Desenlendirme Proteinlerin ve Hücreleri Çok Yönlü Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, çoğu biyolojik laboratuvarda bulunan basit tezgah üstü araçları kullanarak hücreleri veya substratları karmaşık, uzun ve kapalı mikro kanallara dağıtarak modellemektir. Bu yöntem, biyoloji alanında hücreden hücreye ve hücreden proteine etkileşimlerle ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gerçekleştirilmesinin kolay olması ve yalnızca çoğu biyolojik laboratuvarda kolayca bulunabilen aletler gerektirmesidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, araştırmacı tarafından seçilen hücreler ve substratlar için inkübasyon koşullarının optimizasyonunu gerektirdiğinden mücadele edecektir. PDMS damgasının ve çözeltisinin uygun şekilde yerleştirilmesi deneyin tekrarlanabilirliğini önemli ölçüde artırdığından, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bir CAD çizim aracı kullanarak mikro kanalın düzenini çizerek başlayın.

Ardından, çizimi beyaz kağıda yazdırın. Ardından, tasarıma uyacak kadar büyük bir cam sürgüyü temizlemek için izopropanol kullanın. Ve sonra slaytı bir hava tabancasıyla kurulayın.

Hava kabarcıklarını sıkıştırmamaya dikkat ederek temizlenmiş cam slayta yapışkan bant yapıştırın. Ardından, cam sürgünün kenarlarını, bant tarafı yukarı bakacak şekilde tasarımla kağıda bantlayın. Kağıt tasarımını referans olarak kullanarak cam slayt üzerindeki bandı kesmek için bir neşter kullanın.

Kestikten sonra, cam sürgünün istenmeyen alanlarından bandı soyun. Ardından, kalan yapıştırıcıyı çıkarmak için cam sürgüyü izopropanol ile durulayın. Ve sonra yüzeyi kurutmak için bir hava tabancası kullanın.

Desenlendikten ve temizlendikten sonra, cam slaytı 65 derecelik bir fırında 30 dakika pişirin. Ardından, hava kabarcıklarını gidermek ve sürgünün bir petri kabında oda sıcaklığına soğumasını sağlamak için bandı lastik bir rulo ile yavaşça yuvarlayın. 10 kısım PDMS elastomerini 1 kısım kürleme maddesi ile karıştırarak başlayın ve karışımı kuvvetlice karıştırın.

Ardından, hiç hava kabarcığı kalmayana kadar karışımı gazdan arındırmak için karışımı bir vakum odasına koyun. Yapışkan bant kalıbına 2 mm kalınlığında bir karışım tabakası dökün ve tüm hava kabarcıkları kaybolana kadar kalıbın gazını alın. Soğuduktan sonra, PDMS katmanını özelliklerden en az 5 mm uzakta kesmek için bir neşter kullanın.

Ardından, kürlenmiş PDMS'yi bir cımbız kullanarak kalıptan soyun. Tercihen bir mikrokanal ağının ucunda, 1 mm'lik bir biyopsi zımbası ile tek bir giriş deliği açın. Ardından, cihazdaki toz parçacıklarını temizlemek için PDMS dökümünü yapışkan bantla temizleyin.

PDMS mikrokanal cihazını %70 ehtanol solüsyonu ve ardından steril deiyonize su ile durulayarak sterilize edin ve 30 dakika UV ışığına maruz bırakın. Steril PDMS dökümünü steril bir cam kapak kızağı üzerine yerleştirmek için cımbız kullanın ve cımbızın ucunu kullanarak hafif bir baskı uygulayın. Daha sonra, mikrokanalların girişine sodyum tetraborat tamponuna bir damla poli d lizin yerleştirin.

Petri kabını 10 dakika vakum altına koyun. Bu süre zarfında, kanaldan kabarcıklar şeklinde çıkan havayı gözlemleyin. Vakumu serbest bırakın ve mikro kanala akan substrat çözeltisini gözlemleyin: Çanağı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ardından, steril cımbız kullanarak PDMS damgasını dikkatlice soyun ve deseni deiyonize su ile üç kez yıkayın. Spesifik olmayan yapışmayı azaltmak için cam örtü kızağına %1'lik bir BSA çözeltisi ekleyin ve numuneyi gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, BSA solüsyonunu aspire edin.

Hücrelerin dolaylı desenlenmesini başlatmak için, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi serum serbest kültür ortamında bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Hücre süspansiyonunu desenli petri kabına ekleyin, desenli bölgeyi tamamen hücre süspansiyonuna batırın. Daha sonra, hücrelerin desenli alt tabakaya yapışmasına izin vermek için petri kabını bir inkübatörde 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, fazla hücre süspansiyonunu petri kabından aspire edin ve desenli hücreleri PBS ile üç kez yıkayın, bağlanmamış hücreleri çıkarmak için on saniye hafifçe sallayın. Daha sonra, desenli hücre kültürlerine uygun kültür ortamını ekleyin ve desenli hücreleri karbondioksit tamponlu bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücrelerin doğrudan modellenmesi için, önce mikroakışkan cihazı %70 etanol çözeltisi ve ardından deiyonize su ile durulayarak sterilize edin.

Ardından, PDMS'ye spesifik olmayan hücre yapışmasını önlemek için cihazı gece boyunca %1'lik bir BSA çözeltisine batırın. Cihazı oda sıcaklığında kurutun ve ardından doku kültürü ile muamele edilmiş petri kabının altına takın. Mikro kanalları doldurmaya yetecek kadar 4 ila 8 mikrolitre hücre süspansiyonunu, deliği tamamen kaplayacak şekilde girişe yerleştirin.

Ardından, petri kabını 10 dakika boyunca bir vakum odasına koyun. Vakumu serbest bırakın ve hücre süspansiyonunun mikrokanala aktığını gözlemleyin. Petri kabını 37 santigrat derecede karbondioksit tamponlu bir inkübatörde bir saate kadar inkübe edin.

Ardından, çanağı inkübatörden çıkarın ve PDMS'yi tabaktan dikkatlice soymak için bir cımbız kullanın. Deseni PBS ile yıkayın ve ardından petri kabına hücre kültürü ortamı ekleyin. Bittiğinde, hücreleri tekrar inkübatöre yerleştirin.

Burada gösterilen, poli d lizin ve laminin yüzeylerde desenlenmiş embriyonik sıçan kortikal nöronlarıdır. Hücrelerin konumu, desenli alanlara genel yapışma ve PDL ve laminin şeritleri boyunca büyüme gösterir. Burada, daha yüksek bir büyütme oranında, C2C12 miyoblastları gösterilmiştir.

Bu hücre tipi aynı zamanda desenli alanlara yapışır ve çok çekirdekli miyotüplere füzyon gösterir. Bu teknik aynı zamanda burada fibroblastlarla gösterilen doğrudan hücre modellemesi için de uyarlanmıştır. Bu doğrudan hücre modelleme yönteminin hücre sağkalımı üzerinde olumsuz bir etkisi yoktur.

Bu prosedürü takiben, protein lokalizasyonu veya hücre-substrat etkileşimlerini içeren ek soruları yanıtlamak için floresan mikroskobu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, hücre damlacığının veya substrat çözeltisinin tüm kakmayı kaplayacak şekilde uygun şekilde yerleştirilmesinin başarı için kritik olduğunu hatırlamak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların retina biyolojisinde fotoreseptör akson rehberliğini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, negatif basınç kullanarak gaz geçirgen PDMS mikroakışkan cihazlarla hücrelerin ve alt tabakanın nasıl modelleneceğini iyi anlamış olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler ve denemenizde iyi şanslar.