimize edin.

Dedektör dizisinin üst ve alt diyotlarından gelen farklı sinyali sıfırlayarak AFM lazer yansımasını dedektör merkezine yönlendirin. Bu adım için, bu AFM modeli için ölçüm kafasının sol tarafındaki vidayı çevirin. Ardından, yazılımdaki ana panel ayar penceresine girerek konsol kalma frekansını belirleyin.

Konsol salınımını çalıştıran Piezo için bir voltluk girişe karşılık gelen bir genlik seçin ve ardından salınım frekansını konut frekansından biraz daha düşük negatif %5'e ayarlayın. Şimdi bir otomatik frekans ayarı yapın ve salınımın fazını sıfırlayın. Sapmayı önlemek için görüntülemeye başlamadan önce sistemi yaklaşık bir saat termal dengeye ulaşacak şekilde bırakın.

Görüntülemeye başlamaya hazır olduğunuzda, yazılım ana panelinde bir koruma ayar noktası ayarlayın ve tak'ı seçerek ucu numune yüzeyine yaklaştırmaya hazırlanın. Koruyucu ayara veya ayar noktasına ulaşılana kadar AFM kafasının ön tekerleğini manuel olarak indirin. Ardından, Z sensörü sinyali tamamen sola doğru uzayana kadar ön tekerleği dikkatlice daha fazla indirin.

Titreşim salınım tablosunu etkinleştirin ve akustik izolasyon muhafazasını kapatın. Ardından, AFM ucunu numuneyle ince bir şekilde birleştirmek için hamster çarkını kullanarak AFM yazılımındaki ayar noktasını düşürün. İtici rejimde kılavuz çekme modu görüntülemesi yapmak için, faz sinyali serbest seviye fazından biraz daha düşük olana kadar ayar noktasını düşürün.

Ardından, örneği taramaya başlayın. Sırasıyla 2, 048 veya 4.096 piksel çözünürlüklerine sahip dört mikrometreye dört mikrometre veya sekiz mikrometreye sekiz mikrometre karelik görüntü yüzey alanlarında saniyede 2,5 mikrometre tarama hızını kullanın; ve Taraması Yap düğmesine basın. AFM yazılımındaki görüntülerin doğrudan görsel incelemesi ile ilgili protein DNA komplekslerini önceden seçin.

XPD numuneleri için olası kompleksler, XPD p44 DNA'nın yanı sıra XPD ve p44'ün farklı moleküler kütleleri nedeniyle belirgin şekilde farklı boyutlara sahip XPD DNA ve p44 DNA'yı içerir. Kesit penceresi imleçleri ile protein tepe bölümlerinin yüksekliğini ve çapını ölçmek için analiz penceresindeki kesit aracını kullanarak DNA üzerindeki tek tek protein zirvelerinin hacimlerini ölçün. Karmaşık türü doğrulamak için basit matematiksel modeller kullanarak tepe noktalarının hacmini belirlemek için bu değerleri kullanın.

Son olarak, AFM sisteminizi, bu hacimleri proteinlerin ve protein komplekslerinin yaklaşık moleküler ağırlıklarına çevirmek için bilinen moleküler ağırlıklara sahip bir dizi proteinle kalibre edin. DNA fragmanı uzunlukları, protein komplekslerinin DNA üzerindeki konumları ve hedef bölge özgüllükleri veya DNA bandı açıları gibi ek özellikleri belirlemek için, ekteki metin protokolüne bakın. Burada, farklı boyutlarına göre ayırt edilebilen üç farklı türde DNA'ya bağlı komplekse sahip bir AFM görüntüsü gösterilmektedir.

Birinci sınıf kompleksler sadece helikaz aktive edici ko-faktör p44 ile tutarlıdır, ikinci sınıf kompleksler sadece XPD proteininden oluşur ve üçüncü sınıf kompleksler hem XPD hem de p44'ten oluşur, çünkü XPD ile lejyon tanıma, helikaz aktivitesinin p44 tarafından aktivasyonunu gerektirir ve sadece üçüncü sınıf kompleksler lezyon tanıma gösterir. Farklı lezyon tanıma stratejilerini tanımlamak için, DNA substratları üzerindeki proteinlerin konumları, prokaryotik ve ökaryotik NER helikazları için kırmızı ile gösterilen bir DNA lezyonundan beş asal veya üç asal yönde bir DNA kabarcığında protein yüklemesi için ölçüldü. Protein pozisyon dağılımlarında, DNA lezyon pozisyonunda gelişmiş bağlanma nedeniyle DNA lezyonu tanıma bir tepe olarak görülebilir.

Prokaryotik NER helikaz UVRB ve ökaryotik muadili XPD, farklı DNA zinciri tercihlerini gösteren farklı CPD lezyon tanıma stratejileri gösterir. Spesifik olarak, CPD lezyonları UVRB ile translokasyonlu iplikçik üzerinde tanınır, ancak tercihen karşıt, translokasyonsuz iplikçikte XPD ile tanınır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu yöntem analiz dahil birkaç saat veya gün içinde yapılabilir.

AFM görüntülerindeki özellikleri yorumlayabilmek ve biyolojik sisteme ve ele almak istediğiniz soruya bağlı olarak DNA substratını dikkatli bir şekilde tasarlamak için oldukça saf protein ve DNA örnekleriyle çalışmak önemlidir. Ek olarak, jel elektroforez alanı, elektromobilite kayması veya DNA insizyon testleri gibi topluluk yöntemleri, elbette, bu AFM deneyleri için oldukça tamamlayıcıdır; ve bu yöntemler, DNA bağlanma afiniteleri veya DNA lezyonu eksizyon aktiviteleri gibi ek soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, protein DNA komplekslerini doğrudan görselleştirmek için nispeten hızlı ve basit bir yaklaşımdır ve bu kompleksler bize biyolojik bir sistemde meydana gelen süreçlerin iyi bir resmini verir.

Tabii ki, bu sadece DNA onarım süreçlerini anlamada yararlı değil, aynı zamanda diğer protein DNA sistemlerine de uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, en sevdiğiniz protein DNA sisteminde bir numuneyi nasıl hazırlayacağınız, AFM ile nasıl görüntüleyeceğiniz ve verilerinizin yorumlanması için yararlı parametrelerin nasıl çıkarılacağı konusunda oldukça iyi bir fikre sahip olmalısınız.