Name: Kütle Spektrometre ve lüminojenik tabanlı Yaklaşımlar Faz I Metabolik Yetkinlik ait Characterize İn Vitro Hücre Kültürleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Öğrenin, kütle spektrometrisi ve lüminesans tabanlı yöntemlerle in vitro hücre kültürlerinde sitokrom P450 aktivitesini değerlendirmeyi. Bu teknik, ilaç metabolizması ve toksikoloji araştırmaları için güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, hava yolu hücrelerini ve hepatik hücre mikrografyalarını sağladıkları için Epithelix Sarl ve Biopredic International'a ve deneysel prosedürü gösteren şekil için Neil Smith'e teşekkür eder.

<ol><li>Garcia-Canton, C., Minet, E. Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarcia-Canton%2C+C+%22Encyclopedia+of+Drug+Metabolism+and+Interactions%22">Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions</a>. , 1-31 (2016).</li>
<li>Croom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+xenobiotics+of+human+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mol.+Biol.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Metabolism of xenobiotics of human environments.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).</li>
<li>Lewis, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((57+varieties%3A+the+human+cytochromes+P450%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">57 varieties: the human cytochromes P450.</a> Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).</li>
<li>Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+drug+metabolizing+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pap.+Med.+Fac.+Univ+Palacky%22%5BJournal%5D)">Phase II drug metabolizing enzymes.</a> Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, Olomouc. Czech. Repub. 103-116 (2010).</li>
<li>Dekant, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+biotransformation+and+bioactivation+in+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22EXS%22%5BJournal%5D)">The role of biotransformation and bioactivation in toxicity.</a> EXS. 99, 57-86 (2009).</li>
<li>Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%3A+a+tool+for+in+vitro+drug+metabolism+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies.</a> Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).</li>
<li>Guillouzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+hepatoma+HepaRG+cells%3A+a+highly+differentiated+model+for+studies+of+liver+metabolism+and+toxicity+of+xenobiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol.+Interact%22%5BJournal%5D)">The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics.</a> Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).</li>
<li>Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+in+vitro+reconstituted+3D+human+airway+epithelia+%28MucilAir%29+to+assess+respiratory+sensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers.</a> Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).</li>
<li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li>
<li>Kuehn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+assessment+of+repeated+exposure+of+organotypic+3D+bronchial+and+nasal+tissue+culture+models+to+whole+cigarette+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke.</a> J. Vis. Exp. , (2015).</li>
<li>Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+coumarin+7-hydroxylase+activity+in+human+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).</li>
<li>Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+inhibition+by+fluvoxamine+of+phenacetin+O-deethylation+in+V79+cells+expressing+human+CYP1A2%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2.</a> Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).</li>
<li>Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+high-performance+liquid+chromatographic+assay+for+coumarin+7-hydroxylation+and+7-ethoxycoumarin+O-deethylation+by+human+liver+cytochrome+P450+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B.+Biomed.+Sci.+Appl%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).</li>
<li>Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+role+of+CYP2B6+in+human+drug+metabolism%3A+substrates+and+inhibitors+in+vitro%2C+in+vivo+and+in+silico%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico.</a> Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).</li>
<li>Kartha, J. S., Yost, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism-based+inactivation+of+lung-selective+cytochrome+P450+CYP2F+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab.+Dispos%22%5BJournal%5D)">Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes.</a> Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).</li>
<li>Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzene+metabolism+in+human+lung+cell+lines+BEAS-2B+and+A549+and+cells+overexpressing+CYP2F1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Mol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1.</a> J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).</li>
<li>Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-dose+disulfiram+inhibition+of+chlorzoxazone+metabolism%3A+a+clinical+probe+for+P450+2E1%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).</li>
<li>Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolysis+of+steroid+glucuronides+with+beta-glucuronidase+preparations+from+bovine+liver%2C+Helix+pomatia%2C+and+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli.</a> Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).</li>
<li>Guide to achieving reliable quantitative LC-MS measurements. RSC Analytical Methods Committee. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/Our%20science/NMI%20landing%20page/Publications%20and%20resources/Guides/AMC_LCMS_Guide.pdf">http://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/Our%20science/NMI%20landing%20page/Publications%20and%20resources/Guides/AMC_LCMS_Guide.pdf</a> (2013).</li>
<li>Baxter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+omics+analyses%2C+and+metabolic+enzyme+activity+assays+demonstrate+maintenance+of+key+mucociliary+characteristics+in+long+term+cultures+of+reconstituted+human+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia.</a> Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).</li>
<li>Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competency+of+different+cell+models+to+predict+human+hepatotoxic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug+Metab.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs.</a> Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+metabolism-dependent+drug+efficacy+and+toxicity+on+a+multilayer+organs-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip.</a> Integr. Biol. 8, Camb. 1022-1029 (2016).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25947886">Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells.</a> Biosci. Rep. , (2015).</li>
</ol>

AB ve EM bu el yazması yazılmıştır anda British American Tobacco çalışanları edildi. Bu yazıda anlatılan çalışma British American Tobacco tarafından finanse edildi ve bu video yazı için yayın ücreti British American Tobacco tarafından ödendi.

Şu anda, bir çok standart toksikolojik test sistemleri, normal insan metabolizmasının 1 temsilcisi değildir işlenmiş bakteri, hücre soylarını ya da embriyonik hücreleri kullanır. Bu kimyasal veya tıp potansiyel toksik aktivitesinin yanlış tahminler yol açabilir. Bu tür bir çip üzerinde 3D hücre kültürleri ve organ olarak vitro modellerde, yenilikçi, daha insan dokuları 21, 22, 23, normal morfoloji ve metabolik aktivite çoğaltmak için bir girişimde geliştirilmektedir. Metabolik yetkinlik modelleri iyi toksikolojik değerlendirme ve ilaç biyolojik dönüşüm çalışmaları için uygun olan deşifre kullanılabilen bir kriterdir. Bu yazıda ana hatlarıyla protokol canlı hücreler kullanılarak CYP enzimlerinin aktivitesini ölçmek için tasarlanmıştır. Esnek ve 2D veya 3D KÜLTÜR farklı hücre sistemleri için kullanılabilires ve lüminojenik Probe veya kütle spektrometresi tabanlı yaklaşım kullanma seçeneğiniz mevcuttur. Her iki yöntem de malzeme nanogram miktarlarda algılar ve sadece çok oyuklu formatta yetiştirilen hücreler az sayıda gerektirecek kadar hassastır. Ayrıca küresel, uygulanabilir veya hücreler karmaşık matrisler içinde büyütülmüştür. prob substratın seçimi tabii ki protokol önemli bir unsurudur. Analizin özgüllüğü seçici CYP inhibitörü kullanılması ile elde edilebilir CYP enzim ve güvence başka bir katman seçici olan prob dayanır. alt-tabakalar ve bu yazıda belirtilen inhibitörleri sadece birkaç örnektir, fakat diğerleri literatürde bulunabilir. Enzim, düşük bir seviyede ifade edilen bağlı olabilir negatif CYP aktivitesi sonucunda yeni bir hücre tipi ile çalışan birden çok uzun kuluçka süresi dikkate alınması önemlidir. Bir pozitif kontrol olarak kullanılan bir hücre tipinin eklenmesi, söz konusu a sağlamak için tavsiye edilirNegatif sonuç teknik bir sorun ve herhangi sorun gidermeye yardımcı ile bağlantılı değildir. Primer hepatik hücreler metabolik olarak yeterlidir ve süspansiyon içinde örneğin birincil hepatositler için, kontrol olarak kullanılabilir kullanımı çok kolay olan fakat bunların canlılığı zaman içinde sınırlıdır. Karaciğer hücre çizgileri bu protokolde tarif edildiği gibi kullanımı nispeten kolaydır olası alternatifleri vardır, ama bazı metabolik aktivite 6, 21 açısından, diğerlerinden daha iyi olduğu. Deney toplam protein miktarı olmadıkça, yıkıcı olmayan, olduğu için, uzunlamasına çalışmalarda 20, zaman içinde CYP aktivitesi takip etmek mümkündür. Bazı hücreler kültürde zamanla değişken CYP aktivitesini olacak, çünkü bu önemli bir noktadır. Negatif bir sonuç, in vitro olarak farklılaşma ya da farklılaşmanın giderilmesi ile birleşmeye eksikliği, ilerleme ile ilişkili olabilir. Bu durumda, bu yaklaşım, yarı kantitatif bir olduğuVeriler, her hücre kültürü içinde protein toplam miktarına göre normalize değildir çünkü ettik. TCDD için olduğu gibi doku üzerinde toksik bir etkiye sahip olabilir probları, inhibitörleri, veya teşvik edicilere maruz kalma gibi CYP aktivitesinin ölçülmesi sonra doku yeniden her zaman mümkün değildir ya da önerilmez. gibi mikrozomlar gibi hücre fraksiyonları, aynı zamanda, belirli bir hücre tipinin, CYP aktivitesinin karakterize edilmesi için kullanılabilir. Mikrozomal preparasyonlar, bununla birlikte, hücre malzemesi, uygun eş-faktörlerin eklenmesi bir çok ihtiyaç ve enzimler aktif kalmasını sağlamak için tampon. canlı hücreleri kullanarak zor mikrozom hazırlık aşamasını ortadan kaldırır ve tamponlar ve ko-faktörler en çok hangi çalışma dışarı. Genel bir öneri olarak, ayrıca, enzimatik aktivitesini aynı olduğunu doğrulamak için, hücre kültürlerinde CYP&#39;ler ekspresyon profilini karakterize etmek için en iyi yöntemdir. doğrulama Bu ek seviye metabolik sondalar Enti olmadığını verilmiş tavsiye edilirTek bir CYP özgü bel ve ölçülen metabolik aktivitesi, ilgili enzim ekspresyonu ile eşleştirilir artan bir güven vermektedir. CYP zar proteinlerini olduğu bu nedenle nicel RT-PCR, bu enzimleri 20 profil tercih edilen bir yaklaşım olmuştur, Western blotlar için hazırlamak için nispeten zordur. Protokol, tek önemli bir şekilde de olsa, metabolik enzimlerin bir ailesini temsil eder deney CYP enzim aktivitesi için bir yöntem açıklanır dikkat etmek önemlidir. Bir kütle spektrometresi yaklaşımın esnekliği prob substratlar diğer metabolik dönüşümler için satın alma yöntemlerinin geliştirilmesini sağlar. Bununla birlikte, bu bir anda geliştirilecek ve şu anda bilinen daha az spesifik problar ve diğer metabolik enzim ailesi için seçici inhibitörler vardır. Bu boşluk, in vitro hücre sistemlerin t metabolik yeterlilik kapsamlı bir değerlendirme sağlamak için ele alınmalıdırMS.

Ksenobiyotik metabolizma vücuda yabancı kimyasal atılımını 1 kolaylaştırmak için hidrofilik grupların ve bunların konjugatları eklenmesi ile modifiye olan süreçtir. Tipik olarak ksenobiyotiklerin metabolizma bir ya da birden fazla hidroksil grubu 1, 2 ilavesi ile bir oksidasyon çoğunlukla oluşan Faz iki aşamalı bir işlemdir. Örneğin glukuronid veya bir sülfat kısmı 1, 2 gibi bir hidrofobik konjugat için alıcılar olarak Faz II, hidroksil grupları kullanılır. bir alıcı grup zaten molekül üzerinde mevcut ise, konjugasyon adım, bağımsız Faz I metabolizma olabilir. Her bir reaksiyon kimyasal alt tabakalar 3 belirli bir enzimin grubu, örneğin, hidroksilasyon katalize CYP (sitokrom P450), (Şekil 1) ve dealkilasyon ile gerçekleştirilir. ConjugatioN sulfotransferazlar ile katalize edilir, UDP-Glukuronosiltransferazı (Şekil 1), glutation-S-transferaz ve N-asetiltransferaz 4. Her bir doku ve organ bu proteinlerin en ifade karaciğer ile, belirli bir metabolik enzim sentezleme profiline sahip olacaktır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig1.jpg" /> Şekil 1: Faz I ve kumarin için Faz II Metabolizmasının örneği. CYP2A6 / kumarin 7-hidroksilasyonu katalize CYP2A13. 7-hidroksikumarin UGT1A6 ve UGT1A9 yüksek etkinlik gösteren, faz II enzimleri UGTs bir glukuronid parçasına konjuge olur. ksenobiotiklerin metabolizmasını anlamak iki nedenden dolayı ilaç güvenliğinin değerlendirilmesinde ve kimyasal risk değerlendirmesi için önemlidir: reaksiyon kinetiği bir uyuşturucu veya kimyasal aktif veya inaktif formu b vücutta ne kadar süre yeni belirleyecekefore boşaltım; ve ana bileşiğin metabolik enzimler tarafından daha reaktif olmayan ve toksik türler için değiştirilebilir. Aynı zamanda &quot;biyoaktivasyon&quot; olarak bilinen bu tür reaksiyonlar çoğunlukla, aynı zamanda, faz II konjugasyon 5 ile nadir durumlarda enzimler CYP faz ile tahrik edilmektedir. Buna göre, doğru bir ilaç ya da bir kimyasal ile bağlantılı risk tahmin etmek için bir in vitro modelinin özelliği, hücre sistemine bağlı oksijen yetkinlik oldukça bağımlıdır. Hastalıklı dokulardan ya da normal hücrelerin transformasyonu türetilmiş hücre çizgileri genelde bir parçası değilse kökenli 6 bunların dokunun metabolik enzim profili temsil tüm kaybeder. Normal metabolik enzim profili bakımı (en azından kısa süreli kültürlerde), birincil hücre kültürleri daha iyi görünür ve doku onun 3 boyutlu yapısını 1 muhafaza sağlayan bir matris içinde kültürlenir ise daha artırıldı. Bu nedenle, Charbir in vitro hücre sistemine bağlı oksijen yeterliliğin acterization hücre modeli kimyasal güvenlik değerlendirme yapmak için uygun olan ilgili bir karar kılavuz önemli bir ön adımdır. Bu yazıda bir karaciğer hücre çizgisi 7 ve 3D primer akciğer hücre kültürleri 8 ile uygulama örnekleri ile in vitro aktivite ve Faz I CYP enzimlerinin ekspresyonunu profil bir protokol mevcut. CYP özel alt-tabakalar, bunların metabolik ürünleri ve önleyici kontrol kütle spectrometry- ve lüminojenik tabanlı miktar yöntemler ile birlikte tarif edilmiştir. Bazı CYP uyarılabilir ve diğerleri kurucu olduğu için, örnek aynı zamanda bu iki senaryo için verilecektir.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Reaktif & Hücreler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 &mu; m şırınga filtresi</td><td>Whatman</td><td>UN203NPEORG</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>4-metilumbelliferon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>5-fenil pentin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CD5001437</td><td></td></tr><tr><td>6-hidroksibupropion</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3167</td><td></td></tr><tr><td>6-hidroksiklorzoksazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UC148</td><td></td></tr><tr><td>7-etoksikumarin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>195642</td><td></td></tr><tr><td>7-hidroksikumarin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H24003</td><td></td></tr><tr><td>8-metoksipssoralen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3501</td><td></td></tr><tr><td>asetik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>asetonitril</td><td>Fisher A</td><td>/ 0626/17</td><td></td></tr> <tr><td>& alfa; -naftoflavon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N5757</td><td></td></tr><tr><td>BCA kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>b-glukuronidaz / arilsülfataz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0876</td><td></td></tr><tr><td>Bupropion</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B102</td><td></td></tr><tr><td>Karbamazepin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4024</td><td></td></tr><tr><td>klorzoksazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4397</td><td></td></tr><tr><td>kollajen</td><td>Hücre Sistemleri</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>kumarin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4261</td><td></td></tr><tr><td>disülfiram</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86720</td><td></td></tr><tr><td>fluvoksamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2802</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (Glutamin takviyesi)</td> <td>Fisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG metabolizma takviyesi</td><td>Merck</td><td>MMAD621</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG çözülme medya takviyesi</td><td>Merck</td><td>MMADD671</td> HepaRG Merck MMHPR116 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luciferin-CEE</td><td>Promega</td><td>V8751</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/17</td><td></td></tr><tr><td>MucilAir hava yolu hücreleri</td><td>Epithelix</td><td>EP01</td><td></td></tr><tr><td>MucilAir hava yolu hücreleri bakım medyası</td><td>Epithelix</td><td>EP04MM</td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex 2.6 & mu; m, PFP 100A</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4477-AN</td><td></td></tr><tr><td>TCDD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48599</td><td></td></tr><tr><td>thioTEPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6069</td><td></td></tr><tr><td>Sular Akaat UPLC HSS T3 1.8 & mikro; m 2.1 x 50 mm</td><td>Sular</td><td>86003538</td><td></td></tr><tr><td>Williams' E media</td><td>Fisher</td><td>17704-024</td><td></td></tr> <tr><td>Name</td> <td>Company<</td><td>strong>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Waters</td><td>Acquity</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS</td><td>Sciex&nbsp;</td><td>ABI Sciex 4000</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS yazılımı</td><td>Sciex&nbsp;</td><td>Analist 1.4.2</td><td></td></tr><tr><td>luminometre</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td>spektrofotometre</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td>hücre sayacı</td><td>Beckman Coulter</td><td>Vi-Cell XR</td><td></td></tr><tr><td>döner buharlaştırıcı</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf-5301</td><td></td></tr></tbody></table>

kütle spektrometre ve lüminojenik tabanlı yaklaşımlar faz i metabolik yetkinlik ait characterize<em&gt; İn vitro</em&gt; hücre kültürleri

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Ksenobiyotik metabolize eden enzimlerin çözünürlüğü arttırmak ve salgılanmasını kolaylaştırmak fonksiyonel gruplar ilave etmek suretiyle ilaç ve toksik biyotransformasyonu önemli bir işlev görür. Bazı durumlarda, bu yapısal değişiklikler yeni toksik ürünlerin oluşumuna yol açar. hayvanlar üzerinde test azaltmak amacıyla, kimyasal risk metabolik olarak yetkin hücreleri kullanılarak değerlendirilebilir. Metabolik enzimlerin ifadesi, buna rağmen, nitro, birincil kültür sistemlerinde bir çok zaman içinde kararlı değildir ve çoğu zaman hücre çizgilerinde kısmi veya mevcut değildir. Bu nedenle, in vitro ilaç, katkı maddeleri, ve çevre kirliliği yaratanlar metabolizma çalışma ideal metabolik aktivite ile karakterize edilmiştir hücre sistemlerinde yürütülmelidir. Biz UPLC kütle spektrometresi ile ölçülebilir kimyasal probları ve metabolik ürünlerini kullanarak 2B hücre hatları ve primer 3D kültürlerinde metabolik enzimler sınıfının aktivitesini (insan Faz I) ölçmek için, bir yaklaşım açıklar veluminometri. yöntem hücre kuşakları ve çeşitli dokulardan elde edilen birincil hücreler metabolik aktiviteyi test etmek için uygulanabilir.

Üç farklı vericiden (hava yolu M360, M370, M417) ve karaciğer hücre çizgisi (Hep hattı) &#39;, hava yolu hücre kültürlerinde iki CYP&#39;ler çiftleri (CYP1A1 / 1B1 ve CYP2A6 / 2A13) için ölçülen metabolik aktivite örnekleri Şekil 6&#39;da gösterilmiştir 20. CYP aktivitesi luminometri ile ölçüldüğü Şekil 6A, hava yolu hücreleri Luc-CEE (luciferase 6&#39;-kloroetil eter) (3 donör) ile TCDD uyandırılmadan karaciğer hücrelerinin CYP1A1 / 1B1 O-dealkilasyon aktivitesi ile üretilen göreli lüminesans gösterir. CYP1A1 / 1B1 yüksek oranda indüklenebilen enzimlerdir ve tipik olarak çoğu dokuda bir kurucu seviyede ifade edilmez. Hücreler uyarılmış zamanlarda Şekil 6A&#39;da görüldüğü gibi, herhangi bir lüminojenik sinyali tespit edilmiştir. Her iki hücre tipi TCDD, güçlü bir CYP1A1 / 1B1 indükleyici, bir işareti ile önceden inkübe edildiğindeed lüminojenik sinyal kontrol (Şekil 6A) kıyasla tespit edilir. Bu Luc-CEE prob sonra ölçülür lusiferin parçasının serbest bırakılması için lider metabolize olduğunu gösterir. Genel TCDD tedavi karaciğer hücre çizgisinden aktivitesi daha toplam protein normale döndükten sonra, hava yolu hücreleri için daha düşüktür. hücre hatları birincil hücreler daha az metabolik olarak aktif olma eğilimi beri bu olağandışı değil. α-naphthoflavone eklenmesi daha Luc-CEE metabolizmasının CYP bağımlılık teyit tüm hücre tiplerinde CYP1A1 / 1B1 aktivitesi üzerinde açık inhibitör etkisi vardır. UPLC-MS kullanılarak CYP450 Metabolitlerin miktarlarının hesaplanması Şekil 6B inhi mevcudiyetinde kumarin ve yokluğu ile inkübe edildikten sonra 3 vericiden (Hava M343, M345, M347) ve hepatik hücreleri (Hep hattı) alınan hava yolu hücrelerinde CYP2A6 / 2A13 aktivitesinin ölçümü göstermektedirbitor 8-metoksipsoralenden. Veri Toplam protein için normalleştirilir. 0 dak kumarin inkübasyon kontrolünde, bir 7-hidroksikumarin (Şekil 6B) tespit edilir. CYP2A6 / 2A13 bazı dokularda temel olarak ifade edilir ve 7-hidroksikumarin bir kumarin oluşumu ile, bu nedenle daha sonra 16 saat kuluçka da indüksiyonu olmadan, test edilen farklı hücre tiplerinde tespit edilir. 8-metoksipsoralenden zaman, CYP2A inhibitörü (Şekil 6B), 7-hidroksikumarin oluşumu önemli ölçüde azalır ilave edilir. Inhibisyon nadiren tamamlanır tamamlanmaz ve diğer CYP da substratı tanıması ama çok daha az verimli bir şekilde işlemek mümkün olabilir çünkü CYP inhibitörü varlığında, hala bazı kalıntı aktivite tespit etmek normal olduğunu belirtmek gerekir. Aynı zamanda, hava yolu hücrelerinde CYP2A6 için görülebildiği gibi, birincil hücreleri kullanıldığında kaydedilen metabolik aktivite, donörler arasında farklı olabilir gözlemlenebilir(Şekil 6B). Bu CYP aktivitesi her donör genotipi ve polimorfizmleri yükümlü olduğu tahmin edilmektedir. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/55502/55502fig6.jpg" /> Şekil 6: Aktivite Deneyi CYP1A1 için sonuç / 1B1 aktivite (A) ve hepatik Hücre Hattı ve üç Havayolu hücre vericileri (M360, M370, M417) içerisinde CYP2A6 / 2A13 aktivitesi (B). (A) Luc-CEE dealkilasyon aktivitesi ile TCDD CYP1A1 / 1B1 indüksiyonu olmadan gösterilmiştir. α-naphthoflavone CYP1A1 / 1B1 inhibitörü olarak kullanılmıştır. Etkinlik dakika (dak) inkübasyon süresi ile normalize, göreli ışık birimi (RLU), ve toplam protein (mg) olarak ifade edilir. Bunlar temel olarak ifade edilmiştir (B) olarak CYP2A6 / 2A13 indüksiyon gerektirmez. pmol / dak / mg protein olarak Kumarin 7-hidroksilasyon aktivitesi ile ve inhibitör 8-methoxypsor olmadan farklı zaman noktalarında gösteriliralen. Tüm sonuçlar ortalamanın standart sapma ile üç bağımsız ölçümün ortalama değeri olarak sunulmuştur. Bu şekil, Baxter 20 modifiye edilmiştir. Ek Tablo 1: UPLC ve Kütle Spektrometre Ayarları. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.</a>

In vitro sistemlerin Metabolik yetkinlik ilaç ve toksik maddelerin biyotransformasyonu ve dışa atılması için önemli bir gereksinimdir. Bu protokol, biz Hücre kültürlerinde metabolizma faz değerlendirmek için referans metabolik sondaları uygulanmasını açıklar.

Kütle Spektrometre ve lüminojenik tabanlı Yaklaşımlar Faz I Metabolik Yetkinlik ait Characterize<em&gt; İn Vitro</em&gt; Hücre Kültürleri

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Bu prosedürün amacı, kültürlenmiş hücrelerde sitokrom P450'lerin veya CYP'lerin aktivitesini belirlemektir. CYP'ler, ilaçların ve toksikanların metabolizmasında yer alan temel enzimlerdir ve ekspresyonları in vitro ortamda genellikle korunmaz. Hücreler in vitro ortamda kültürlendiğinde, CYP enzimlerinin normal ekspresyonu sıklıkla kaybolur.Bu nedenle, birçok in vitro model, ilaçların ve toksikanların metabolizmasının anlaşılmasındaki geçerliliği açısından potansiyel olarak sınırlayıcıdır. Bu yöntemin temel avantajı, kültürlenmiş hücrelerde CYP aktivitesinin değerlendirilmesindeki basitliğidir. Prob substratlar ve inhibitörler kullanılarak, kütle spektrometrisi de dahil olmak üzere farklı kantifikasyon platformları sunulmaktadır.Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı şekilde hücrelerin bulunduğu kriyojenik tüpleri temin edin. Sunulan protokolde örnek olarak bir hepatik hücre hattı kullanılmıştır. Steril koşullar altında çalışırken, fazla basıncı tahliye etmek için kriyojenik tüpü dikkatlice açın, ardından kriyojenik tüpün içeriğini, 37 °C'de önceden ısıtılmış 9 mL Williams'E medyum ile doldurulmuş 10 mL'lik bir tüpe pipetleyin.Çözeltiyi oda sıcaklığında 400 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı attıktan sonra hücreleri, 37 °C'ye önceden ısıtılmış ve glutamin eklenmiş beş mililitre tescilli çözme ortamında yeniden süspande edin. Metin protokolünde açıklandığı şekilde canlı hücreleri saydıktan sonra, hücreleri 24 kuyucuklu kolajen kaplı bir plakaya, kuyucuk başına 60.000 canlı hücre yoğunluğunda ve 0,5 mililitre nihai çözme ortamı hacminde ekleyin.Kültürde birkaç gün geçtikten sonra, hücreler subkonflüen trabeküler bir yapı oluşturur. Optimum metabolik aktivite tipik olarak yedinci ve 10. günler arasında gözlemlenir ve dördüncü günde en düşük seviyededir. Diferansiye hava yolu epitelyumu kültürlerini hazırlamak için, bir insert üzerinde hava-sıvı arayüzünde büyütülmüş, ticari olarak temin edilebilen tam diferansiye primer hava yolu epitelyumu kullanın.Steril cımbız kullanarak, hücre ekini agaroz matrisinden nazikçe ayırın ve 700 µL tescilli kültür ortamı ile önceden doldurulmuş yeni plakaya aktarın. Transepitelyal direnç veya silya vuruş frekansı gibi metin protokolünde referans verilen yöntemleri kullanarak havayolu dokusunun bütünlüğünü değerlendirin. Deneyden önce, havayolu hücreleri için iki seri hücre eki ve hepatik hücreler için en az üç tekerrürlü kuyu hazırlayın.Bir seriyi inhibisyon deneyi için, diğerini ise yalnızca metabolik prob için kullanın. Medya boş kontrolü olarak üçüncü bir hücre serisi hazırlayın. Deney günü, hücre kültürü medyasını 450 microliter taze medya ile değiştirin.İnhibisyon deneyi için hazırlanan hücre serisine 10x CYP inhibitörü içeren 50 µL besiyeri ekleyin ve 30 dakika ön inkübasyon yapın. Ardından, inhibisyon serisindeki besiyerini 450 µL taze besiyeri ile değiştirin ve hem 10x CYP inhibitörü hem de 10x prob substratı içeren 50 µL besiyeri ekleyin. Diğer hücrelere 10x prob substratı içeren 50 µL besiyeri ekleyin, ardından boş hücre kontrollerine besiyerinde seyreltilmiş eşdeğer miktarda taşıyıcı ekleyin.Birinci zaman noktası olan sıfır arka plan kontrolü için hücreleri sıfır ila beş dakika inkübe ettikten sonra, besiyerini ayrı etiketlenmiş tüplere toplayın ve gelecekteki işlemler için dondurun. Ardından, ikinci zaman noktasındaki hücreleri hücre inkübatöründe 16 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon süresinin sonunda, metabolik ürünün miktar tayini için besiyerini aynı yöntemle toplayın.1,5 mililitrelik bir mikrotüpe 250 mikrolitre inkübasyon medyumu aktarın ve final konsantrasyonu 100 nanomolar olacak şekilde 4-methylumbelliferone iç standart stok çözeltisi ekleyin. Bir molar HCl'yi, her seferinde bir mikrolitre ekleyerek medyumun pH değerini 4,5 ile 5,0 arasına ayarlayın. İki ila 10 mikrolitre medyumu bir pH şeridine damlatarak pH değerini doğrulayın, ardından Helix pamatia kaynaklı 150 ünite betaglucuronidase arylsulfatase ekleyin.37 °C'de bir saat inkübe ettikten sonra, 250 µL soğuk metanol ekleyerek reaksiyonu durdurun. Solventi 45 °C'de vakum santrifüj kullanarak uçurun. Numuneleri 500 µL %30 asetonitril-su çözeltisi ile yeniden çözün.Kütle spektrometrisi tabanlı kantifikasyon gerçekleştirmek için, her bir seri dilüsyon standardından 250 µL'yi, UPLC-MS otomatik örnekleyiciye enjekte edilmek üzere kehribar renkli ultra performans sıvı kromatografisi cam flakonuna ekleyin. Ayrıca test örneklerini de kehribar renkli UPLC flakonlarına ekleyin ve UPLC otomatik örnekleyiciye yerleştirin. Tüm flakonları randomize ettikten sonra, kantifiye edilecek spesifik proba bağlı olarak, metin protokolünde detaylandırılan ayarları kullanarak UPLC-MS'i çalıştırın.Elde edilen sentetik standart ve iç standarttan kalibrasyon eğrisi oluşturmak için kütle spektrometresi kantitasyon araçlarındaki Quantitate, Build Quantitation Method aracını kullanın, ardından kantite edilecek örnek grubunu ve örnekleri seçmek ve kantitasyon yöntemini yürütmek için Quantitation Wizard'ı kullanın. CYP1A1 ve CYP1B1'i indüklemek için metin protokolünde bulunan plaka düzenini kullanın. İndüksiyon için belirlenen hücreleri, ortamda 10 nanomolar TCDD nihai konsantrasyonu ile 72 saat boyunca inkübe edin.Bu sürenin ardından besiyerini uzaklaştırın, kuyucukları üç kez PBS ile durulayın ve bir miktar taze besiyeri ekleyin. Hücreleri lüminojenik rapor probu ile inkübe etmeden önce, indüklenmiş hücrelerin belirlenen bir alt grubunu, besiyeri içerisinde CYP1A1, CYP1B1 inhibitörü ile 30 dakika boyunca ön inkübasyona tabi tutun. İndüklenmemiş, indüklenmiş ve indüklenmiş artı inhibitörlü hücrelere, final konsantrasyonu 50 micromolar olacak şekilde lüminojenik prob luciferin 6'chloroethyl ether ekleyin.Dört saat boyunca inkübe edin ve ardından 25 µL kültür ortamını beyaz, opak bir 96 kuyucuklu plakaya aktarıp üzerine üretici tarafından sağlanan 25 µL lusiferin tespit reaktifi ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe ettikten sonra, plakayı hemen bir lüminometre kullanarak okuyun. CYP1A1 ve CYP1B1 tarafından katalize edilen lusiferin 6'kloroetil eterin dealkilasyonu ile üretilen göreceli lüminesans burada sunulmuştur.Örnek, TCDD indüksiyonu olmadığında herhangi bir enzim aktivitesi göstermemektedir. TCDD indüksiyonunu takiben, hem hepatik hem de solunum hücre tiplerinde CYP1A1, CYP1B1 aktivitesi gözlemlenmektedir. Son olarak, CYP1A1, CYP1B1 inhibitörü alfa-naftoflavon eklenmesi CYP aktivitesini azaltmakta veya ortadan kaldırmaktadır.Karaciğer ve havayolu hücre tiplerindeki CYP2A6 ve 2A13 aktivitesini değerlendirmek için, enzimin kumarini hidroksilasyonu yoluyla ürettiği 7-hidroksikumarin miktarı UPLC LC-MS kullanılarak ölçülmüştür. Kumarin ile sıfır dakikalık inkübasyonda yalnızca arka plan sinyali saptanmıştır. 16 saat sonra, her iki hücre tipinde de kumarin hidroksilasyonu ile birlikte 7-hidroksikumarin oluşumu gözlemlenmiştir.Son olarak, CYP2A, 2A13 inhibitörünün eklenmesi 7-hidroksikumarin oluşumunu engeller. Bu tekniğin prob inkübasyonu ve kantifikasyon bölümleri bir kez kavrandıktan sonra, çoğu durumda birkaç saatten bir güne kadar olan bir sürede tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, gerektiğinde inhibisyon ve/veya indüksiyon kullanarak enzimin özgüllüğünü doğrulayarak, farklı hücre tipleriyle çeşitli faz bir metabolizma analizlerinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu prosedürü uygularken, farklı hücre tiplerinin daha uzun inkübasyon süreleri gerektirebileceğini ve pozitif kontrol olarak kullanılabilecek bir hücre tipinin dahil edilmesinin esas olduğunu unutmamak önemlidir. TCDD ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceği unutulmamalıdır ve bu prosedür gerçekleştirilirken tam kişisel koruyucu ekipman gibi önlemler her zaman alınmalıdır. Bu tekniğin etkileri, yeni ilaçların preklinik değerlendirmesi ve tüketici ürünlerinde kullanılan kimyasalların ve bileşenlerin risk değerlendirmeleri için uygun in vitro modellerin kullanımına kadar uzanmaktadır.

mass-spectrometry-luminogenic-based-approaches-to-characterize-phase

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Hedefsiz metabolomik bir metabolik profili anlık üreten bir hipotez sağlar. Bu protokol, serum hücreler veya doku metabolitlerinin çıkarma ve analiz gösterecektir. Metabolitleri bir dizi sıvı-sıvı faz ekstraksiyon kullanılarak anket vardır, Mikrosirkülasyon Ultra Performanslı sıvı kromatografisi / diferansiyel analiz yazılımı için birleştiğinde yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (UPLC-HRMS).

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi-Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometre (UPLC-HRMS) kullanarak Biyolojik Kaynaklar gelen hedefsiz Metabolomik

Biz hızlı içinde in situ örnekleme yüksek kesinlik ve en az işgal kılcal tabanlı mikro-örnekleme, kimyasal bir anlık görüntüsünü metabolik aktivite karakterizasyonu kolaylaştırmak için kullanarak tek bir hücre bulunan küçük bir bölümünün etkinleştirmek adımları tarif canlı embriyolar bir ölçüye göre tek hücre Kapiler Elektroforez ve kütle spektrometresi platformu kullanarak.

Microprobe kılcal Elektroforez kütle spektrometresi canlı Kurbağa (Xenopus laevis) embriyo tek hücreli Metabolomics için

Biz oksijen tüketimi ve Drosophila melanogaster larva ve yetişkin Beynindeki hücre dışı asitleştirme ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bir metabolik analyzer adapte ve en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı ile kullanılmaktadır. Mikro-doku bağlar bu protokolü kritik bileşenidir ve tasarlanmış ve bunların kullanımı bu analizi için özel olarak yaratılmıştır.

Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

Entegre hücre manipülasyon platformu, ortam koşullarında bireysel süspansiyon hücrelerinin on-line analizi için tek prob Kütle Spektrometrisi kurulumu ile birlikte kullanılmak üzere geliştirilmiştir.

Entegre hücre manipülasyon platformu tek süspansiyon hücrelerinde Ilaçların ve metabolitlerin Kütle Spektrometrisi analizi için tek prob ile birleştiğinde

Burada, hücre siz protein sentezi reaksiyonlarında merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 bileşiği ölçmek için sağlam bir protokol salıyoruz. Hücresiz sentez karışımı ters fazlı sıvı kromatografi kullanılarak etkili ayrıştırma için anilin ile türevize edilir ve daha sonra izotopik olarak etiketlenmiş iç standartlar kullanılarak kütle spektrometresi ile ölçülür.

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

Protokoller, karmaşık lisat bazlı hücre içermeyen sistemlerde metabolik reaksiyonları incelemek için kırma indeksi veya kütle spektrometrik tespiti ile birleştiğinde yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemlerini açıklar.

Sıvı Kromatografisi, Lysate Tabanlı Hücre içermeyen Sistemlerde Metabolit Profilleme için Kırılma İndeksi veya Kütle Spektrometrik Algılaması ile Birleştirilmiştir

Burada, memeli hücrelerinde moleküler oksijen tüketme yeteneklerinden bağımsız olarak mitokondriyal fonksiyonu doğrudan ölçmek için bir tahlil derlemesi sunuyoruz.

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Burada, nadir hücre tiplerinde metabolitleri doğru ve güvenilir bir şekilde ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Hücre sınıflandırması için modifiye edilmiş bir kılıf sıvısı ve ilgili boş numunelerin oluşturulması da dahil olmak üzere teknik iyileştirmeler, numune başına yalnızca 5000 hücrelik bir girdi ile metabolitlerin kapsamlı bir miktar tayinini sağlar.

Nadir Primer Hücrelerde Hedeflenen Metabolomikler

Bu protokol, uçucu tuz çözeltisi yıkama, hızlı sıvı nitrojen söndürme, dondurarak kurutma ve -8 °C'de depolamayı birleştirerek tek hücreli kütle spektrometrisi (SCMS) için hücre metabolitlerini korumayı amaçlamaktadır. Metabolit profillerini korumak için sıvı nitrojen söndürmenin gerekli olduğunu, metabolik değişiklikleri önlemek için uzun süreli soğuk depolamanın en aza indirilmesi gerektiğini göstermektedir.

Tek Hücreli Kütle Spektrometresi Metabolomik Çalışmaları için Numune Hazırlama: Kombine Hücre Yıkama, Söndürme, Kurutma ve Depolama

Bir sheathless gözenekli ucu arayüz tasarımı kullanılarak kapiler elektroforez-kütle spektrometrisi ile biyolojik numunelerin metabolik profil için bir protokol verilmektedir.

Biyolojik Numune metabolik profil için Sheathless Kapiler Elektroforez-Kütle Spektrometre

Öğrenin, kütle spektrometrisi ve lüminesans tabanlı yöntemlerle in vitro hücre kültürlerinde sitokrom P450 aktivitesini değerlendirmeyi. Bu teknik, ilaç metabolizması ve toksikoloji araştırmaları için güvenilir bir model sunar.

Kütle Spektrometre ve lüminojenik tabanlı Yaklaşımlar Faz I Metabolik Yetkinlik ait Characterize

Daha fazla video keşfet