Kütle Spektrometre ve lüminojenik tabanlı Yaklaşımlar Faz I Metabolik Yetkinlik ait Characterize İn Vitro Hücre Kültürleri

Bu prosedürün amacı, kültürlenmiş hücrelerde sitokrom P450'lerin veya CYP'lerin aktivitesini belirlemektir. CYP'ler, ilaçların ve toksik maddelerin metabolizmasında yer alan anahtar enzimlerdir ve ekspressyonları genellikle in vitro olarak korunmaz. CYP enzimlerinin normal ekspresyonu, hücreler in vitro olarak kültürlendiğinde sıklıkla kaybolur.

Bu nedenle, birçok in vitro model, ilaçların ve toksik maddelerin metabolizmasını anlama ile potansiyel olarak sınırlı bir ilgiye sahiptir. Bu yöntemin temel avantajı, kültürlenmiş hücrelerde CYP aktivitesini değerlendirirken basitliğidir. Prob substratları ve inhibitörleri kullanılarak, kütle spektrometresi dahil olmak üzere farklı niceleme platformları sunulmaktadır.

Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi hücreli kriyojenik şişeler elde edin. Sağlanan protokol, örnek olarak bir hepatik hücre hattı kullanır. Steril koşullar altında çalışırken, fazla basıncı serbest bırakmak için kriyojenik şişeyi dikkatlice açın, ardından kriyojenik şişenin içeriğini 37 santigrat derecede dokuz mililitre önceden ısıtılmış Williams'E ortamı ile doldurulmuş 10 mililitrelik bir tüpe pipetleyin.

Çözeltiyi oda sıcaklığında 400 kez g'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri önceden 37 santigrat dereceye ısıtılmış ve glutamin ile takviye edilmiş beş mililitre tescilli çözülme ortamında yeniden askıya alın. Canlı hücreleri metin protokolünde tarif edildiği gibi saydıktan sonra, hücreleri 24 kuyu kollajen kaplı bir plakada, oyuk başına 60.000 canlı hücre yoğunluğunda ve 0.5 mililitre çözülme ortamının son hacminde tohumlayın.

Kültürde birkaç gün sonra, hücreler subkonfluent bir trabeküler yapı oluşturur. Optimum metabolik aktivite tipik olarak yedi ila 10. günler arasında gözlenir ve dördüncü günde en düşüktür. Diferansiye hava yolu epitel kültürlerini hazırlamak için, bir insert üzerindeki hava-sıvı arayüzünde büyütülmüş, ticari olarak temin edilebilen tamamen diferansiye primer hava yolu epitelini kullanın.

Steril cımbız kullanarak, hücre ekini agaroz matrisinden nazikçe çıkarın ve 700 mikrolitre tescilli kültür ortamı ile önceden yüklenmiş yeni plakaya aktarın. Transepitelyal direnç veya silia atım frekansı gibi metin protokolünde atıfta bulunulan yöntemleri kullanarak hava yolu dokusunun bütünlüğünü değerlendirin. Deneyden önce, hava yolu hücreleri için iki seri hücre eki hazırlayın ve hepatik hücreler için en az üç kopya içeren kuyucuklar hazırlayın.

Bir seriyi inhibisyon deneyi için, diğerini ise sadece metabolik prob için kullanın. Üçüncü bir hücre serisini ortam boş denetimi olarak hazırlayın. Deney günü, hücre kültürü ortamını 450 mikrolitre taze ortamla değiştirin.

İnhibisyon deneyi için hazırlanan hücre serisine 10x CYP inhibitörü içeren 50 mikrolitre ortam ekleyin ve 30 dakika boyunca ön inkübe edin. Daha sonra, inhibisyon serisindeki ortamı 450 mikrolitre taze ortamla değiştirin ve hem 10x CYP inhibitörü hem de 10x prob substratı içeren 50 mikrolitre ortam ekleyin. Diğer hücrelere 10x prob substratı ile 50 mikrolitre ortam ekleyin, ardından boş hücre kontrollerine ortamda seyreltilmiş eşdeğer miktarda araç ekleyin.

Hücreleri birinci zaman noktası için sıfır ila beş dakika inkübe ettikten sonra, sıfır arka plan kontrolü, ortamı ayrı etiketli tüplerde toplayın ve ortamı gelecekteki işlemler için dondurun. Daha sonra zaman noktası iki hücreyi hücre inkübatöründe 16 saat boyunca inkübe edin. Kuluçka süresinin sonunda, metabolik ürünün miktar tayini için aynı yöntemi kullanarak ortamı toplayın.

250 mikrolitre inkübasyon ortamını 1.5 mililitrelik bir mikrotüpe aktarın ve 100 nanomolar nihai konsantrasyona ulaşmak için 4-metilumbelliferon dahili standart stok çözeltisi ekleyin. Her seferinde bir mikrolitre olmak üzere bir molar HCl ekleyerek ortamın pH'ını 4.5 ile 5.0 arasında ayarlayın. Bir pH şeridine iki ila 10 mikrolitre ortam pipetleyerek pH'ı doğrulayın, ardından Helix pamatia'dan 150 birim betaglukuronidaz arilsülfataz ekleyin.

37 santigrat derecede bir saat inkübe ettikten sonra, 250 mikrolitre soğuk metanol ekleyerek reaksiyonu durdurun. Çözücüyü 45 santigrat derecede bir vakum santrifüjü kullanarak buharlaştırın. Numuneleri 500 mikrolitre %30'luk asetonitrilden suya çözelti ile sulandırın.

Kütle spektrometresi tabanlı miktar tayini gerçekleştirmek için, UPLC-MS otomatik numune alma cihazında enjeksiyon için kehribar rengi ultra performanslı bir sıvı kromatografi cam şişesine her bir seri seyreltme standardından 250 mikrolitre ekleyin. Ayrıca test numunelerini kehribar UPLC şişelerine ekleyin ve bunları UPLC otomatik numune alma cihazına yerleştirin. Tüm şişeleri rastgele hale getirdikten sonra, ölçülecek spesifik proba bağlı olarak metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklanan ayarları kullanarak UPLC-MS'yi çalıştırın.

Elde edilen sentetik standarttan ve dahili standarttan kalibrasyon eğrisini oluşturmak için kütle spektrometresi niceleme araçlarındaki Niceleme, Niceleme Yöntemi Oluşturma aracını kullanın, ardından nicelik yöntemini ölçmek ve yürütmek için örnek partisini ve numuneleri seçmek için Niceleme Sihirbazı'nı kullanın. CYP1A1, CYP1B1'i indüklemek için, metin protokolünde bulunan plaka düzenini kullanın. İndüksiyon için belirlenen hücreleri, 72 saatlik bir süre boyunca ortamda 10 nanomolar TCDD nihai konsantrasyonu ile inkübe edin.

Bu süreden sonra, ortamı çıkarın, kuyucukları PBS ile üç kez durulayın ve biraz taze ortam ekleyin. Hücreleri luminojenik raportör probu ile inkübe etmeden önce, indüklenen hücrelerin belirlenmiş alt kümesini ortamda CYP1A1, CYP1B1 inhibitörü ile 30 dakika önceden inkübe edin. İndüklenmemiş, indüklenmiş ve indüklenmiş artı inhibitör hücrelere 50 mikromolar nihai konsantrasyonda luminojenik propbe, lusiferin 6'kloroetil eter ekleyin.

Dört saat inkübe edin ve daha sonra 25 mikrolitre kültür ortamını beyaz, opak 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve üretici tarafından sağlanan 25 mikrolitre lusiferin tespit reaktifi ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe ettikten sonra, bir luminometre kullanarak plakayı hemen okuyun. CYP1A1, CYP1B1 tarafından katalize edilen lusiferin 6'kloroetil eterin dealkilasyonu ile üretilen bağıl lüminesans burada sunulmaktadır.

Örnek, TCDD indüksiyonunun yokluğunda hiçbir enzim aktivitesi göstermez. TCDD indüksiyonunu takiben hem karaciğer hem de solunum hücre tiplerinde CYP1A1, CYP1B1 aktivitesi gözlenir. Son olarak, CYP1A1, CYP1B1 inhibitörü alfa-naftoflavon ilavesi CYP aktivitesini azaltır veya ortadan kaldırır.

Karaciğer ve hava yolu hücre tiplerinde CYP2A6, 2A13 aktivitesini değerlendirmek için, kumarinin enzim tarafından hidroksilasyonu yoluyla üretilen 7-hidroksikumarin miktarı UPLC LC-MS kullanılarak ölçüldü. Kumarin ile sıfır dakikalık inkübasyonda sadece arka plan tespit edilir. 16 saat sonra, iki hücre tipinde 7-hidroksikumarin oluşumu ile kumarinin hidroksilasyonu gözlenir.

Son olarak, CYP2A, 2A13 inhibitörünün eklenmesi 7-hidroksikumarin oluşumunu önler. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu tekniğin prob inkübasyonu ve miktar tayini kısımları çoğu durumda birkaç saat ila bir gün içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, farklı hücre tipleri kullanılarak çeşitli faz bir metabolizma testlerinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamanız ve gerektiğinde inhibisyon ve/veya indüksiyon kullanarak enzimin özgüllüğünü doğrulamanız gerekir.

Bu prosedürü denerken, farklı hücre tiplerinin daha uzun inkübasyon süreleri gerektirebileceğini hatırlamak önemlidir ve pozitif kontrol olarak kullanılabilecek bir hücre tipinin dahil edilmesi önemlidir. TCDD ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman tam kişisel koruyucu ekipman gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Bu tekniğin etkileri, yeni ilaçların klinik öncesi değerlendirmesi için uygun in vitro modellerin kullanılmasına ve tüketici ürünlerinde kullanılan kimyasalların ve bileşenlerin risk değerlendirmelerine kadar uzanmaktadır.