Name: Zebra balığı Situ Omurilik Omurilik duyusal ve motor nöronlar gelen Elektrofizyolojik Recordings Hazırlık (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Öğrenin zebra balığı omurilik nöronlarından elektrofizyolojik kayıtlar için in situ hazırlama yöntemini. Bu teknik embriyonik ve larval evrelerde duyusal ve motor nöronların incelenmesine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, (ABR&#39;ye RLM ve R01NS25217 ve P30NS048154 için F32 NS059120) NIH hibe ile desteklenmiştir.

Yazarlar herhangi mali çıkarlarını beyan ederim.

Burada tarif edilen yöntemler, omuriliğin en az diseksiyon sonra zebra balığı embriyolarının duyu ve motor nöronların elektriksel ve morfolojik özelliklerini belirlemek için izin verir. Nöronlar, en az 1 saat, bu kayıtların üzerine uygulanan süre sağlıklı kalması. Nöronlar, standart tam hücre konfigürasyonu kullanılarak kaydedilmiştir da çekirdekli yamalardan gibidir; ikinci yöntem iyon akımlarının 9 detaylı bir biyofiziksel çalışma engelleyebilirler yer kelepçe sorunları en aza indirir. <p c...

<html> George Streisinger, omurgalı gelişimi 10 genetik analizi için bir model sistem olarak yaygın zebrabalıkları olarak bilinen Danio rerio kullanımını öncülük etmiştir. Model de dahil olmak üzere birçok avantaj sunmaktadır: (1) nispeten basit ve pahalı olmayan bir hayvancılık; (2) dış gübreleme, erken olgunlaşma aşamalarındaki embriyolar kolay erişim sağlayan; ve (3) saydam bir embriyo, oluştuklarında hücreler, dokular ve organlarda doğrudan ve tekrar gözlemler imkan verir. takip eden yıllarda, birçok ilerlemeler daha da zebrabalıkları modelin gücünü artırmıştır. Özellikle, ileri genetik ekranlar ve tam genom dizileme çabalar çok gelişim süreçleri 11, 12, 13, 14 mutasyonlar ve kritik genlerin tanımlanmasında önemli roller oynadığı,&quot;&gt; 15, 16. Gateway klonlama yöntemleri transkripsiyon aktivatörü gibi (TALENS) ile örneklenen,. Transgenik rutin bir uygulama 17, 18 yaklaşır genom düzenleme son ilerlemelere ve kümelenmiş düzenli aralıklı bırakılmış kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) -Cas9 nükleazlar, mutasyonların hedeflenen giriş için izin, hem de knock-out ve knock-in 22. Kombine, bu yöntemler Zebra balığı belirli davranışları ve çok sayıda insan hastalıkların altında yatan genetik mekanizmaların çalışma için güçlü bir model yapmak, 21, 20, 19 yaklaşır 23, 24, 25, 26, 27. Bu eser geliştirmek odaklanırZihinsel düzenleme ve nöronal gelişim elektriksel aktivitenin rolü. Odak Zebra balığı modeli çeşitli avantajlar sağladığı için omurilik üzerindedir. Birincisi, embriyonik ve larva aşamasında zebrafish erişmek için nispeten kolaydır; Dolayısıyla, bir eksik nöronlar ve daha basit devreyi 28, 29 sahip gelişimsel aşamalarında omurilik fonksiyonunu çalışabilirsiniz. Ayrıca, zebra balığı omurilik transkripsiyon karakteristik ve ayırt edici desen ile gösterilir, 30, 31, 32, 33, 34, 35 faktörler gibi diğer omurgalı benzer nöronların, çeşitli bir grubu vardır. omurilik devrelerinin fonksiyonunu altında yatan mekanizmaları ortaya çıkarmak amacı zebrafish çalışmaların büyük çoğunluğu, özelliklelokomosyonunu destekleyen olanlar, anlaşılır larva aşamalarında 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 odaklandık. Bununla birlikte, omurilik lokomotif ağları oluşturan nöronların çok erken evrelerinde de farklılaşmasını başlatmak, ~ 9-10 saat sonra fertilizasyon (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. Bu bakışa göre, spinal nöronların morfolojik ve elektriksel özellikleri ortaya ve embriyonik ve larva aşamaları arasında değişiklik bir Overa için önemli olan, anlamayarak nasıllokomotor devre oluşumu ve işlevi ll anlama. Burada tarif edilen yöntemler, diseksiyon spinal nöronların yama kelepçe kayıtları sağlamak ve başarılı bir şekilde embriyonik aşamada (~ 17-48 büyük büyütme) ve larva aşamalarında (~ 3-7 gün sonra döllenme [dpf]) de uygulanmıştır. Bu yaklaşım ilgi nöronların erişim sağlamak için gereken diseksiyon miktarını sınırlar. Protokol kayıt odasına embriyo ya da larva takmak için, oldukça ince bir tungsten iğnesi, kullanılan bu veteriner dikiş yapıştırıcı zebra balığı, spinal nöronların kayıt için diğer yayınlanmış yöntemlerin çoğunda farklıdır. İki farklı yaklaşımların kullanılabilirliği (yani, tungsten pimi karşı sütür tutkal) elektrofizyolojik analizi için zebrafish embriyolar veya larva monte etmek için alternatif seçenekler araştırmacılar kendi özel deneysel hedeflere ulaşmak için sağlar. İlk olarak, bir pop erişmek ve kayıt prosedürleri<html> birincil duyu nöronlarının ABS ayarlaması, Rohon-Sakal hücreler tarif edilir. Bu nöronların hücre gövdeleri dorsal omurilik içinde yalan. Rohon-Sakal hücreleri, çok sayıda omurgalı türlerinde de mevcuttur erken gelişim ayırt ve embriyonik dokunun yanıtı 6, 44, 47, 48 altında yer alır. İkinci olarak, erişim ve spinal motor nöron kayıt prosedürleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Zebra balığı spinal motor nöronlar nöron iki dalgaları sırasında ortaya çıkar. Daha önce doğumlu primer motor nöronların hemisegment 45, 46, 49 başına mevcut 3-4 primer motor nöron, gastrülasyon (~ 9-16 HPF) sonunda ortaya çıkar. Bunun aksine, ikinci motor nöron Daha sonra doğan popülasyonu daha çok ve ~ 14 büyük büyütme başlayarak uzun bir süre sırasında ortaya çıkanef &quot;&gt; 45, 50. orta gövde bölümlerinin sekonder motor nöron oluşum en çok 51 büyük büyütme 50 ile tamamlanır. İkincil motor nöronlar amniotları motor nöronlarının muadili olarak kabul edilir 46. İlginç bir şekilde, omurga üstünde nöronlar, dopamin ile, lokomosyon düzenleyen larva ve ikinci motor nöron oluşumu embriyo ve genç larva 50, 51. birincil ve ikincil motor nöronlar her biri birçok farklı alt tipi içerirler. her bir primer motor nöron alt tipi projeleri basmakalıp bir sonuçlanan karakteristik kas grubu uyaran çevresel bir akson, aksonal yörünge tanımlanması. Genel olarak, ikinci motor nöronlar, daha önce birinci motor nöronlar tarafından kurulan aksonal yolları takip ederler. bu nedenle, aksonal yörüngeleri ile ilgili olarak, birinci ve ikinci motor nöronların haricinde, benzer olduğu aksonal kalınlığı ve somata boyutuprimer motor nöronlar 45 için daha büyük yeniden. Üçüncüsü, internöron birkaç türlerinden kayıt için yöntemler tartışılmaktadır. Bununla birlikte, bu gibi durumlarda, diğer omurilik hücreleri çıkarılması için sınırlı bir miktarda gereklidir ve bu nedenle omurilik Rohon-Sakal hücreleri veya motor nöron kayıtlar için daha az sağlamdır.

<table><tbody><tr><td>Vakum filtresi / Saklama şişesi, 0,22 mm gözenekli</td><td>Corning</td><td>431096</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtresi 0,2 mm</td><td>Whatman</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>Trikain</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu&nbsp;</td></tr><tr><td>&alpha;-bugarotoksin</td><td>Tocris</td><td>11032-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoksin</td><td>Tocris</td><td>4368-28-9</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-549 hidrazin tuzu</td><td>Moleküler Problar</td><td>A-10438</td><td>floresan boya</td></tr><tr><td>Spin-X santrifüj tüpü filtresi</td><td>Corning</td><td>8161</td><td></td></tr><tr><td>Cam mikroskop slaytı</td><td>Fisher</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard silikon elastomer kiti</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td>silikon elastomer</td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal damarlar</td><td>Harvard Aparatı</td><td>30-0038</td><td>0,78 ve 1,0 mm iç ve dış çaplar (ince cidarlı cam kılcal damarlar)</td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal damarlar</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000-100</td><td>1.13 ve 1.55 mm iç ve dış çaplar (kalın duvarlı cam kılcal damarlar)</td></tr> <tr><td>Minyatür dikenli polipropilen bağlantı parçası&nbsp;</td><td>Cole-Palmer</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond doku yapıştırıcısı&nbsp;</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Mikroelektrot çektirme</td><td>Sutter Instruments</td><td>&nbsp; Model P-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Amplifikatör</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Baş aşama</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Motorlu mikromanipülatör&nbsp; &nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Tygon boru</td><td>Fisher</td><td>14-169-1B</td><td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN ve WALL 1/32 IN (esnek laboratuvar boruları)</td></tr> <tr><td>Elektrot tutucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>1-HC-U</td><td></td></tr><tr><td>Pharmaseal Üç Musluklar&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>K75</td><td></td></tr><tr><td>Sayısallaştırıcı</td><td>Axon Instruments Digidata</td><td>1440A</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 FS plus</td><td></td></tr><tr><td>40X/0.80W Achroplan objektif</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veri toplama ve analiz yazılımı&nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>PClamp 10 - Clampex ve Clampfit&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme Sutter</td><td>Aletleri</td><td>Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td colspan="4">Diseksiyon ve Kayıt Çözümleri (mM cinsinden)</td></tr><tr><td>Hücre içi hariç tüm çözeltiler süzüldüğünde (0,22 mm filtre kapları) ve oda sıcaklığında (RT) saklandığında ~ 2-3 ay stabildir.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre içi çözelti süzülür (0.2 mm şırınga filtreleri) ve donmuş olarak saklanır (-20 °C C) kullanım gününde ayrı ayrı çözülen küçük alikotlarda.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon / Zil Sesi' s çözeltisi</td><td></td><td></td><td>145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl<alt>2</alt>.2H<alt>2</alt>O, 10 HEPES; pH 7.4 (NaOH ile</td></tr><tr><td>)Pipet (hücre içi) kayıt çözeltisi</td><td></td><td></td><td>135 KCl, 10 EGTA asidi, 10 HEPES; pH 7.4 (KOH ile).</td></tr><tr><td>Banyo (hücre dışı) kayıt çözeltisi / voltaj ve akım kelepçesi</td><td></td><td></td><td>125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl 2.2H 2 O, 5 HEPES; pH 7.4 (NaOH ile).</td></tr><tr><td>Alexa-594 hidrazin tuzu stok çözeltisi.</td><td></td><td></td><td>ddH2O, aliquot (~100 &mikro; l) ve -20 ° C'de saklayın. Kullanım için, 132 kat çözelti içindeki stoğu pipet çözeltisi ile 100 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltin. Seyreltmeden sonra, pipet çözeltisi içeren Alexa-594'ü filtreleyin&nbsp; bir santrifüj tüpü filtresi ile.</td></tr><tr><td><güçlü > Adı< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü ></td></tr> <tr><td>< güçlü > İmmobilize edici ajanlar< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>% 0.4 etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu (Trikain)</td> <td>0.2 M Tris, pH 9 (0.4 g Trikain / 100 mL 0.2 M Tris)</td><td></td><td></td> içinde% 0.4 stok çözeltisi hazırlayın</tr><tr><td colspan="4">NaOH ile pH'ı 7'ye ayarlayın ve -20 °C'de saklayın.</td></tr><tr><td colspan="4">Kullanım için, stok çözeltisini embriyo ortamında ~ 25 kat seyreltin</td></tr><tr><td>250 mM &alfa;-bungarotoksin</td><td></td><td></td><td>ddH2O (1 mg / 500 mL) içinde 250 mM'lik bir stok hazırlayın, 100 & mikro hazırlayın; L alikotlar ve -20 ° C'de sotre.</td></tr><tr><td colspan="4">Kullanım için, hücre dışı çözelti ile 2.500 kat seyrelterek 100 nM'lik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltin.</td></tr><tr><td>1 mM Tetrodotoksin</td><td></td><td></td><td>ddH2O'da (1 mg / 3 mL) 1 mM stok hazırlayın, 100 & mikro hazırlayın; L alikotlar ve -20 ° C'de sotre.</td></tr><tr><td colspan="4">Kullanım için, hücre dışı çözelti ile 500 nM'lik bir nihai konsantrasyona kadar 2.000 kat seyreltin.</td></tr></tbody></table>

zebra balığı<em&gt; situ</em&gt; omurilik omurilik duyusal ve motor nöronlar gelen elektrofizyolojik recordings hazırlık

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

İlk gelişimsel model olarak tanıtılan Zebra balığı, diğer pek çok alanda popülerlik kazanmıştır. hızla gelişen organizma çok sayıda büyütme kolaylığı, embriyonik optik netlik ile birlikte, bu modelin ilk zorlayıcı nitelikleri olarak görev yaptı. Son yirmi yılda, bu modelin başarısı daha da büyük ölçekli mutajenez ekranlarına kendi uyumluluğuyla ve transgenesis kolaylığı ile tahrikli edilmiştir. Daha yakın zamanlarda, gen düzenleme yaklaşımlar modelinin gücünü genişletmiştir. nöro çalışmalar için, zebra balığı embriyo ve larva birden çok yöntem uygulanabilir olan bir model sunmaktadır. Burada, nöronların, elektrik eksitabiliteye temel bir özelliğinin çalışma izin yöntemleri üzerinde durulacak. Zebra balığı spinal nöronların elektrofizyolojik çalışma için Bizim hazırlık bir kayıt odasına hazırlık sabitlemek için veteriner dikiş tutkal kullanımını içerir. kayıt için alternatif yöntemlerzebra balığı embriyolarının ve larva ince bir tungsten pimi 1, 2, 3, 4, 5, kullanılarak bölmesine hazırlama eki içerir. O kadar 4 larva dorsal tarafına monte etmek için kullanılmış olsa da bir tungsten pim çoğunlukla, bir yanal yönde hazırlama monte etmek için kullanılır. dikiş tutkal her iki doğrultuda embriyolar ve larvaları monte etmek için kullanılmıştır. tutkal kullanılarak, en az bir diseksiyon ve böylece sonuç olarak ortaya çıkan zarar vermeden, bir enzimatik işlem kullanılmadan spinal nöronlar erişimi sağlayan, gerçekleştirilebilir. Ancak, larva için, omuriliği çevreleyen kas dokusu çıkarmak için kısa bir enzim tedavisi uygulamak gerekir. Burada tarif edilen yöntemler, birçok developmentÃ motor nöronlar, internöronlar ve duyu nöronlarının içsel elektriksel özelliklerini incelemek için kullanılmıştırL 6, 7, 8, 9 aşamaları.

Başarıyla dpf larvaları ile 7 17 büyük büyütme embriyolar Rohon-Sakal nöronlardan kaydettik (Şekil 5A ve 5B). Rohon-Sakal hücreler kaydedildi preparasyon sırt tarafı yukarı monte edilmiştir. Bu tür montaj bunların yüzeysel sırt konum ve büyük soma boyutlarına göre Rohon-Sakal hücrelerinin açık tanımlanmasına izin verir. Kimlik ek bu nöronların basmakalıp hiperpolarize dinlenme membran potansiyelinin (Şekil 5, ek tablo) <sup clas...

Bu yazıda zebra balığı embriyolarının ve larva spinal nöronların elektrofizyolojik kayıtları için yöntemleri tarif eder. Hazırlık yerinde nöronları korur ve genellikle asgari diseksiyonu kapsar. Bu yöntemler, erken larva aşamalarında ilk elektrik uyarılma alımından spinal nöronların çeşitli elektrofizyolojik çalışmaları için izin verir.

Zebra balığı<em&gt; Situ</em&gt; Omurilik Omurilik duyusal ve motor nöronlar gelen Elektrofizyolojik Recordings Hazırlık

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Bu hazırlığın genel amacı, embriyonik ve larval aşamalardaki zebra balığı spinal nöronlarının in situ elektrofizyolojik çalışmasına olanak sağlamaktır. Elektrofizyolojik analizler, zebra balığı modeliyle mümkün olan güçlü genetik ve görüntüleme yaklaşımlarını tamamlamaktadır. Yöntem başlangıçta rohon sakalı nöronlarını incelemek için geliştirilmiş olsa da, zaman içinde yaklaşımı kolayca adapte ettik ve artık çeşitli spinal nöron tiplerini inceleyebiliyoruz.Prosedürü, uzun yıllardır birlikte çalışma fırsatı bulduğum araştırma görevlisi Dr. Rosa Moreno gerçekleştirecek. Bu prosedüre başlamak için bir cam delikteki siyah pompayı çıkarın ve yerine başka bir cam delikten beyaz bir kauçuk adaptör takın. Ardından, esnek bir tüpten yaklaşık 38 santimetre uzunluğunda bir parça kesin.Ardından, esnek tüpü küçük, düz bir polipropilen bağlantı parçası aracılığıyla takın. Silikon elastomeri hazırlamak için, baz ve kürleme ajanını plastik konik bir tüpe dört bir oranında ekleyin. Sonrasında, elastomer bazını ve kürleme ajanını iyice karıştırın.Karışımı, iki adet 100 milimetrelik Petri kabına, bir tanesinde yaklaşık bir milimetre, diğerinde ise yaklaşık 2,5 milimetre derinliğe gelecek şekilde dökün. Silikon elastomerin havaya maruz bırakılarak dört ila beş gün boyunca kürlenmesini bekleyin. Kürlenmiş elastomere daha erken ihtiyaç duyulursa, 60 degrees Celsius sıcaklıkta inkübe edin.Ardından, odacığın tabanı olarak kullanılmak üzere, 1 mm kalınlığındaki kürlenmiş elastomerden 3,8 cm x 6,3 cm boyutlarında bir dikdörtgen kesin. 2,5 mm kalınlığındaki kürlenmiş silikondan 3,8 cm x 6,3 cm boyutlarında bir dikdörtgen kesin. Daha sonra bunun içinden, odacığın üst kısmı için bir çerçeve oluşturmak amacıyla 2,5 cm x 5 cm boyutlarında bir dikdörtgen kesin.Diseksiyon kayıt odasını oluşturmak için ince silikon dikdörtgeni, silikon ile cam arasında hava kabarcığı kalmadığından emin olarak doğrudan cam lamın üzerine yerleştirin. Ardından, silikon dikdörtgen çerçeveyi ince alt silikon tabakasının üzerine yerleştirin. Bu prosedürde, bir embriyoyu iki ila üç mililitre ringer çözeltisi içeren bir diseksiyon odasına yerleştirin.Hazneye 100 µL %0,4'lük trikain çözeltisi ekleyerek embriyoyu immobilize edin. Ardından, bir mikro pipet çekici kullanarak ince duvarlı camdan uzun ve ince uçlu bazı enjeksiyon mikro pipetleri çekin. Çekilen cam mikro pipeti, yapıştırıcı dağıtıcının cam tabanına sabitleyin.Diseksiyon mikroskobu altında, cam mikro pipetin ucunu yaklaşık 75 µm çapında bir uç oluşacak şekilde cımbızla kırın. Ardından, ağız parçası aracılığıyla vakum uygulayarak cam mikro pipete üç ila beş µL tutkal doldurun. Tutkal dolu ucu diseksiyon haznesine getirin.Ardından, ağız borusu aracılığıyla mikro pipete hafif pozitif basınç uygulamaya devam ederken, yapıştırıcı yüklü mikro pipetin ucunu embriyonun başına yaklaştırın. Uç embriyonun başına yaklaştığında, haznenin tabanına küçük bir damla yapıştırıcı boşaltmak için yeterli pozitif basınç uygulayın. Embriyonun başı yapıştırıcıyla temas edecek şekilde, embriyoyu yapıştırıcı damlasına doğru hareket ettirmek için bir disseksiyon iğnesi kullanın.Embriyoyu dorsal tarafı yukarı gelecek şekilde yönlendirin ve yapıştırıcı ile iyi temas sağladığından emin olmak için baş kısmına bastırın. Yapıştırıcı yavaşça sertleşirken, embriyoyu ventral tarafı aşağı, dorsal tarafı yukarı gelecek şekilde yeniden konumlandırmak için diseksiyon iğnesini kullanın. Diseksiyon iğnesini yapıştırıcı damgasuna batırın ve embriyonun konumunu daha fazla sabitlemek için baş kısmının üzerinden ve karşına birkaç yapıştırıcı ipliği çekin.Kafa silikona güvenli bir şekilde sabitlendikten ve yapıştırıcı katılaştıktan sonra, başka bir cam mikro pipet ile arka beyin seviyesinden keserek embriyoyu feda edin. Yeni bir cam mikro pipet kullanarak, arka beynin kaudal kısmındaki deri bölgesini birkaç kez yüzeysel olarak kesin. Dorsal olarak monte edilmiş örnekler için gövdenin her iki yanında, lateral olarak monte edilmiş örnekler için ise gövdenin açıkta kalan tarafında, pipeti rostro-kaudal eksene dik hareket ettirerek deriyi yüzeysel olarak delin.Cımbızla tutulabilecek bir deri flebi oluşturmak için, başlangıç kesisi seviyesinde ve buna dik olacak şekilde deriyi mikro pipetle birkaç kez kazıyın. Cımbız kullanarak deri flebini yavaşça kaldırın ve deriyi kaudal yöne doğru çekin. Ardından, embriyonun kuyruk kısmına yakın bir noktaya küçük bir damla yapıştırıcı uygulayın.Kuyruğu diseksiyon haznesinin altına sabitlemek için bu yapıştırıcıyı kullanın. Yapıştırıcı sertleşirken, gövdenin dorsal yönde kaldığından ve hazneye sıkıca tutturulduğundan emin olmak için diseksiyon iğnesi ile gövdenin konumunu ayarlayın. Bu ilk diseksiyondan sonra, trikayni ve kalıntıları temizlemek için preparatı ringer çözeltisi ile iyice durulayın ve preparatın beş dakika boyunca dinlenmesini sağlayın.Ardından, diseksiyon solüsyonunu hücre dışı kayıt solüsyonu ile değiştirin. Gerekiyorsa, preparata bir immobilizasyon ajanı ekleyin. Daha sonra, monte edilmiş embriyoyu içeren diseksiyon haznesini, 40 X su daldırma uzun çalışma mesafeli objektif ile donatılmış dik bir bileşik mikroskobun tablasına aktarın.Ardından, silikat kalın duvarlı cam mikro pipetin boş bir ucunu baş aşamasının elektrot tutucusuna monte edin. Tüpün bir ucunu elektrot tutucusunun hava çıkışına, diğer ucunu ise üç yollu bir musluğa bağlayın. Bundan sonra, başka bir tüp parçasının bir ucuna bir ağızlık yerleştirin ve diğer ucunu üç yollu musluğa bağlayın.Ardından, mikropipet ucunu omuriliğin en dorsal kısmına getirin ve meningesleri nazikçe delin. Meningesleri gevşetmek için hızlı, kısa ve yanlara doğru hareketlerle devam edin. Mikropipet ucu meningesleri geçtikten sonra, meningesleri omurilikten uzaklaştırmak için mikropipeti ilerletip yukarı kaldırın.Ardından, rohon beard hücrelerini açığa çıkarmak için mikropipeti bir ila iki hemi segment ilerleterek rostral yöne doğru hareket ettirin. Deneyimlerimize göre, rohon beard nöronları diğer spinal nöronlara göre daha kırılgandır. Bunların sağlıklı kalmasını sağlamak için her seferinde bir veya iki rohon beard hücresini açığa çıkarıyoruz.Döllenmeden sonraki bir, iki ve yedi günlük embriyolardaki ve larvalardaki rohon beard nöronlarından dışa ve içe doğru akımların voltaj klemp kayıtları elde edilmiştir. Tutma potansiyeli 80 milivolt olarak belirlenmiş ve akımlar, pozitif 20 milivolta doğru bir depolarizasyon basamağı ile tetiklenmiştir. Akım klemp modunda, bir milisaniye boyunca uygulanan 0,35 nano amp akım enjeksiyonu, hem embriyolarda hem de larvalarda rohon beard nöronlarından tek bir aksiyon potansiyeli oluşturmaktadır.Elektriksel stimülasyon olmadığında, rohon beard nöronları spontane spike göstermezler. Gelişim ilerledikçe, rohon beard nöronlarının dinlenme potansiyeli giderek daha negatif hale gelir. Bu yöntem ustalıkla uygulandığında, embriyolar 10 dakika içinde monte edilip disseke edilerek rohon beard yapıları açığa çıkarılabilir.Protokolde belirtildiği gibi, yapıştırıcının ne kadar hızlı sertleşeceğini belirleyen faktörleri anlamak önemlidir. Bu video, zebra balıklarındaki spinal nöronlardan kayıt alma işleminin kritik adımlarını vurgulamaktadır.

zebrafish-situ-spinal-cord-preparation-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Larvaların zebrafish spinal motor nöron ve hedef iskelet kası aynı anda yama kelepçe kayıt izin vermek için ilk omurgalı model sistemi temsil eder. Bu video segmental CaP motor nöron ve hedef kas hücrelerinin yanı sıra, her bir hücre tipi kayıt için metodolojiler tanımlamak için kullanılır mikroskobik yöntemler göstermektedir.

Motor-nöron Paired Patch Kelepçe Kayıtlar ve Zebra balığı Hedef İskelet Kası

Bu video, zebra balığı embriyolarında motor nöronların elektrofizyolojisini incelemek için invaziv olmayan bir testi göstermektedir. Omurilik motor nöronlarının spontan depolarizasyonu sonucu embriyolarda kuyruk koilinin ölçümü yapıldıktan sonra, koilleme frekansını azaltmak için bir sodyum kanal blokeri uygulanır. Daha sonra, embriyolar agaroz içinde hareketsiz hale getirilir ve bir floresan mikroskobu altına yerleştirilir. Genetik olarak tasarlanmış motor nöronlar, bir donör ve bir alıcı...

Zebra Balığı Embriyolarında Motor Nöronların Elektrofizyolojisini İncelemek İçin İnvaziv Olmayan Bir Yaklaşım

Bu video, felçli bir zebra balığı larvasındaki afferent nöronlardan gelen elektrik sinyallerinin, lateral hat ganglionunun yakınına bir mikropipet yerleştirerek ve sinyal yakalama için gevşek bir conta oluşturarak kaydedilmesini göstermektedir. Hücre dışı çözelti, bu işlem sırasında nöronal canlılığı korur.

İmmobilize Bir Zebra Balığı Larvasında Afferent Nöronlardan Gelen Elektrik Sinyallerinin İzlenmesi

Larva zebrafish önbeyin ekstrasellüler alanın potansiyellerini kaydetmek için basit bir yöntem tarif edilmiştir. Yöntem, bir sağlam...

Larva Zebra balığı olarak önbeyin Elektrofizyolojik Kaydı

Zebra balığı embriyolarının Mauthner nöronlar ve diğer reticulospinal hücrelerden yama kelepçe kayıt yoluyla elektriksel aktivitesini kaydetmek ve izlemek için sağlam bir beyin-omurilik hazırlık geliştirdik. Böylece, gelişmekte olan embriyo anahtar nöronlardan eksitatör ve inhibitör sinaptik akımları, voltaj-kapılı kanal aktivitesini ve aksiyon potansiyelleri kayıt edebiliyoruz.

Embriyonik Zebra balığı Mauthner Hücreler Patch Kelepçe Kayıtlar

Çoğalma, desenleme, farklılaşma ve akson rehberlik gibi gelişimsel süreçleri kolaylıkla Zebrafish omurilikte örnek alınabilir. Bu yazıda, bu olayların görselleştirme optimize eden, zebra balığı embriyolarının için bir montaj prosedürü açıklar.

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

Bu çalışma, bir yetişkin zebra balığı, hareketsiz entübe ve kayıtları ve bozulmamış bir hayvanda nöral faaliyet işleme izin vermek için in vivo elektrofizyolojik deneyler için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Sağlam Yetişkin Zebra balığı Beyin Elektrofizyolojik Kayıt

Spinal Transeksiyon sonra, yetişkin zebrabalıkları altı hafta sonrası yaralanma ile fonksiyonel iyileşme var. Larva şeffaflık ve hızlı iyileşme yararlanmak için, larva omurilik transecting için bir yöntem mevcut. Transeksiyon sonra, 3 gün sonrası yaralanma ile 2 gün sonrası yaralanma başlayan duyusal iyileşme gözlemlemek, ve C-bend hareketi.

Larva Zebra balığı Omurilik Kesisi

Burada açıklanan protokoller, zebra balığı embriyolarını in vivo bir sistemde kullanarak, ilgilenilen hücre tipinde seçici olarak ifade edilen bir floresan rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı genetik olarak kodlanmış voltaj göstergesi (GEVI) ile birlikte uyarılabilir hücrelerin elektriksel özelliklerinin incelenmesine izin verir.

Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli

Model omurgalı saç hücresi sisteminde motor komutlar sırasında afferent nöron aktiviteslerindeki değişiklikleri izlemek için bir protokol açıklıyoruz.

Zebra Balıklarında Yüzme Sırasında Posterior Lateral Line Afferent Neurons'un Aktivitesi

Zebra balığı larva nöromüsküler kavşağı, sinaptik fizyolojiyi incelemek için çekici bir modeldir. Elektrofizyoloji ve optik görüntüleme dahil olmak üzere birçok deneysel tekniğe uygundur. Burada, dik bir epifloresan mikroskobu altında pHluorin bazlı bir prob kullanarak sinaptik iletimi görüntülemek için bir protokol açıklıyoruz.

Diseke Larva Zebra Balığının Nöromüsküler Kavşağında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümünün Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin zebra balığı omurilik nöronlarından elektrofizyolojik kayıtlar için in situ hazırlama yöntemini. Bu teknik embriyonik ve larval evrelerde duyusal ve motor nöronların incelenmesine olanak tanır.

Zebra balığı

Daha fazla video keşfet