Kromatin İmmünopresipitasyonu
Kromatin immünopresipitasyon veya "ChIP", araştırmacılar tarafından protein-DNA etkileşimlerini değerlendirmek için kullanılan bir tekniktir. Protein faktörleri gen regülasyonunda önemli rol oynar; sadece kromozomlardaki DNA'yı düzenlemekle kalmaz, aynı zamanda ekspresyonu aktive etmek veya bastırmak için düzenleyici bölgeler adı verilen spesifik DNA dizilerine de bağlanırlar. ChIP sırasında, DNA ve ilişkili proteinlerinden oluşan kromatin "immünopresipite edilir", yani antikorların kullanımı yoluyla izole edilir. Bu yöntemle, araştırmacılar hangi proteinlerin hangi DNA dizileri ile ilişkili olduğunu değerlendirebilirler.
Bu videoda, kromatin modifikasyonlarını ve epigenetik düzenlemedeki rollerini ve ChIP'nin bu modifikasyonları nasıl test edebileceğini gözden geçireceğiz. Daha sonra bu teknik için genelleştirilmiş bir prosedür tanımlayacağız ve son olarak bilim adamlarının bugün araştırmalarda ChIP'yi nasıl kullandıklarını tartışacağız.
Kromatin modifikasyonlarının ne olduğunu ve bunların ChIP ile nasıl çalışılacağını gözden geçirerek başlayalım.
Ökaryotlarda DNA, protein komplekslerinin etrafına "sarılarak" çekirdeklerde depolanır. Bu proteinler histonlardır ve DNA ile sarılmış her histon kompleksine "nükleozom" denir. Gen ekspresyonu, "nükleozom doluluğu" veya bir DNA dizisinin nükleozomlara paketlenip paketlenmediği ile düzenlenir. Kopyalanan DNA, proteinlerin bir genin düzenleyici bölgeleriyle birleşmesine izin veren ve RNA polimerazın transkripsiyonu gerçekleştirmesini sağlayan "nükleozom içermeyen" bölgelerde bulunma eğilimindedir.
Mevcut kanıtlar, gen ekspresyonunu düzenleyen kromatin yapısındaki değişikliklere, genellikle serbestçe hareket eden "kuyruklarında" histonlarda yapılan kimyasal modifikasyonların aracılık ettiğini göstermektedir. Bunlardan en yaygın olanları, spesifik amino asitlere eklenen veya bunlardan çıkarılan asetil, metil ve fosfat gruplarıdır ve bu farklı histon modifikasyonlarının, farklı gen ekspresyonu seviyeleri veya modları ile ilişkili olduğu gözlenmektedir.
Örneğin, histon alt birimi H3'teki 27. lizin kalıntısına üç metil grubunun eklenmesi - H3K27me3 olarak adlandırılan bir modifikasyon - gen susturma ile ilişkilendirilmiştir. Alternatif olarak, histon H3 üzerindeki 9. lizin kalıntısına bir asetil grubunun eklendiği H3K3ac modifikasyonu, gen aktivasyonu ile ilişkilendirilmiştir.
Histon modifikasyonlarının, kromatin bölgelerini "aktif" veya "sessiz" olarak işaretleyerek gen ekspresyonunun epigenetik düzenlenmesinde rol oynadığı varsayılmaktadır. Histon modifikasyonlarının etkilerini gösterdiğine inanılan bir mekanizma, transkripsiyon faktörlerini veya kromatin "yeniden şekillenme" enzimlerini işe almaktır, ikincisi fiziksel olarak nükleozomların pozisyonlarını hareket ettirir.
ChIP ile, spesifik histon modifikasyonları, çevredeki DNA ile birlikte "aşağı çekilebilen" antikorlar tarafından hedeflenebilir. Araştırmacılar daha sonra, ilgilenilen histon modifikasyonları ile ilişkili DNA bölgelerini tanımlamak için PCR, mikrodiziler veya dizileme kullanabilirler. ChIP sırasında kullanılan antikorları değiştirerek, bu teknik aynı zamanda transkripsiyon faktörleri ve diğer düzenleyici proteinler tarafından bağlanan DNA bölgelerinin belirlenmesine de yardımcı olabilir.
Artık ChIP'nin arkasındaki ilkeleri bildiğinize göre, bu teknik için genelleştirilmiş bir prosedürden geçelim.
Başlangıç olarak, ilgilenilen hücreler toplanır ve "çapraz bağlanan" reaktifler olarak işlev gören ve aralarında kovalent bağların oluşumunu kolaylaştırarak proteinleri ilişkilendirdikleri DNA dizilerine bağlamaya yardımcı olan formaldehit gibi kimyasallarla işlenir. Hücrelerin formaldehit ile "aşırı muamele etmemesine" dikkat edilmelidir, çünkü bu, antikorların daha sonraki ChIP aşamalarında hedef histon modifikasyonlarını tanıma yeteneğini etkileyebilir. Çapraz bağlama işlemini durdurmak için, hücrelerin tedavi edildiği formaldehit çözeltisine glisin eklenir. Hücreler daha sonra toplanır ve kromatini serbest bırakmak için parçalanır.
Kromatini çözündürmek ve modifiye histonlarla ilişkili DNA bölgelerini kesin olarak tanımlamak için, kromatin, ses dalgaları kullanılarak mekanik olarak daha küçük parçalara "kesilir" - sonikasyon adı verilen bir işlem. Tipik olarak, bilim adamları 200 ila 1000 baz çifti uzunluğunda kromatin parçaları oluşturmayı amaçlarlar. İstenilen boyutta kromatin fragmanları oluşturulduktan sonra, çözeltiye bir antikor eklenir ve karışım, antikorun hedef histon modifikasyonunu tanıması için zaman vermek üzere inkübe edilir.
Antikorların bağlanabileceği manyetik boncuklar daha sonra karışıma sokulur ve antikorla ilişkili kromatin komplekslerini hareketsiz hale getirir. Boncuklar, manyetik raflar kullanılarak toplanır ve bağlanmamış kromatin veya antikorları durulamak için birkaç kez yıkanır.
Kromatini onlardan serbest bırakmak için, boncuklar deterjan SDS'sini içeren bir çözeltiye yerleştirilir ve boncuklar bir mıknatısla toplandıktan sonra süpernatan tutulur. Proteinaz K enzimi daha sonra histonlar da dahil olmak üzere tüm proteinleri parçalamak için bu çözeltiye eklenir, böylece kromatinin DNA bileşeni izole edilebilir. Elde edilen DNA daha sonra saflaştırılır ve analiz edilir.
Şimdi bilim adamlarının şu anda laboratuvarlarında ChIP'yi nasıl kullandıklarına bir göz atalım.
Birçok araştırmacı, hücre dışı sinyallerin neden olduğu histon modifikasyonlarındaki değişiklikleri değerlendirmek için ChIP'yi kullanır. Burada, kültürlenmiş insan hücreleri spesifik bir sitokin veya sinyal molekülü ile muamele edildi ve histon metilasyonundaki değişiklikler değerlendirildi. Araştırmacılar, ChIP DNA'yı gerçek zamanlı PCR ile analiz ederek, tedaviye yanıt olarak transkripsiyon faktörü kodlayan genin IRF1 aktive edici bir histon işareti olan H3K36me3 kazandığını belirlediler. Bu modifikasyon, hem düzenleyici bir proteinin hem de RNA polimeraz II'nin IRF1 ile birleşmesini sağladı ve bu da transkripsiyonu ile sonuçlandı.
ChIP, doku hasarı ve rejenerasyonu sırasında meydana gelen gen ekspresyonundaki değişiklikler hakkında bilgi edinmek için de kullanılabilir. Bu deneyde, araştırmacılar farelerde periferik sinir sisteminin bir bileşenine (siyatik sinir) zarar verdiler ve daha sonra omuriliği çevreleyen gangliyonlar gibi diğer periferik sinir sistemi yapılarında yeni DNA-protein etkileşimleri aramak için ChIP'yi kullandılar. Bilim adamları, sinir hasarını takiben, DNA onarımının düzenleyicisi olan p53 proteininin, doku rejenerasyonunda rol oynayan bir gen olan GAP43 ile ilişkili hale geldiği sonucuna vardılar.
Son olarak, bazı bilim adamları, deneylerin verimini ve verimliliğini artırmak için ChIP prosedürlerini düzene sokmak için çalışıyorlar. Burada, araştırmacılar ChIP'yi "otomatikleştirebildiler" ve bir makinenin protokoldeki birçok adımı gerçekleştirmesini sağladılar. Bu, araştırmacıların, nispeten az sayıda hücre (10.000) kullanarak, daha büyük hücre sayılarıyla veya standart, "manuel" ChIP teknikleriyle görülenlere benzer sonuçlar vererek, birkaç farklı histon modifikasyonu ile ilişkili DNA'yı aynı anda değerlendirmelerine izin verdi.
Az önce JoVE'nin kromatin immünopresipitasyonu hakkındaki videosunu izlediniz. Bu videoda, DNA ve proteinlerin birlikte kromatini nasıl oluşturduğunu ve belirli kromatin durumları veya proteinlerle ilişkili DNA dizilerini tanımlamak için kullanılabilecek ChIP adlı bir protokolün adımlarını tartıştık. Ayrıca, gen düzenlemesi sırasında DNA-protein etkileşimlerinin rolünü daha iyi anlamak için araştırmacıların ChIP'yi nasıl kullandıklarını ve değiştirdiklerini de araştırdık. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Histonlar, DNA'nın etrafına sarılabileceği ve "kromatin" adı verilen bir kompleks oluşturabileceği "iskeleler" görevi görerek ökaryotik çekirdeklerde…
Kromatin immünopresipitasyon veya "ChIP", araştırmacılar tarafından protein-DNA etkileşimlerini değerlendirmek için kullanılan bir tekniktir. Protein faktörleri gen regülasyonunda önemli rol oynar; sadece kromozomlardaki DNA'yı düzenlemekle kalmaz, aynı zamanda ekspresyonu aktive etmek veya bastırmak için düzenleyici bölgeler adı verilen spesifik DNA dizilerine de bağlanırlar. ChIP sırasında, DNA ve ilişkili proteinlerinden oluşan kromatin "immünopresipite edilir", yani antikorların kullanımı yoluyla izole edilir. Bu yöntemle, araştırmacılar hangi proteinlerin hangi DNA dizileri ile ilişkili olduğunu değerlendirebilirler.
Bu videoda, kromatin modifikasyonlarını ve epigenetik düzenlemedeki rollerini ve ChIP'nin bu modifikasyonları nasıl test edebileceğini gözden geçireceğiz. Daha sonra bu teknik için genelleştirilmiş bir prosedür tanımlayacağız ve son olarak bilim adamlarının bugün araştırmalarda ChIP'yi nasıl kullandıklarını tartışacağız.
Kromatin modifikasyonlarının ne olduğunu ve bunların ChIP ile nasıl çalışılacağını gözden geçirerek başlayalım.
Ökaryotlarda DNA, protein komplekslerinin etrafına "sarılarak" çekirdeklerde depolanır. Bu proteinler histonlardır ve DNA ile sarılmış her histon kompleksine "nükleozom" denir. Gen ekspresyonu, "nükleozom doluluğu" veya bir DNA dizisinin nükleozomlara paketlenip paketlenmediği ile düzenlenir. Kopyalanan DNA, proteinlerin bir genin düzenleyici bölgeleriyle birleşmesine izin veren ve RNA polimerazın transkripsiyonu gerçekleştirmesini sağlayan "nükleozom içermeyen" bölgelerde bulunma eğilimindedir.
Mevcut kanıtlar, gen ekspresyonunu düzenleyen kromatin yapısındaki değişikliklere, genellikle serbestçe hareket eden "kuyruklarında" histonlarda yapılan kimyasal modifikasyonların aracılık ettiğini göstermektedir. Bunlardan en yaygın olanları, spesifik amino asitlere eklenen veya bunlardan çıkarılan asetil, metil ve fosfat gruplarıdır ve bu farklı histon modifikasyonlarının, farklı gen ekspresyonu seviyeleri veya modları ile ilişkili olduğu gözlenmektedir.
Örneğin, histon alt birimi H3'teki 27. lizin kalıntısına üç metil grubunun eklenmesi - H3K27me3 olarak adlandırılan bir modifikasyon - gen susturma ile ilişkilendirilmiştir. Alternatif olarak, histon H3 üzerindeki 9. lizin kalıntısına bir asetil grubunun eklendiği H3K3ac modifikasyonu, gen aktivasyonu ile ilişkilendirilmiştir.
Histon modifikasyonlarının, kromatin bölgelerini "aktif" veya "sessiz" olarak işaretleyerek gen ekspresyonunun epigenetik düzenlenmesinde rol oynadığı varsayılmaktadır. Histon modifikasyonlarının etkilerini gösterdiğine inanılan bir mekanizma, transkripsiyon faktörlerini veya kromatin "yeniden şekillenme" enzimlerini işe almaktır, ikincisi fiziksel olarak nükleozomların pozisyonlarını hareket ettirir.
ChIP ile, spesifik histon modifikasyonları, çevredeki DNA ile birlikte "aşağı çekilebilen" antikorlar tarafından hedeflenebilir. Araştırmacılar daha sonra, ilgilenilen histon modifikasyonları ile ilişkili DNA bölgelerini tanımlamak için PCR, mikrodiziler veya dizileme kullanabilirler. ChIP sırasında kullanılan antikorları değiştirerek, bu teknik aynı zamanda transkripsiyon faktörleri ve diğer düzenleyici proteinler tarafından bağlanan DNA bölgelerinin belirlenmesine de yardımcı olabilir.
Artık ChIP'nin arkasındaki ilkeleri bildiğinize göre, bu teknik için genelleştirilmiş bir prosedürden geçelim.
Başlangıç olarak, ilgilenilen hücreler toplanır ve "çapraz bağlanan" reaktifler olarak işlev gören ve aralarında kovalent bağların oluşumunu kolaylaştırarak proteinleri ilişkilendirdikleri DNA dizilerine bağlamaya yardımcı olan formaldehit gibi kimyasallarla işlenir. Hücrelerin formaldehit ile "aşırı muamele etmemesine" dikkat edilmelidir, çünkü bu, antikorların daha sonraki ChIP aşamalarında hedef histon modifikasyonlarını tanıma yeteneğini etkileyebilir. Çapraz bağlama işlemini durdurmak için, hücrelerin tedavi edildiği formaldehit çözeltisine glisin eklenir. Hücreler daha sonra toplanır ve kromatini serbest bırakmak için parçalanır.
Kromatini çözündürmek ve modifiye histonlarla ilişkili DNA bölgelerini kesin olarak tanımlamak için, kromatin, ses dalgaları kullanılarak mekanik olarak daha küçük parçalara "kesilir" - sonikasyon adı verilen bir işlem. Tipik olarak, bilim adamları 200 ila 1000 baz çifti uzunluğunda kromatin parçaları oluşturmayı amaçlarlar. İstenilen boyutta kromatin fragmanları oluşturulduktan sonra, çözeltiye bir antikor eklenir ve karışım, antikorun hedef histon modifikasyonunu tanıması için zaman vermek üzere inkübe edilir.
Antikorların bağlanabileceği manyetik boncuklar daha sonra karışıma sokulur ve antikorla ilişkili kromatin komplekslerini hareketsiz hale getirir. Boncuklar, manyetik raflar kullanılarak toplanır ve bağlanmamış kromatin veya antikorları durulamak için birkaç kez yıkanır.
Kromatini onlardan serbest bırakmak için, boncuklar deterjan SDS'sini içeren bir çözeltiye yerleştirilir ve boncuklar bir mıknatısla toplandıktan sonra süpernatan tutulur. Proteinaz K enzimi daha sonra histonlar da dahil olmak üzere tüm proteinleri parçalamak için bu çözeltiye eklenir, böylece kromatinin DNA bileşeni izole edilebilir. Elde edilen DNA daha sonra saflaştırılır ve analiz edilir.
Şimdi bilim adamlarının şu anda laboratuvarlarında ChIP'yi nasıl kullandıklarına bir göz atalım.
Birçok araştırmacı, hücre dışı sinyallerin neden olduğu histon modifikasyonlarındaki değişiklikleri değerlendirmek için ChIP'yi kullanır. Burada, kültürlenmiş insan hücreleri spesifik bir sitokin veya sinyal molekülü ile muamele edildi ve histon metilasyonundaki değişiklikler değerlendirildi. Araştırmacılar, ChIP DNA'yı gerçek zamanlı PCR ile analiz ederek, tedaviye yanıt olarak transkripsiyon faktörü kodlayan genin IRF1 aktive edici bir histon işareti olan H3K36me3 kazandığını belirlediler. Bu modifikasyon, hem düzenleyici bir proteinin hem de RNA polimeraz II'nin IRF1 ile birleşmesini sağladı ve bu da transkripsiyonu ile sonuçlandı.
ChIP, doku hasarı ve rejenerasyonu sırasında meydana gelen gen ekspresyonundaki değişiklikler hakkında bilgi edinmek için de kullanılabilir. Bu deneyde, araştırmacılar farelerde periferik sinir sisteminin bir bileşenine (siyatik sinir) zarar verdiler ve daha sonra omuriliği çevreleyen gangliyonlar gibi diğer periferik sinir sistemi yapılarında yeni DNA-protein etkileşimleri aramak için ChIP'yi kullandılar. Bilim adamları, sinir hasarını takiben, DNA onarımının düzenleyicisi olan p53 proteininin, doku rejenerasyonunda rol oynayan bir gen olan GAP43 ile ilişkili hale geldiği sonucuna vardılar.
Son olarak, bazı bilim adamları, deneylerin verimini ve verimliliğini artırmak için ChIP prosedürlerini düzene sokmak için çalışıyorlar. Burada, araştırmacılar ChIP'yi "otomatikleştirebildiler" ve bir makinenin protokoldeki birçok adımı gerçekleştirmesini sağladılar. Bu, araştırmacıların, nispeten az sayıda hücre (10.000) kullanarak, daha büyük hücre sayılarıyla veya standart, "manuel" ChIP teknikleriyle görülenlere benzer sonuçlar vererek, birkaç farklı histon modifikasyonu ile ilişkili DNA'yı aynı anda değerlendirmelerine izin verdi.
Az önce JoVE'nin kromatin immünopresipitasyonu hakkındaki videosunu izlediniz. Bu videoda, DNA ve proteinlerin birlikte kromatini nasıl oluşturduğunu ve belirli kromatin durumları veya proteinlerle ilişkili DNA dizilerini tanımlamak için kullanılabilecek ChIP adlı bir protokolün adımlarını tartıştık. Ayrıca, gen düzenlemesi sırasında DNA-protein etkileşimlerinin rolünü daha iyi anlamak için araştırmacıların ChIP'yi nasıl kullandıklarını ve değiştirdiklerini de araştırdık. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Kromatin immünopresipitasyon veya "ChIP", araştırmacılar tarafından protein-DNA etkileşimlerini değerlendirmek için kullanılan bir tekniktir. Protein faktörleri gen regülasyonunda önemli rol oynar; sadece kromozomlardaki DNA'yı düzenlemekle kalmaz, aynı zamanda ekspresyonu aktive etmek veya bastırmak için düzenleyici bölgeler adı verilen spesifik DNA dizilerine de bağlanırlar. ChIP sırasında, DNA ve ilişkili proteinlerinden oluşan kromatin "immünopresipite edilir", yani antikorların kullanımı yoluyla izole edilir. Bu yöntemle, araştırmacılar hangi proteinlerin hangi DNA dizileri ile ilişkili olduğunu değerlendirebilirler.
Bu videoda, kromatin modifikasyonlarını ve epigenetik düzenlemedeki rollerini ve ChIP'nin bu modifikasyonları nasıl test edebileceğini gözden geçireceğiz. Daha sonra bu teknik için genelleştirilmiş bir prosedür tanımlayacağız ve son olarak bilim adamlarının bugün araştırmalarda ChIP'yi nasıl kullandıklarını tartışacağız.
Kromatin modifikasyonlarının ne olduğunu ve bunların ChIP ile nasıl çalışılacağını gözden geçirerek başlayalım.
Ökaryotlarda DNA, protein komplekslerinin etrafına "sarılarak" çekirdeklerde depolanır. Bu proteinler histonlardır ve DNA ile sarılmış her histon kompleksine "nükleozom" denir. Gen ekspresyonu, "nükleozom doluluğu" veya bir DNA dizisinin nükleozomlara paketlenip paketlenmediği ile düzenlenir. Kopyalanan DNA, proteinlerin bir genin düzenleyici bölgeleriyle birleşmesine izin veren ve RNA polimerazın transkripsiyonu gerçekleştirmesini sağlayan "nükleozom içermeyen" bölgelerde bulunma eğilimindedir.
Mevcut kanıtlar, gen ekspresyonunu düzenleyen kromatin yapısındaki değişikliklere, genellikle serbestçe hareket eden "kuyruklarında" histonlarda yapılan kimyasal modifikasyonların aracılık ettiğini göstermektedir. Bunlardan en yaygın olanları, spesifik amino asitlere eklenen veya bunlardan çıkarılan asetil, metil ve fosfat gruplarıdır ve bu farklı histon modifikasyonlarının, farklı gen ekspresyonu seviyeleri veya modları ile ilişkili olduğu gözlenmektedir.
Örneğin, histon alt birimi H3'teki 27. lizin kalıntısına üç metil grubunun eklenmesi - H3K27me3 olarak adlandırılan bir modifikasyon - gen susturma ile ilişkilendirilmiştir. Alternatif olarak, histon H3 üzerindeki 9. lizin kalıntısına bir asetil grubunun eklendiği H3K3ac modifikasyonu, gen aktivasyonu ile ilişkilendirilmiştir.
Histon modifikasyonlarının, kromatin bölgelerini "aktif" veya "sessiz" olarak işaretleyerek gen ekspresyonunun epigenetik düzenlenmesinde rol oynadığı varsayılmaktadır. Histon modifikasyonlarının etkilerini gösterdiğine inanılan bir mekanizma, transkripsiyon faktörlerini veya kromatin "yeniden şekillenme" enzimlerini işe almaktır, ikincisi fiziksel olarak nükleozomların pozisyonlarını hareket ettirir.
ChIP ile, spesifik histon modifikasyonları, çevredeki DNA ile birlikte "aşağı çekilebilen" antikorlar tarafından hedeflenebilir. Araştırmacılar daha sonra, ilgilenilen histon modifikasyonları ile ilişkili DNA bölgelerini tanımlamak için PCR, mikrodiziler veya dizileme kullanabilirler. ChIP sırasında kullanılan antikorları değiştirerek, bu teknik aynı zamanda transkripsiyon faktörleri ve diğer düzenleyici proteinler tarafından bağlanan DNA bölgelerinin belirlenmesine de yardımcı olabilir.
Artık ChIP'nin arkasındaki ilkeleri bildiğinize göre, bu teknik için genelleştirilmiş bir prosedürden geçelim.
Başlangıç olarak, ilgilenilen hücreler toplanır ve "çapraz bağlanan" reaktifler olarak işlev gören ve aralarında kovalent bağların oluşumunu kolaylaştırarak proteinleri ilişkilendirdikleri DNA dizilerine bağlamaya yardımcı olan formaldehit gibi kimyasallarla işlenir. Hücrelerin formaldehit ile "aşırı muamele etmemesine" dikkat edilmelidir, çünkü bu, antikorların daha sonraki ChIP aşamalarında hedef histon modifikasyonlarını tanıma yeteneğini etkileyebilir. Çapraz bağlama işlemini durdurmak için, hücrelerin tedavi edildiği formaldehit çözeltisine glisin eklenir. Hücreler daha sonra toplanır ve kromatini serbest bırakmak için parçalanır.
Kromatini çözündürmek ve modifiye histonlarla ilişkili DNA bölgelerini kesin olarak tanımlamak için, kromatin, ses dalgaları kullanılarak mekanik olarak daha küçük parçalara "kesilir" - sonikasyon adı verilen bir işlem. Tipik olarak, bilim adamları 200 ila 1000 baz çifti uzunluğunda kromatin parçaları oluşturmayı amaçlarlar. İstenilen boyutta kromatin fragmanları oluşturulduktan sonra, çözeltiye bir antikor eklenir ve karışım, antikorun hedef histon modifikasyonunu tanıması için zaman vermek üzere inkübe edilir.
Antikorların bağlanabileceği manyetik boncuklar daha sonra karışıma sokulur ve antikorla ilişkili kromatin komplekslerini hareketsiz hale getirir. Boncuklar, manyetik raflar kullanılarak toplanır ve bağlanmamış kromatin veya antikorları durulamak için birkaç kez yıkanır.
Kromatini onlardan serbest bırakmak için, boncuklar deterjan SDS'sini içeren bir çözeltiye yerleştirilir ve boncuklar bir mıknatısla toplandıktan sonra süpernatan tutulur. Proteinaz K enzimi daha sonra histonlar da dahil olmak üzere tüm proteinleri parçalamak için bu çözeltiye eklenir, böylece kromatinin DNA bileşeni izole edilebilir. Elde edilen DNA daha sonra saflaştırılır ve analiz edilir.
Şimdi bilim adamlarının şu anda laboratuvarlarında ChIP'yi nasıl kullandıklarına bir göz atalım.
Birçok araştırmacı, hücre dışı sinyallerin neden olduğu histon modifikasyonlarındaki değişiklikleri değerlendirmek için ChIP'yi kullanır. Burada, kültürlenmiş insan hücreleri spesifik bir sitokin veya sinyal molekülü ile muamele edildi ve histon metilasyonundaki değişiklikler değerlendirildi. Araştırmacılar, ChIP DNA'yı gerçek zamanlı PCR ile analiz ederek, tedaviye yanıt olarak transkripsiyon faktörü kodlayan genin IRF1 aktive edici bir histon işareti olan H3K36me3 kazandığını belirlediler. Bu modifikasyon, hem düzenleyici bir proteinin hem de RNA polimeraz II'nin IRF1 ile birleşmesini sağladı ve bu da transkripsiyonu ile sonuçlandı.
ChIP, doku hasarı ve rejenerasyonu sırasında meydana gelen gen ekspresyonundaki değişiklikler hakkında bilgi edinmek için de kullanılabilir. Bu deneyde, araştırmacılar farelerde periferik sinir sisteminin bir bileşenine (siyatik sinir) zarar verdiler ve daha sonra omuriliği çevreleyen gangliyonlar gibi diğer periferik sinir sistemi yapılarında yeni DNA-protein etkileşimleri aramak için ChIP'yi kullandılar. Bilim adamları, sinir hasarını takiben, DNA onarımının düzenleyicisi olan p53 proteininin, doku rejenerasyonunda rol oynayan bir gen olan GAP43 ile ilişkili hale geldiği sonucuna vardılar.
Son olarak, bazı bilim adamları, deneylerin verimini ve verimliliğini artırmak için ChIP prosedürlerini düzene sokmak için çalışıyorlar. Burada, araştırmacılar ChIP'yi "otomatikleştirebildiler" ve bir makinenin protokoldeki birçok adımı gerçekleştirmesini sağladılar. Bu, araştırmacıların, nispeten az sayıda hücre (10.000) kullanarak, daha büyük hücre sayılarıyla veya standart, "manuel" ChIP teknikleriyle görülenlere benzer sonuçlar vererek, birkaç farklı histon modifikasyonu ile ilişkili DNA'yı aynı anda değerlendirmelerine izin verdi.
Az önce JoVE'nin kromatin immünopresipitasyonu hakkındaki videosunu izlediniz. Bu videoda, DNA ve proteinlerin birlikte kromatini nasıl oluşturduğunu ve belirli kromatin durumları veya proteinlerle ilişkili DNA dizilerini tanımlamak için kullanılabilecek ChIP adlı bir protokolün adımlarını tartıştık. Ayrıca, gen düzenlemesi sırasında DNA-protein etkileşimlerinin rolünü daha iyi anlamak için araştırmacıların ChIP'yi nasıl kullandıklarını ve değiştirdiklerini de araştırdık. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are histone modifications and how do they affect gene expression?
Histone modifications are chemical changes—such as acetyl, methyl, or phosphate groups—added to histone proteins that regulate gene expression. H3K27me3 marks genes for silencing, while H3K9ac marks genes for activation. These modifications recruit transcription factors and chromatin remodeling enzymes, controlling whether DNA regions remain active or silent in the cell.
Q2: How does chromatin immunoprecipitation isolate protein-DNA interactions?
ChIP uses antibodies to target specific histone modifications or proteins bound to DNA. Cross-linking reagents like formaldehyde fix proteins to DNA, then chromatin is sheared into fragments. Antibodies bind their targets, magnetic beads capture the antibody-protein-DNA complexes, and after washing and protein degradation, the associated DNA is purified and analyzed.
Q3: What is the purpose of sonication in the ChIP protocol?
Sonication uses sound waves to mechanically shear chromatin into smaller, defined fragments typically 200 to 1000 base pairs long. This step solubilizes chromatin and precisely defines the DNA regions associated with modified histones, enabling accurate antibody targeting and improving the specificity of protein-DNA interaction detection.
Q4: How do researchers analyze ChIP results to identify gene regulatory regions?
After isolating ChIP DNA, researchers employ detection and quantification of nucleic acids by real time PCR, microarrays, or sequencing to identify which DNA regions associate with specific histone modifications or regulatory proteins. Real-time PCR provides quantitative data on gene-specific changes, while sequencing reveals genome-wide binding patterns.
Q5: Why is cross-linking important in chromatin immunoprecipitation?
Cross-linking reagents like formaldehyde create covalent bonds between proteins and DNA, fixing them together before cell lysis. This preserves transient protein-DNA interactions that would otherwise dissociate. However, over-treatment with formaldehyde can impair antibody recognition of target histone modifications, so careful optimization is essential.
Q6: What research applications use ChIP to study gene regulation?
Researchers use ChIP to evaluate histone modification changes triggered by signaling molecules, track DNA-protein interactions during tissue regeneration, and identify novel regulatory mechanisms. For example, ChIP revealed that the p53 protein associates with regeneration genes after nerve injury, and automated ChIP streamlines high-throughput analysis of multiple histone modifications simultaneously.
Q7: How does nucleosome occupancy influence gene expression and chromatin structure?
Transcribed genes typically occupy nucleosome-free regions that allow regulatory proteins and RNA polymerase to access DNA sequences. Histone modifications regulate whether nucleosomes remain tightly packed—silencing genes—or are repositioned by chromatin remodeling enzymes to expose regulatory sites and enable transcription and gene activation.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
1:07
Chromatin Modifications and ChIP
3:46
Generalized ChIP Procedure
5:51
Applications
7:58
Summary