Kütle Spektrometre ve lüminojenik tabanlı Yaklaşımlar Faz I Metabolik Yetkinlik ait Characterize

Bu prosedürün amacı, kültürlenmiş hücrelerde sitokrom P450'lerin veya CYP'lerin aktivitesini belirlemektir. CYP'ler, ilaçların ve toksikanların metabolizmasında yer alan temel enzimlerdir ve ekspresyonları in vitro ortamda genellikle korunmaz. Hücreler in vitro ortamda kültürlendiğinde, CYP enzimlerinin normal ekspresyonu sıklıkla kaybolur.

Bu nedenle, birçok in vitro model, ilaçların ve toksikanların metabolizmasının anlaşılmasındaki geçerliliği açısından potansiyel olarak sınırlayıcıdır. Bu yöntemin temel avantajı, kültürlenmiş hücrelerde CYP aktivitesinin değerlendirilmesindeki basitliğidir. Prob substratlar ve inhibitörler kullanılarak, kütle spektrometrisi de dahil olmak üzere farklı kantifikasyon platformları sunulmaktadır.

Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı şekilde hücrelerin bulunduğu kriyojenik tüpleri temin edin. Sunulan protokolde örnek olarak bir hepatik hücre hattı kullanılmıştır. Steril koşullar altında çalışırken, fazla basıncı tahliye etmek için kriyojenik tüpü dikkatlice açın, ardından kriyojenik tüpün içeriğini, 37 °C'de önceden ısıtılmış 9 mL Williams'E medyum ile doldurulmuş 10 mL'lik bir tüpe pipetleyin.

Çözeltiyi oda sıcaklığında 400 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı attıktan sonra hücreleri, 37 °C'ye önceden ısıtılmış ve glutamin eklenmiş beş mililitre tescilli çözme ortamında yeniden süspande edin. Metin protokolünde açıklandığı şekilde canlı hücreleri saydıktan sonra, hücreleri 24 kuyucuklu kolajen kaplı bir plakaya, kuyucuk başına 60.000 canlı hücre yoğunluğunda ve 0,5 mililitre nihai çözme ortamı hacminde ekleyin.

Kültürde birkaç gün geçtikten sonra, hücreler subkonflüen trabeküler bir yapı oluşturur. Optimum metabolik aktivite tipik olarak yedinci ve 10. günler arasında gözlemlenir ve dördüncü günde en düşük seviyededir. Diferansiye hava yolu epitelyumu kültürlerini hazırlamak için, bir insert üzerinde hava-sıvı arayüzünde büyütülmüş, ticari olarak temin edilebilen tam diferansiye primer hava yolu epitelyumu kullanın.

Steril cımbız kullanarak, hücre ekini agaroz matrisinden nazikçe ayırın ve 700 µL tescilli kültür ortamı ile önceden doldurulmuş yeni plakaya aktarın. Transepitelyal direnç veya silya vuruş frekansı gibi metin protokolünde referans verilen yöntemleri kullanarak havayolu dokusunun bütünlüğünü değerlendirin. Deneyden önce, havayolu hücreleri için iki seri hücre eki ve hepatik hücreler için en az üç tekerrürlü kuyu hazırlayın.

Bir seriyi inhibisyon deneyi için, diğerini ise yalnızca metabolik prob için kullanın. Medya boş kontrolü olarak üçüncü bir hücre serisi hazırlayın. Deney günü, hücre kültürü medyasını 450 microliter taze medya ile değiştirin.

İnhibisyon deneyi için hazırlanan hücre serisine 10x CYP inhibitörü içeren 50 µL besiyeri ekleyin ve 30 dakika ön inkübasyon yapın. Ardından, inhibisyon serisindeki besiyerini 450 µL taze besiyeri ile değiştirin ve hem 10x CYP inhibitörü hem de 10x prob substratı içeren 50 µL besiyeri ekleyin. Diğer hücrelere 10x prob substratı içeren 50 µL besiyeri ekleyin, ardından boş hücre kontrollerine besiyerinde seyreltilmiş eşdeğer miktarda taşıyıcı ekleyin.

Birinci zaman noktası olan sıfır arka plan kontrolü için hücreleri sıfır ila beş dakika inkübe ettikten sonra, besiyerini ayrı etiketlenmiş tüplere toplayın ve gelecekteki işlemler için dondurun. Ardından, ikinci zaman noktasındaki hücreleri hücre inkübatöründe 16 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon süresinin sonunda, metabolik ürünün miktar tayini için besiyerini aynı yöntemle toplayın.

1,5 mililitrelik bir mikrotüpe 250 mikrolitre inkübasyon medyumu aktarın ve final konsantrasyonu 100 nanomolar olacak şekilde 4-methylumbelliferone iç standart stok çözeltisi ekleyin. Bir molar HCl'yi, her seferinde bir mikrolitre ekleyerek medyumun pH değerini 4,5 ile 5,0 arasına ayarlayın. İki ila 10 mikrolitre medyumu bir pH şeridine damlatarak pH değerini doğrulayın, ardından Helix pamatia kaynaklı 150 ünite betaglucuronidase arylsulfatase ekleyin.

37 °C'de bir saat inkübe ettikten sonra, 250 µL soğuk metanol ekleyerek reaksiyonu durdurun. Solventi 45 °C'de vakum santrifüj kullanarak uçurun. Numuneleri 500 µL %30 asetonitril-su çözeltisi ile yeniden çözün.

Kütle spektrometrisi tabanlı kantifikasyon gerçekleştirmek için, her bir seri dilüsyon standardından 250 µL'yi, UPLC-MS otomatik örnekleyiciye enjekte edilmek üzere kehribar renkli ultra performans sıvı kromatografisi cam flakonuna ekleyin. Ayrıca test örneklerini de kehribar renkli UPLC flakonlarına ekleyin ve UPLC otomatik örnekleyiciye yerleştirin. Tüm flakonları randomize ettikten sonra, kantifiye edilecek spesifik proba bağlı olarak, metin protokolünde detaylandırılan ayarları kullanarak UPLC-MS'i çalıştırın.

Elde edilen sentetik standart ve iç standarttan kalibrasyon eğrisi oluşturmak için kütle spektrometresi kantitasyon araçlarındaki Quantitate, Build Quantitation Method aracını kullanın, ardından kantite edilecek örnek grubunu ve örnekleri seçmek ve kantitasyon yöntemini yürütmek için Quantitation Wizard'ı kullanın. CYP1A1 ve CYP1B1'i indüklemek için metin protokolünde bulunan plaka düzenini kullanın. İndüksiyon için belirlenen hücreleri, ortamda 10 nanomolar TCDD nihai konsantrasyonu ile 72 saat boyunca inkübe edin.

Bu sürenin ardından besiyerini uzaklaştırın, kuyucukları üç kez PBS ile durulayın ve bir miktar taze besiyeri ekleyin. Hücreleri lüminojenik rapor probu ile inkübe etmeden önce, indüklenmiş hücrelerin belirlenen bir alt grubunu, besiyeri içerisinde CYP1A1, CYP1B1 inhibitörü ile 30 dakika boyunca ön inkübasyona tabi tutun. İndüklenmemiş, indüklenmiş ve indüklenmiş artı inhibitörlü hücrelere, final konsantrasyonu 50 micromolar olacak şekilde lüminojenik prob luciferin 6'chloroethyl ether ekleyin.

Dört saat boyunca inkübe edin ve ardından 25 µL kültür ortamını beyaz, opak bir 96 kuyucuklu plakaya aktarıp üzerine üretici tarafından sağlanan 25 µL lusiferin tespit reaktifi ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe ettikten sonra, plakayı hemen bir lüminometre kullanarak okuyun. CYP1A1 ve CYP1B1 tarafından katalize edilen lusiferin 6'kloroetil eterin dealkilasyonu ile üretilen göreceli lüminesans burada sunulmuştur.

Örnek, TCDD indüksiyonu olmadığında herhangi bir enzim aktivitesi göstermemektedir. TCDD indüksiyonunu takiben, hem hepatik hem de solunum hücre tiplerinde CYP1A1, CYP1B1 aktivitesi gözlemlenmektedir. Son olarak, CYP1A1, CYP1B1 inhibitörü alfa-naftoflavon eklenmesi CYP aktivitesini azaltmakta veya ortadan kaldırmaktadır.

Karaciğer ve havayolu hücre tiplerindeki CYP2A6 ve 2A13 aktivitesini değerlendirmek için, enzimin kumarini hidroksilasyonu yoluyla ürettiği 7-hidroksikumarin miktarı UPLC LC-MS kullanılarak ölçülmüştür. Kumarin ile sıfır dakikalık inkübasyonda yalnızca arka plan sinyali saptanmıştır. 16 saat sonra, her iki hücre tipinde de kumarin hidroksilasyonu ile birlikte 7-hidroksikumarin oluşumu gözlemlenmiştir.

Son olarak, CYP2A, 2A13 inhibitörünün eklenmesi 7-hidroksikumarin oluşumunu engeller. Bu tekniğin prob inkübasyonu ve kantifikasyon bölümleri bir kez kavrandıktan sonra, çoğu durumda birkaç saatten bir güne kadar olan bir sürede tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, gerektiğinde inhibisyon ve/veya indüksiyon kullanarak enzimin özgüllüğünü doğrulayarak, farklı hücre tipleriyle çeşitli faz bir metabolizma analizlerinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu prosedürü uygularken, farklı hücre tiplerinin daha uzun inkübasyon süreleri gerektirebileceğini ve pozitif kontrol olarak kullanılabilecek bir hücre tipinin dahil edilmesinin esas olduğunu unutmamak önemlidir. TCDD ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceği unutulmamalıdır ve bu prosedür gerçekleştirilirken tam kişisel koruyucu ekipman gibi önlemler her zaman alınmalıdır. Bu tekniğin etkileri, yeni ilaçların preklinik değerlendirmesi ve tüketici ürünlerinde kullanılan kimyasalların ve bileşenlerin risk değerlendirmeleri için uygun in vitro modellerin kullanımına kadar uzanmaktadır.