Name: Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Öğrenin, radyoaktif ATP kullanarak protein kinaz aktivitesini ölçme yöntemini. Bu çok yönlü ve nicel teknik, hücresel sinyal yolaklarını anlamak için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar değerli çalışmalar ve tartışmalar için Cobb laboratuarı eski ve eski üyelerine ve idari yardım için Dionne Ware&#39;e teşekkür ederler. Bu çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüsü Hibe R37 DK34128 ve MHC&#39;ye Welch Vakfı Grant I1243 tarafından desteklenmiştir

1. Kinaz Saflaştırma Kaynakları ve Genel İmmünopresipitasyon Boru Hattı NOT: Bu testle birlikte kullanılacak kinazlar, kültürlenmiş hücrelerin immüno çöktürmelerinden veya afinite etiketli saflaştırma gibi rekombinant vasıtalarla elde edilebilir 6 . Aşağıda, ilgilenilen kinaza bağlı olarak değiştirilmesi gerekebilecek bayrak etiketli immüno çökeltme için genel bir protokol bulunmaktadır. Mümkün olduğunca her şey buz üzerinde tutulmalıdır. <ol><li> Salgılanırken hücre lizatlarının 200 μL&#39;sine (genellikle ~ 1 mg / mL toplam protein konsantrasyon) 2 μL 1 mg / mL antikor ekleyin ve 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Protein A sefaroz boncuklarını lizis tamponu ile yıkayın (aşağıya bakın), 5,000 xg&#39;de (&quot;dokunmatik sıkma&quot;) 30 saniye ila 1 dakika süreyle 4 ° C&#39;de kısaca döndürünüz, bir pipet ile süpernatantı çıkarıp, tamponda boncuklar yeniden süspansiyon haline getirerek . <ol><li> Lizis tamponu hazırlayın: 50 mM HEPES pH 7.7, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA,% 10 gliserol, 0.2 mM sodyum ortovanadat, 100 mM sodyum florür, 50 mM β-gliserofosfat,% 0.1 Triton X 100 veya% 0.1 NP-40. </li></ol></li><li> Lizis tamponundaki lisinatlara protein A sefaroz boncuklarının% 50 bulamaçından 30 uL ekleyin; Sallanırken 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Boncukları pelet haline getirmek ve süpernatanı çıkarmak için 4 ° C&#39;de döndürmeye dokunun. </li><li> 3 kez 1 mL boncuk yıkama tamponu (1 M NaCl, 20 mM Tris pH 7.4) ile yıkayın. </li><li> Bir kere 1x kinaz reaksiyon tamponu (10 mM HEPES pH 8.0, 10 mM MgCl2) ile yıkayın. Boncukları çıkarmadan mümkün olduğunca fazla tampon çıkarın. </li></ol> 2. Kinaz Tepkimelerinin Başlatılması NOT: IP kinaz tahlillerinde, ~ 15 μL susuz boncuklar tipik bir başlangıç ​​örneğidir. Rekombinant protein kinaz tahlilleri için, tipik başlangıç ​​miktarları 25-50 uL&#39;lik nihai reaksiyon hacimleri için 1-10,1-1,0 μg aralığında değişir. Rekombinant protein örneğinin hacimlerini ayarlayınS, tayini başlatmadan önce saklanan tampona eşit olmalıdır. Yüksek miktarda kinaz kullanırken, test süresince protein stabilitesinin korunmasına yardımcı olmak için BSA gibi bir taşıyıcı protein ekleyin. <ol><li> Aşağıda verilen 5x kinaz reaksiyon tamponunu hazırlayın: 50 mM HEPES pH 8.0 50 mM MgCI2 50 mM Benzamidin (proteaz inhibitörü) 50 mM DTT (redüksiyon ajanı) 250 uM ATP (etiketsiz veya &quot;soğuk&quot;) </li><li> 1.5 mL tüpler içinde buz üzerinde kinaz örnekleri tutun. Aşağıdaki reaksiyon karışımını ayrı, soğutulmuş 1.5 mL tüplerde hazırlayın: 21 uL H20 6 uL 5x kinaz reaksiyon tamponu 1 μL radyoaktif işaretlenmiş (&quot;sıcak&quot;) ATP 2 uL substrat (~ 5 mg / mL) NOT: Rekombinant kinaz tahlillerinde, hacim saflaştırılmış proteine ​​uyacak şekilde ayarlanabilir. Nihai reaksiyon hacmi 30 mcL olacak şekilde hesaplayın. Bir tarifi hazırlamak için bu tarifi kullanınkarıştırın. Etiketli ATP&#39;nin alınması üzerine, tepkime karışımına ilave edilmeden önce H20&#39;da 0.01 mCi / μL&#39;lik spesifik bir aktiviteye seyreltilmiş stok. </li><li> Testi başlatmak için, reaksiyon karışımının tamamını kinaz numunesine ekleyin ve reaksiyona giren kinazın aktivitesine bağlı olarak 30 ° C&#39;de 5 dakika ila 1 saat reaksiyon inkübe edin. NOT: Etkinliği önceden test edilmemiş olan bir kinaz ile çalışırken, zaman noktaları arasında 5 dakika aralıklarla bir süre kinaz aktivitesi gerçekleştirin. </li></ol> 3. Reaksiyon Sonlandırma ve SDS-PAGE <ol><li> Buz koyarak ve 7.5 uL 5x Laemmli numune tamponu 6 ilave ederek reaksiyonu durdurun. </li><li> Isı bloğunda 30 saniye ila 2 dakika boyunca 100 ° C&#39;de ısıtın. </li><li> Dokunmaya basın ve% 10-15 SDS-PAGE jelinde oyuk başına 20 mcL yükleyin. Kinazı ve alt tabakayı ayırmak için yeterince uzun süre jel edin (normalde 5 W sabit gücünde 1 saat) Jel ​​aygıtı, 32&#39;ye maruz kalma oranını sınırlandırmak için korumalı olduğundan emin olun. </sus&gt; p. <ol><li> Burada, ev yapımı jel aparatlarını kullanın, ancak piyasada bulunan standart mini jeller kusursuz bir şekilde uygundur. Boyutları aşağıdaki gibi kullanın: Jeller: 8 cm genişlik, 5.5 cm uzunluk (özünürlük), 1.5 mm kalınlık. Taraklar: 15 oyuk, 1,5 mm kalınlık, 2,9 mm genişlik, 16 mm derinlik </li></ol></li></ol> 4. Jel boyama ve kurutma Dikkat: Tüm basamaklarda, radyoaktif ekran kullanan ve kişisel koruyucu ekipman giyerek kişisel maruziyeti 32 P&#39;ye düşürdüğünüzden emin olun. Belirli adımlarla ilgili daha fazla bilgi için bazı yararlı referanslar bulunmaktadır. <ol><li> Jel cam / alumina plakalarından çıkarılır ve 50 rpm&#39;ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcı üzerinde 1 saat süreyle 50 mL Coomassie lekesi (% 10 glasiyal asetik asit,% 50 metanol,% 0.25 R-250 boya) yerleştirilir. Bu adım için, jelden biraz daha büyük bir kap kullanın. 8 </li><li> Jeli lekeden sabitleme solüsyonuna (% 10 buzlu asetik asitD,% 20 metanol) de leke giderildi. Gece 50 rpm&#39;de orbital çalkalayıcıda 600-700 mL sabitleme solüsyonunda jel salınır. Coomassie boya 8 , 9 emmek için köpük parçaları veya düğümlü laboratuar mendilleri jel ile kaba yerleştirin. </li><li> Sabitleme çözeltisinden jel çıkarın ve jöle sarımsı beyaza dönene dek 1-2 dakika hafifçe karıştırarak 200 mL metanol içine batın. Bu kurutma işlemi sırasında çatlamayı önlemeye yardımcı olacaktır. </li><li> Metanol ile kalitatif bir filtre kağıdı 14 cm x 14 cm&#39;lik bir parça ıslatın ve kütük jel vakumlu kurutucuya yerleştirin. Jelin filtre kağıdının ön tarafı yukarı bakacak şekilde bırakın. </li><li> Kırışıklıkların ve hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için jel plastik ambalajla dikkatle örtülmelidir. Kurutucuyu 80 ° C&#39;de 1.5 saat çalıştırın. Vakum elde edildikten sonra kapağı açın ve gerekirse herhangi bir hava kabarcıklarını yumuşak bir kauçuk köpük ile püskürtün. </li></ol> 5. Otoradyogram ve Sintilasyon Sayıları <ol><li> Dri&#39;yi kaldırJelin kenarındaki filtre kağıdına bir autorad markörü, fotoselli cetvel veya noktalar ekleyin. Nokta kullanılıyorsa bunların asimetrik bir biçimde olduğundan emin olun. Bu, pozlamadan ve geliştirildikten sonra jel ile filmi hizalayacaktır. </li><li> Sinyal yoğunluğunu kontrol etmek için Geiger sayacı kullanın. Zayıf sinyaller için yoğunlaşan bir ekranla -70 ° C ila -80 ° C arasındaki pozlama film band yoğunluğunu artıracaktır. </li><li> Karanlık bir odada kurutulmuş jel, filmle birlikte bir film kasetine, üstten alta doğru yoğunlaşan bir ekrana yerleştirin: jel, film, yoğunlaştırıcı ekran. </li><li> Yoğunlaştırma ekranını kasetin kapağına takın ve bu adımı kolaylaştırmak için jeli bantlayın. Yoğunlaştıran ekran, 32 P&#39;den gelen beta partikülleri tarafından ışınlandığında ışık yayar. Bu ışık emisyonları, filmi beta partiküllerinden daha verimli şekilde geçirir. <ol><li> Yoğunlaştırıcı ekranın yaydığı dalga boyununGölet filmi en hassas dalga boyuna kadar. </li><li> Maruz kalmanın ne kadar süreceğini belirlemek için Geiger sayacı kullanın: cpm sayısı ~ 100 veya daha düşükse, gece boyunca -70 ° C&#39;de deneyin. Sayım ~ 10.000 ise, 1 saat pozlama ile başlayın ve oradan optimize edin. </li></ol></li><li> Pozlamanın sonunda filmi çıkarın ve bir tıbbi / X-ışını film işlemcisinde gelişir. Pozlama -70 ila -80 ° C arasında gerçekleştirildiyse, film üzerindeki yoğunlaşmayı en aza indirgemek için yoğunlaştırma oluşmadan hemen önce kaseti oda sıcaklığına getirmesine izin verin 10 . </li><li> Filmi kurutulmuş jel / filtre kağıdı üzerine yerleştirin ve işaretli / noktalı görüntüleri kurutulmuş jel üzerindeki işaretleyiciler / noktalar ile hizalayın. Filmde protein standartlarına karşılık gelen bantları işaretleyin. Protein standartlarını ve reaksiyonların gelecekteki referanslar için hangi hatları etiketleyin. </li><li> Filmdeki ilgi bantlarına karşılık gelen bantları jelden ayırın ve onları yerleştirin7 mL sintilasyon flakonlarında. 4 mL sintilasyon sıvısı ekleyin ve sıvı sintilasyon sayacı ile sayın. Sayıcının, 32 P için doğru enerji spektrum penceresini izleyecek şekilde ayarlandığını teyit edin. NOT: Ayrıca, no-kinase kontrol şeridinden substrata karşılık gelen bandı çıkardığınızdan emin olun. Bu, tüm numune sintilasyon sayımlarından çıkarılacak olan arka plan radyasyonunun hesaplanması için kullanılacaktır. </li></ol> 6. Sonuçların Analizi NOT: Otoradyogram, sonuçların niteliksel olarak görselleştirilmesini sağlar. Doğru kantitasyon için, bir sintilasyon sayacı ile 32 P birleşmesi ölçülebilir. Veriler, Şekil 1B&#39;de gösterildiği gibi, genellikle göreceli etkinlik açısından ifade edilir. Tüm numuneler için muntazam koşullar sağlandığı sürece, spesifik aktivitenin göreceli ölçümleri, tedavileri karşılaştırmak için yeterlidir. <ol><li> Mutlak spesifik aktivite değerlerini hesaplarken bir sertlik gerçekleştirinBir süre boyunca ( örn., 2 x [kinaz] = 2 x spesifik aktivite) lineer bir aktivite aralığı sağlamak için, kinaz, substrat ve soğuk ATP konsantrasyonları dahil tüm reaksiyon koşullarının optimizasyonu. Yüksek spesifik aktiviteye sahip kinazlar için, kinaz aktivitesinin substrat miktarı ile sınırlanması durumunda artırılmış substrat konsantrasyonu ile tahliller yapın. </li><li> Mg kinaz başına dakikada aktarılan nanomole fosfat birimleri cinsinden ilgili kinazın spesifik aktivitesini hesaplayın. <ol><li> Sayılmış bantlardaki boşlukları cpm&#39;den çıkarın. </li><li> Sıcak ATP&#39;nin bozunumunu hesaplayın: [(1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0.95 Burada t referans tarihinden bu yana geçen gün sayısıdır (satıcı tarafından sağlanmalıdır), t 1/2 , Yarılanma ömrü 32 P olan 14.3 gün ve 0.95, sintilasyon sayacının verimliliğini yansıtıyor. Örnek: 28 günlük sıcak ATP kullanılıyorsa, bozunma değeri 0.245 olmalıdır. </li><li> CalcTahlil hacmi (μL) x [soğuk ATP] (μM) = toplam ATP (pmol): toplam ATP&#39;nin pikomollerini (pmol) tahlilde ölçün (genellikle reaksiyondaki soğuk ATP miktarına eşittir). Örnek: 30 uL x 50 uM = 1500 pmol </li><li> Cpm / pmol ATP&#39;yi hesaplayın: [sıcak ATP x μL (2.2 x 10 7 ) x bozunma faktörü] / pmol soğuk ATP. NOT: 2,2 x 10 7 değeri 0.01 mCi / μL ATP&#39;yi cpm&#39;ye dönüştürür. </li><li> Deneydeki kinaz miktarını mg cinsinden hesaplayın. Hem rekombinant kinaz hem de immüno-çökeltilmiş kinazlar için başlangıç ​​konsantrasyonlarının belirlenmesinde BCA tahlilleri gibi standart metotlar uygundur. Örnek: 50 μL kinaz reaksiyonunda wtERK2 0.0002 μg / μL, 0.01 μg veya 1 x 10-5 mg&#39;dir. </li><li> Testte toplam cpm&#39;yi hesaplayın. 30 μL reaksiyonları monte edin ve her reaksiyondan bir jel üzerinde 20 μL çalıştırın. Sayılan toplamı (boş çıkarma sonrasında) yüklenen toplam tahlil hacmi / hacmi faktörüne çarpın. Yukarıdakilere devam etmekÖrneğin, tüm sayıları 1,5 ya da 30/20 ile çarpın. </li><li> Test edilen kinazın spesifik aktivitesini hesaplayın: Deneyde toplam cpm) / (cpm / pmol ATP) / (tahlil süresi dakika olarak) / (kinaz miktarı mg cinsinden) NOT: Yukarıdaki değeri 1.000&#39;e bölmek, spesifik aktiviteyi nanomole / dakika / mg cinsinden verir </li></ol></li><li> Bir substrata kaç molekül fosfat eklendiğini hesaplayın (molekül ağırlığı biliniyorsa). Bu, reaksiyon tamamlandıktan sonra belirli bir proteindeki fosfosit sayısını belirlemek için kullanılır. Deneyde toplam cpm) / (cpm / pmol ATP)] / (pmol cinsinden alt tabaka miktarı) </li></ol>

<ol><li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li>
<li>Wellbrock, C., Arozarena, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Complexity+of+the+ERK%2FMAP-Kinase+Pathway+and+the+Treatment+of+Melanoma+Skin+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 33(2016).</li>
<li>Yang, T., Terman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+PKA-Mediated+Phosphorylation+of+Plexin+Using+Purified+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins.</a> Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).</li>
<li>Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+method+for+the+assay+of+many+serine%2Fthreonine-specific+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases.</a> Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).</li>
<li>Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+fluorescence+assay+for+serine%2Fthreonine+kinases+using+specific+chemical+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction.</a> Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).</li>
<li>Cold Spring Harbor Protocols. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/">http://cshprotocols.cshlp.org/</a> (2016).</li>
<li>Dalby, K. N. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja9856856">Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology.</a> J Am Chem Soc. 121 (51), 12215(1999).</li>
<li>Roland, J. Coomassie Staining and Destaining. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html">http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html</a> (2007).</li>
<li>Autoradiography. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography">https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography</a> (2011).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22The+Protein+Protocols+Handbook%22">The Protein Protocols Handbook</a>. , 3 edn, Humana Press. (2009).</li>
<li>Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNK1%2C+a+novel+mammalian+serine%2Fthreonine+protein+kinase+lacking+the+catalytic+lysine+in+subdomain+II%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II.</a> J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).</li>
<li>McReynolds, A. C. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.biochem.6b00096">Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding.</a> Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).</li>
<li>Carlson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+discovery+of+ERK2+substrates+identifies+ERK-mediated+transcriptional+regulation+by+ETV3%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3.</a> Sci Signal. 4 (196), rs11(2011).</li>
<li>Courcelles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+dynamics+reveal+novel+ERK1%2F2+MAP+kinase+substrates+with+broad+spectrum+of+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions.</a> Mol Syst Biol. 9, 669(2013).</li>
<li>Myers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screening+and+Hit+Validation+of+Extracellular-Related+Kinase+5+%28ERK5%29+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb+Sci%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors.</a> ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Kinazlar sayısız bağlamda kapsamlı işlevsellik geliştirdiler proteinlerin bir ailesidir ve kinaz tahlilleri birkaç sinyal protein incelenmesi için inanılmaz faydalı olmuştur ve hücresel iletişim mevcut mevcut anlayışımıza büyük ölçüde katkıda bulunmuştur. Özellikle yapı ve aktivitede büyük farklılıklara rağmen iki farklı kinazın karakterizasyonunda aynı temel tahliller kullanılmıştır. WNK1 kinazı, kritik lizin eşsiz bir konuma kaymış ve hem kinaz hem de iskele işlevleri yoluyla katyon-klorid kotransportörlerin düzenlenm...

Protein kinazlar, hücresel sinyallerin uygun cevaplara iletilmesi için kritik olan sofistike enzimlerdir 1 . Homeostazın korunması ve hastalık durumlarının önlenmesi veya yükseltilmesindeki rolleri göz önüne alındığında, kinaz aktivitesini değerlendirmeye yönelik biyokimyasal yöntemler, ökaryotik işaretlemenin ayrıntılarını açıklamak için güçlü araçlar olmaya devam etmektedir 3 . Fosfoya özgü antikorları kullanan stratejiler, farklı tedavi koşullarının hücre sinyal durumu 4 üzerindeki etkilerini ölçmek açısından son derece bilgilendirici olmasına rağmen, bir kinaz tahlili, farklı tedavi koşullarının doğrudan bir kinaz enzim aktivitesi açısından ölçülmesini sağlar. faiz. Benzer tahliller için radyoaktif materyal 5&#39;i kullanmayan çeşitli seçenekler olsa da, sonuçların sağlıklı bir şekilde ölçülmesi için bu metoda güveniyoruz. Orada, Bu tahlilin, farklı nedenlerle değerli olan iki tipik uygulamasıdır: immüno çökeltilmiş (IP) kinaz tahlili ( Şekil 1 ) ve rekombinant protein kinaz tahlili ( Şekil 2 ). IP kinaz tahlili, spesifik protein kinazları aktive edebilen faktörleri tanımlamak ve inhibe edici tedavi koşullarını belirlemek için çok yararlıdır. Kısaca, ilgilenilen bir epitopla etiketlenmiş kinaz kültürlenmiş ökaryotik hücrelere aktarılır, çeşitli tedavilere tabi tutulur, immüno-çökeltilir ve radyoaktif işaretlenmiş fosfatın bir model substrata ( örn., Miyelin bazik protein (MBP)) dahil edilme yeteneği açısından denenmiştir. IP kinaz tahlili, endojen proteinin immüno-çökmesi veya herhangi sayıda genom düzenleme tekniği ile aşırı ekspresyona başvurmadan da yapılabilir. Tedaviler kültüre uygulandığından, bu yöntem çok sayıda yukarı akış faktörü aracılığıyla iletilen uyarıları tespit edebilirVeya paralel yolaklarda in vitro okuma yoluyla. Bu yöntemin en önemli bir avantajı, direkt yukarı akış veya aşağı akış faktörlerine veya fosforilasyon bölgelerine ilişkin önceden bilgi gerektirmediğidir. Dahası, ilgilenilen bir kinaz için spesifik substratlar belirlendikten sonra, aynı kinaz tahlil protokolü, doğal substratlara karşı spesifik aktiviteyi ölçmek ve rekombinant bileşenlerle birlikte kütle spektrometresi analizi ile birleştirildiğinde spesifik fosforilasyon yerlerini belirlemek için kullanılabilir. Bu şekilde tanımlanan bölgeler, substrat mutantlarını kullanan kinaz tahlilleriyle daha da doğrulanabilir. Son olarak, bu yöntem otofosforilasyonu saptamak ve ölçmek için de kullanılabilir. Burada verilen protokol, kültürlenmiş hücrelerde ilgi çekici bir etiketlenmiş kinazın ekspresyonu için optimize edilmiş bir protein saflaştırma şeması veya transfeksiyon yöntemi varsayar. Transfeksiyon, lizis, immüno çökeltme ve protein saflaştırma protokolünün daha ayrıntılı sergilenmesi içinOcols, Cold Spring Harbor Protocols 6&#39;ya atfen öneriyoruz. Test geliştirme ve modifikasyonu hakkında daha fazla bilgi için, Protein Fosforilasyonu: Enzimolojide Seçilmiş Yöntemler 7&#39;ye bakın .

<table><tbody><tr><td>Protein A Sefaroz CL-4B</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td>17-0963-03</td><td></td></tr><tr><td>Radyo işaretli [&gamma;-32P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG035C010MC</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Tampon</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610737</td><td></td></tr><tr><td>Radyoaktif kalkanlama</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>BR-006</td><td></td></tr><tr><td>R-250 boya (Coomassie)</td><td>Thermo Fisher</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grade 3 kalitatif filtre kağıdı</td><td>Whatman</td><td>1003-917</td><td></td></tr><tr><td>Döşeme jel vakumlu kurutucu</td><td>Bio-Rad</td><td>Model 583 Jel Kurutucu #1651745&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Autorad işaretleyici</td><td>Agilent Technologies</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Fosforlu cetvel</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8133</td><td></td></tr><tr><td>Fosforlu noktalar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5149</td><td></td></tr><tr><td>Geiger sayacı</td><td>Ludlum</td><td>Model 3, 44-9 dedektörlü</td><td></td></tr><tr><td>BioMax Kaset 8 x 10"</td> <td>Carestream Health</td><td>107 2263</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Film 8" x 10"</td> <td>Carestream Health</td><td>829 4985</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Yoğunlaştırıcı Ekran 8" x 10"</td> <td>Carestream Health</td><td>851 8706</td><td></td></tr><tr><td>Tıbbi/X-ray film işlemcisi</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>Sintilasyon şişeleri</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>125500</td><td></td></tr><tr><td>Sintilasyon sıvısı</td><td>MP Biyomedikal</td><td>188245305</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS 6500 Sintilasyon sayacı</td><td>Beckman</td><td>LS 6500</td><td></td></tr></tbody></table>

protein kinaz aktivitesini radyoaktif etiketli atp ile tahlil

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinazlar, kompleks uyarı dizilerine yanıt olarak büyük ölçekli hücresel değişiklikleri yönetebilir ve düzenlemelerinin allosterik ayrıntılarını açığa çıkarmak için çok çaba harcanmıştır. Kinazlar, kusurları çoğunlukla birden fazla kanser türü ve ilgili hastalıkların özelliklerini gösteren işaret şebekelerini içerir ve bu sayede iyileştirici terapötik araştırmalarında kritik olan reaksiyon gereksinimlerinin geçerliliği için bir analiz platformu oluşturulabilir. Burada, biyokimyasal ve farmakolojik ajanlar, mutasyon ve silme gibi genetik manipülasyonların yanı sıra hücre kültürü koşulları ve problara uygulanan tedavilerin testleri de dahil ancak bunlarla sınırlı olmayan spesifik deneysel sorulara uyacak şekilde kolayca adapte edilebilen basit bir kinaz testini açıkladık Hücre sinyal mekanizmaları. Bu tahlil, niceliksel karşılaştırmalara ve sonuçların net görselleştirilmesine imkan tanıyan radyoaktif işaretlenmiş [γ- 32 P] ATP&#39;yi kullanır ve mod olabilirImmüno-çökeltilmiş veya rekombinan kinaz, spesifik veya tipik substratlar ile birlikte kullanım için geniş bir yelpazede reaksiyon koşullarına sahiptir.

WNK1 IP kinaz tahlilleri Myc etiketli WNK1, HEK293 hücrelerine transfekte edildi ve bir anti-Myc antikoru 11 ile immüno-çökeltildi. İmmünopresipitat model substrat MBP&#39;ye ve kendisine doğru kinaz aktivitesini göstermiştir ( Şekil 1A ). Daha sonra WNK1 mutantları aynı usulle MBP&#39;ye karşı kinaz aktivitesi için test edildi, bu kez GST etiketli yapılar kullanıldı ( Şekil 1B</st...

Protein kinazlar, inter-ve intraselüler sinyal iletimi için kritik olan, oldukça gelişen sinyalleme enzimleri ve iskeletleridir. Radyoaktif işaretli adenosin trifosfatın ([γ- 32 P] ATP) kinaz aktivitesini ölçmek için bir protokol sunuyoruz, bu hücresel sinyal düzenlenmesinin aydınlatılmasına yardımcı olan güvenilir bir yöntemdir.

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Bu deneyin genel amacı, protein kinazların enzimatik aktivitesini ölçmektir. Bu yöntem; bir kinazın veya kinaz mutantının ne kadar aktif olduğu, özgüllüğü ve aktivitesinin farklı hücre tedavilerine duyarlılığı gibi kinaz sinyalizasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hem çok yönlü hem de kantitatif olmasıdır.Prosedürü, bu analiz konusunda geniş deneyime sahip olan Cobb Laboratuvarı'ndaki araştırma bilimcisi Steve Stippec gerçekleştirecektir. Başlamak için, 200 µL hücre lizatına 1 mg/mL antikorun 2 µL'sini ekleyin ve sallayarak 4 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Protein A-Sepharose boncuklarını, lizis tamponu ekleyerek iki ila üç kez yıkayın ve ardından 4 °C'de, 5000 ×g hızda 30 saniye ile bir dakika arasında santrifüjleyin; ardından süpernatanı bir pipetle uzaklaştırın ve boncukları tampon içinde yeniden süspande edin.Ardından, lizatlara 30 µL %50'lik Protein A-Sepharose boncukları ve lizis tamponu karışımı ekleyin. Lizatları, sallayarak dört derece Celsius'ta bir saat boyunca inkübe edin. Boncukları çöktürmek için dört derece Celsius'ta kısa süreli santrifüj uygulayın ve süpernatantı uzaklaştırın.Boncukları üç kez bir mililitre boncuk yıkama tamponu ile yıkayın, ardından kısa süreli santrifüj uygulayın; sonrasında boncukları bir kez bir X kinaz reaksiyon tamponu ile yıkayın. Kısa süreli santrifüj sonrası, boncukları uzaklaştırmadan mümkün olduğunca fazla tamponu çekip alın. Analizi başlatmak için, reaksiyon karışımının tamamını kinaz örneğine ekleyin.Reaksiyonu, analiz edilen kinazın aktivitesine bağlı olarak 30 °C'de beş dakika ile bir saat arasında inkübe edin. Reaksiyonu buza yerleştirip 7,5 µL 5X Laemmli örnek tamponu ekleyerek durdurun, ardından reaksiyonu ısıtma bloğunda 100 °C'de üç ila beş dakika ısıtın. Örneği kısa süreli santrifüjle (touch spin) çöktürdükten sonra, %10 ila %15'lik SDS-PAGE jelindeki her bir kuyuya 20 µL yükleyin.Fosfor-32 yüksek enerjili bir beta yayıcı olduğu için maruziyeti sınırlamak amacıyla jel düzeneğinin korumalı tutulduğundan emin olun. Kinaz ve substratı ayırmak için jeli yeterince uzun süre çalıştırın. Çalıştırma işleminin ardından jeli cam ve alüminyum plakalardan çıkarın, ardından jeli 50 RPM'ye ayarlanmış bir orbital sallayıcıda bir saat boyunca 50 mililitre Coomassie boyasına yerleştirin.Bu adım için jelden biraz daha büyük bir kap kullanın. Jeli boyasız hale getirmek için jeli boyama çözeltisinden sabitleme çözeltisine aktarın. Coomassie boyasını absorbe etmesi için jelin bulunduğu kaba köpük parçaları veya düğümlenmiş laboratuvar mendilleri yerleştirin.Jeli, orbital sarsıcıda 50 RPM hızında, 600 ila 700 mililitre sabitleme solüsyonu içinde gece boyunca sallayın. Ertesi gün, jeli sabitleme solüsyonundan çıkarın ve jel süt beyazı rengine dönene kadar hafifçe çalkalayarak 200 mililitre metanol içinde bir ila iki dakika bekletin. Bu işlem, kurutma aşamasında çatlamayı önlemeye yardımcı olacaktır.Ardından, yaklaşık 14 santimetreye 14 santimetre boyutlarında bir kalitatif filtre kağıdını metanol ile ıslatın ve bir plak jel vakumlu kurutucu üzerine yerleştirin. Jeli, ön yüzü yukarı bakacak şekilde filtre kağıdının üzerine koyun. Jeli dikkatlice streç filmle örtün, ardından kurutucuyu çalıştırın ve vakum uygulayın.Sadece birkaç saniye sonra vakum sağlandığında, yumuşak bir kauçuk merdane ile hava kabarcıklarını dışarı doğru itin. Çalıştırmayı 90 dakika boyunca sürdürün. Kurumuş jeli çıkarın ve jel kenarındaki filtre kağıdına fosforlu cetvel veya nokta gibi bir otoradyografi işaretleyicisi yerleştirip, jeli güçlendirici ekran içeren bir kasete koyun.Sinyal yoğunluğunu kontrol etmek için bir Geiger sayacı kullanın. Daha zayıf sinyaller için, güçlendirici ekran ile -70 °C ile -80 °C arasında pozlama yapmak film bandı yoğunluğunu artıracaktır. Karanlık odada, güçlendirici ekran içeren film kasetinin içindeki kurutulmuş jel üzerine bir parça film yerleştirin.CPM sayımı 100 veya altındaysa, -70 ile -80 °C arasında gece boyu pozlama yapmayı deneyin. Alternatif olarak, sayım 10.000'e daha yakınsa, bir saatlik pozlama ile başlayın ve süreci buradan itibaren optimize edin. Pozlama sonunda, filmi çıkarın ve tıbbi bir film veya X-ray film işlemcisinde banyo işlemine tabi tutun.Film üzerindeki protein standartlarına karşılık gelen bantları işaretleyin. Ayrıca, ileride referans olması için protein standartlarını ve reaksiyon şeritlerini etiketleyin. Jel üzerinden, filmdeki ilgi duyulan bantlara karşılık gelen bantları kesin.Bantları yedi mililitrelik sintilasyon şişelerine yerleştirin ve dört mililitre sintilasyon sıvısı ekleyin. Bantları bir sıvı sintilasyon sayacı ile sayın. Sayacın, fosfor-32 için doğru enerji spektrumu penceresini izleyecek şekilde ayarlandığını doğrulayın.Metin protokolünde açıklandığı şekilde sonuçların analizine geçiniz. Saflaştırılmış ERK2 fraksiyonları, ERK2 kinaz aktivitesinin konstitütif olarak aktif bir stimülatörü olan MEK1R4F varlığında veya yokluğunda MBP ile bir kinaz assay'inde kullanılmıştır. Benzer bir deneyde, bakteriyel kültürlerden saflaştırılmış rekombinant ERK2 mutantlarının aktivitesini vahşi tip proteinle karşılaştırmalı olarak ölçmek için bir MBP kinaz assay'i kullanılmıştır.ERK2, MEK1R4F tarafından stimüle edildiğinde MBP'yi fosforile edebilmiş olsa da, katalitik lizinin veya çift fosforilasyonun kanonik bölgelerine yakın bir treoninin mutasyonu ile ERK2 kinaz aktivitesi dramatik bir şekilde ortadan kalkmaktadır. ERK2 T188D ve ERK2 T188E, küçük esnek bir peptide karşı marjinal kinaz aktivitesi göstermektedir. Ancak, vahşi tip ERK2'de görüldüğü gibi, bilinen ERK2 substratları olan Nup153 ve PDX1'i güçlü bir şekilde fosforile edememektedirler.Bu teknik uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde bir ila iki günde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bulundukları sinyal ağlarını daha iyi anlamak amacıyla protein kinazların aktivitesini ölçmek için radyolojik olarak etiketlenmiş ATP'nin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, eşit protein miktarlarını hesaba katmak için ilgilenilen kinazları çöktürmek amacıyla amino çöktürme protokolünü optimize etmenin ve kinaz aktivitesinin doğru karşılaştırmalarını sağlamak için rekombinant protein konsantrasyonlarını ölçmenin önemli olduğunu unutmamak gerekir.Bu teknik geliştirildikten sonra, hücre sinyalleme alanındaki araştırmacıların spesifik iletim yollarını ve bunların homeostatik düzenlemedeki rollerinin yanı sıra hastalık ilerlemesine katkılarını keşfetmelerine öncülük etmiştir. Radyoaktif malzemelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür gerçekleştirilirken kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

assaying-protein-kinase-activity-with-radiolabeled-atp

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Lösin Zengin Kinaz 2 tekrarlayın büyük bir multidomain kinaz, mutasyonlar olan Parkinson hastalığı, en sık rastlanan genetik nedenidir. Bu protein kinaz aktivitesinin analizi, biyoloji ve bu protein disfonksiyonu anlamada çok önemli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu...

LRRK2 Kinaz Aktivitesi Assaying In vitro</em

Solunum ve oksidatif fosforilasyon ile ve hücre canlılığı üzerindeki ilişkili mitokondriyal fonksiyonları üzerinde, protein kinaz C (PKC), izozimlerinin aktivasyon etkisi tarif edilmektedir. Yaklaşım seçici olarak mitokondriyal işlev ve hücre enerji durumunu belirlemek için birincil hücre kültürü deneyleri ve çeşitli PKC izozimleri overexpress için adenoviral teknik uyum sağlar.

Böbrek Hücreleri aşırı eksprese eden protein kinaz C izozimlerinin Mitokondriyal Fonksiyonlar ve Hücre Canlılık Değerlendirilmesi

Bu videoda, radyoaktif işaretli nükleotidler kullanarak pirofosfokinaz aktivitesini belirlemek için ince tabaka kromatografisi tabanlı bir enzim testi gösterilmektedir. Yöntem, nükleotid sentezi ve fosfotransfer reaksiyonları hakkında bilgi sağlar.

İnce Tabaka Kromatografisine Dayalı Enzim Aktivitesi Deneyi: İnce Tabaka Kromatografisi Kullanılarak İn Vitro Pirofosfokinaz Aktivitesini Belirleme Tekniği

Lösin açısından zengin tekrar kinazlar 1 ve 2 (LRRK1 ve LRRK2) GTPaz ve kinaz alanları hem kodlama yapan ve hücrelerde fosforile edilmiş olan alanlı proteinlerdir. Burada, bu şekilde genel hücresel fosforilasyonunu seviyelerini ölçmek için bir araç sağlayan 32P ortofosfat ile hücrelerde LRRK1 ve LRRK2 etiketlemek için bir protokol mevcut.

Lösin zengin metabolik etiketleme Fosfat ile radyoaktif Kinazlar 1 ve 2, tekrar

in vitro ATPase aktivitesini ölçmek için temel bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, belirli bir saflaştırılmış ATPaz için aktivite düzeyine ve gereksinimlere göre optimize edilebilir.

ölçme<em&gt; İn Vitro</emEnzimatik Karakterizasyonu için&gt; ATPaz Aktivitesi

Saflaştırılmış bakteriyel histidin kinazların otofosforilasyonunu ölçmek için kullanılabilecek optimize edilmiş bir nitroselüloz bağlanma testini rapor ediyor ve gösteriyoruz. Yöntemimiz, geleneksel SDS-PAGE tabanlı tekniklere göre çeşitli avantajlara sahiptir ve bu önemli proteinleri karakterize etmek için değerli bir alternatif sunar.

bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi

Peptid rekabet testleri, çeşitli moleküler ve immünolojik deneylerde yaygın olarak kullanılır. Bu makale , in vitro oligopeptitle rekabet eden kinaz testi için ayrıntılı bir yöntem ve ilgili fosforilasyon sitelerini bulmak için yararlı olabilen ilişkili validasyon prosedürlerini açıklamaktadır.

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Burada, histidin öğesini pyrophosphokinase enzimler arındırıcı ve ince tabaka Kromatografi radiolabelled yüzeylerde ve ürünler için enzimatik aktivite içinde vitrotahlil kullanan bir yöntem açıklanmaktadır. Enzim etkinliği tahlil herhangi bir kinaz, nükleotit cyclase veya nükleotid trifosfat hidroliz olan mekanizma içerir fosfor-devret tepki genel olarak geçerlidir.

Bir arınma ve In Vitro etkinliği tahlil için (p) ppGpp sentetaz Clostridium difficile üzerinden

Biz güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak yeni bir kinaz protein karakterize: farklı hücre hatları ve dokularda adanmış spesifik antikor ile Batı Blot analizi, coimmunoprecipitation deneyler ile etkileşimler, Batı tarafından tespit kinaz aktivite Fosho spesifik antikor ve γ [32P] ATP etiketleme kullanarak Blot.

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Bu protokol, küçük DNA ve RNA yüzeyleri üzerinde polinükleotid kinazların (PNKs) kinaz aktivitesini ölçmek için radyoaktif olmayan bir testi tanımlar.

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Öğrenin, radyoaktif ATP kullanarak protein kinaz aktivitesini ölçme yöntemini. Bu çok yönlü ve nicel teknik, hücresel sinyal yolaklarını anlamak için değerli bir araçtır.

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Daha fazla video keşfet