Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Kullanarak Sıçanların Periton Membranındaki MikroRNA İfadesinin Saptanması

Bu prosedürün genel amacı, sıçan periton zarındaki miRNA'ları başarılı bir şekilde saflaştırmak ve tespit etmektir. Bu işleme başlamak için,% 4 izofluran ile inhalasyon anestezisinden sonra. Farenin karın derisine %70 etanol püskürtün ve mantar tabakasının üzerine sırt üstü monte edin.

Daha sonra makas ve forseps kullanarak hayvanın karın derisinde, kasında ve periton zarında uzunlamasına bir kesi yapın. Forseps kullanarak periton zarını kaldırın ve diyaframın altındaki en alt kaburga kemiği boyunca üst kısmında yatay kesiler yapın. Ve cerrahi makası kullanarak yan bölgede alt tarafında.

Ardından, cerrahi makası kullanarak periton zarını vücuttan çıkarmak için yanal uzunlamasına kesiler yapın. Daha sonra bir petri kabında PPS ile yıkayın. 20 miligram periton zarı örneğini kesin ve kesin.

Bu prosedürde, 20 miligramlık bir periton membranı numunesini bir cam homojenizatöre yerleştirin. Ve 700 mikrolitre fenol guanidin bazlı lizis reaktifi ekleyin. Bundan sonra, periton zarı numunesini buz üzerinde, büküm ile numunenin üzerine bir havaneli bastırarak yavaşlatarak homojenize edin.

Periton zarı numunesi fenol guanidin bazlı lizis reaktifi içinde tamamen çözünene kadar bu işlemi birkaç düzine kez tekrarlayın. Daha fazla homojenizasyon için, homojenize lizatı iki mililitrelik bir toplama tüpündeki mikro santrifüj döndürme kolonundaki bir biyo-polimer parçalama sistemine aktarın. Daha sonra dört santigrat derecede üç dakika boyunca 14.000 kez G'de santrifüjleyin.

Daha sonra homojenize lizatı yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Homojenize lizata 140 mikrolitre kloroform ekleyin ve tüpü sıkıca kapatın. Daha sonra, tüpü 15 saniye ters çevirerek karıştırın.

Daha sonra, numuneyi oda sıcaklığında iki ila üç dakika inkübe edin. Bunu takiben, dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 12.000 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanın 300 mikrolitresini, çökelticiyi bozmadan yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Ve 450 mikro litre% 100 etanol ekleyin. Daha sonra numuneyi beş saniye boyunca girdaplayarak karıştırın. Daha sonra, 700 mikro litreye kadar numuneyi, iki mililitrelik bir toplama tüpüne yerleştirilmiş silikon membran bazlı bir döndürme kolonuna pipetleyin ve kapağı kapatın.

Daha sonra 15 saniye boyunca 15.000 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, toplama tüpündeki akışı atın. Ardından, numuneyi sıkı bir şekilde yıkamak ve kapağı kapatmak için silikon membran bazlı döndürme kolonuna 700 mikrolitre yıkama tamponu 1 ekleyin.

15 saniye boyunca 15.000 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, toplama tüpündeki akışı atın. Tuz kalıntılarını gidermek için silika membran bazlı döndürme kolonuna 500 mikrolitre yıkama tamponu 2 ekleyin ve kapağı kapatın.

Daha sonra 15 saniye boyunca 15.000 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, akışı ve toplama tüpünü atın ve bu işlemi tekrarlayın. Daha sonra, silika membran bazlı spin kolonunu bir dakika boyunca 15.000 kez G'de tekrar santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, toplama tüpünü ve herhangi bir akışı atın. Silika membran bazlı döndürme kolonunu yeni, bir nokta beş mililitrelik toplama tüpüne yerleştirin. Daha sonra 25 mikrolitre RNase içermeyen suyu kolona aktarın ve kapağı kapatın.

Numuneyi oda sıcaklığında beş dakika bekletin. Bir dakika boyunca 15.000 kez G'de santrifüjleyin. Bunu takiben, toplam RNA'yı içeren 25 mikrolitrelik aloueti yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve kullanmadan önce eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Bu prosedürde, tüp başına toplam 8 mikrolitre olmak üzere iki mikrolitre 10x nükleik asit karışımı, iki mikrolitre ters transkriptaz karışımı ve dört mikrolitre 5x Hispec tamponu içeren bir ana karışım çözeltisi hazırlayın. Daha sonra her bir tüpe 8 mikrolitre ana karışım çözeltisi dağıtın. Bir Spektrofotometre kullanarak toplam RNA'ların miktarını ölçün.

Daha sonra, periton zarı örneğinden saflaştırılan izole edilmiş toplam RNA'ların bir mikrogramını her tüpe ekleyin. Bunu takiben, toplam 20 mikrolitreye getirmek için her tüpe RNaz içermeyen su ekleyin. Daha sonra pipetleyerek iyice karıştırın ve 15 saniye santrifüj edin.

Bunu takiben, numuneyi 37 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin. Daha sonra 95 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Yeni üretilen cDNA'yı yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve RNaz içermeyen su ile 10 kez seyreltin.

Bu prosedürde, her kuyucuk için 12 nokta beş mikrolitre 2x PCR ana karışımı, nükleaz içermeyen suda çözülmüş her bir miRNA primerinden iki nokta beş mikrolitre beş mikrolitre beş mikromolar ve bir nokta iki beş mikrolitre 10x evrensel astar içeren bir ana karışım hazırlayın. Bu ana karışımın 22 nokta beş mikrolitresini 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dağıtın. Sonra her bir oyuğa iki nokta beş mikrolitre şablon cDNA ekleyin.

96 kuyulu reaksiyon plakasını bir parça film ile kapatın. Daha sonra 30 saniye boyunca 1.000 kez G'de santrifüjleyin. PCR döngü programını çalıştırmak için plakayı gerçek zamanlı PCR cihazına ayarlayın.

Gerçek zamanlı PCR yazılımında, deneysel özellikleri tanımlayın. Ardından, numunelere isimler atayın ve her bir oyuktaki miRNA'ları hedefleyin. Ardından, gerçek zamanlı PCR yazılımında, talimatlara uygun olarak 20 mikro litrelik bir reaksiyon hacmi ve aşağıdaki PCR döngü koşullarını girin.

15 dakika boyunca 95 santigrat derecede ön inkübasyon. Ve sonra 15 saniye boyunca 94 santigrat derecede 40 döngü denatürasyon ve 30 saniye boyunca 55 santigrat derecede diz çökme ve 30 saniye boyunca 70 santigrat derecede uzatma. MiRNA, mikro dizi taramasına dayanarak, altı miRNA'nın seviyelerinin, peritoneal fibrozis sıçanlarının periton zarında, bu makalede sunulan protokolü takiben, QRTCPR kullanılarak sahte sıçanlar ve kontrol sıçanlarındakilere kıyasla önemli ölçüde arttığı bulunmuştur.