Name: Aynı odaklı mikroskopi ile ligand-aktif G protein-eşli reseptör özümseme tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Öğrenin, konfokal mikroskopi kullanarak memeli hücrelerde GPCR içselleşmesini nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, reseptör dinamiklerini ve hücresel sinyalleşmeyi incelemek için güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu makalenin yazarları, teknik yardım ve ekipman kullanımı için Prof. Jiayan Xie'ye teşekkür eder. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (41406137) tarafından finansal olarak desteklenmiştir.

1. Hücre Hazırlanması <ol><li> Hücre kurtarma <ol><li> 37 ° C su banyosu için bir sıvı azot tankından dondurularak korunmuş insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücreler aktarın ve 1 sürekli çalkalama - 2 dakika. </li><li> 10 cm&#39;lik bir hücre kültür tabağına dengelenmiş büyüme ortamı 10 mL (Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin solüsyonu) eklenir. Yavaşça dengelenmiş bir büyüme ortamına çözülmüş hücrelere ilave edin. </li><li> 4 saat - 2% 95 hava ve% 5 CO2 içeren bir nemlendirilmiş atmosfer ile 37 ° C bir su ceketli CO2 inkübatöründe inkübe hücreleri. </li><li> 2 sonra - 4 saat, hücreler bağlı olup olmadığını kontrol edin. 48 saat - bir 24 için dengelenmiş bir büyüme ortamı ve kültür değiştirin. Not: dimetil sülfoksit (DMSO) kaldırır ve hücre hasarına karşı koruma sağlar, çünkü dengelenmiş bir büyüme ortamının değiştirilmesi yararlıdır. </li></ol></li><li> &lt;strong&gt; Hücre pasaj <ol><li> 24 sonra, - hücrelerinin yakın konflüansa büyüdü 48 saat, dengelenmiş bir büyüme ortamı atılır ve fosfat tamponlu tuzlu su içinde 2 mL (PBS) ile yıkama hücreleri. nazikçe Swirl çanak. </li><li> PBS atın ve Tripsin-EDTA, 1 mL (tuzlu su,% 0.25 tripsin ve% 0.02 EDTA) ekleyin. Hücreleri tamamen sindirimi için, çanak dikkatle girdap ve tripsin-EDTA çözeltisi aspire. 3 dakika için 37 ° C su ceketli CO2 inkübatör çanak koyun. NOT: Bu süre esnasında, üç yeni 10-cm hücre kültür kaplarına hazırlanması ve her bir dengelenmiş büyüme ortamı 10 ml. </li><li> Hücreler çanak alt kaldırılır eğer bir ışık mikroskobu kullanarak, belirler. çanak dengelenmiş bir büyüme ortamı 2 mL ekleyin. pipetleme ile karıştırın ve hemen yeni tabağın her hücre süspansiyonu, 0.6 ml pipetleyin. Yavaşça pipetleme ile karıştırın ve hücreler, 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 inkübe edin. </li></ol></li&gt; </ol> 2. Hücre Ekme <ol><li> 24 saatten sonra - geçirilmiş hücrelerin yakınındaki konflüansa büyüdü 48 saat, dengelenmiş bir büyüme ortamı atılır ve 2 mL PBS ile yıkama hücreleri. nazikçe Swirl çanak. </li><li> PBS atın ve tripsin-EDTA 1 ml. Hücreleri tamamen sindirimi için, çanak dikkatle girdap ve tripsin-EDTA aspire. 3 dakika için 37 ° C su ceketli CO2 inkübatör çanak koyun. NOT: Bu süre boyunca, her bir dengelenmiş bir büyüme ortamı için 2 ml ilave edilerek, 6 gözlü bir plakanın hazırlanması. </li><li> Mikroskobik gözlem altında, hücreler, bulaşık alttan kaldırılması için ise, çanak dengelenmiş bir büyüme ortamının 1 mL ekleyin. pipetleme ile karıştırın ve hemen hazırlanan bir 6-çukurlu bir tablaya (dengelenmiş bir büyüme ortamı ile 2 ml hücre az 6-yuvalı plaka) her bir çukuruna hücre süspansiyonundan 0.1 mL (hacim hücre büyüme yoğunluğuna göre ayarlanır) pipetleyin. Yavaşça hücreleri pipetleme karışım ve izin37 ° C&#39;de inkübe edilir ve% 5 CO2 ile. </li></ol> 3. Hücre Transfeksiyonu <ol><li> Lipozom formülasyonları ile transfeksiyonu, yöntem 1, NOT: transfeksiyon reaktif 1 için Materyallerin Tablosuna bakınız. <ol><li> % 95 birleştiğinde - Ertesi gün, hücreler 85 olmalıdır emin olun. </li><li> steril mikrosantrifüj tüpüne plazmid DNA (500 ng / ml) ve düşük serum ortamında 100 uL 3 ug ekleyin ve yavaşça karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Reaktif 1 ve başka bir mikrosantrifüj tüpü içinde düşük serum ortamında 100 uL 9 uL hazırlayın ve hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> seyreltilmiş Reaktif 1 (toplam hacim = 215 uL) ile seyreltilmiş plazmid karışımının birleştirin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. </li><li> Aspire hücreleri kültüre plaka kapalı orta ve FBS&#39;siz 1.5 ml taze DMEM ekleyin. </li><li> DNA transf 215 uL ekleyinection reaktif her bir damlalık yardımıyla karışım ve plaka karıştırılırken yavaşça karıştırın. </li><li> 8 saat - 4 CO2 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve% 5. % 10 FBS ile taze DMEM ile değiştirin. </li><li> Herhangi bir deney çalıştırmadan önce 48 saat - bir 24 için CO 2, 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri ve% 5. </li></ol></li><li> Lipozom formülasyonları ile transfeksiyonu, yöntem 2, NOT: transfeksiyon reaktif 2 için Materyallerin Tablosuna bakınız. <ol><li> steril mikrosantrifüj tüpü içine plazmid DNA 2 ug (500 ng / uL), Reaktif 2 4 uL ve 100 uL düşük serum ortamı ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> damla damla hücrelere transfeksiyon karışımı ekleyin. </li><li> Herhangi bir deney çalıştırmadan önce, 37 ° C&#39;de 48 saat% 5 CO2 - Transfeksiyondan sonra, 24 hücreleri inkübe edin. </li></ol></li></ol> Kapak fislerinde 4. Hücre Kültürü <ol><li> YenidenKültür 6 gözlü levhadan büyüme ortamı hareket ettirin. </li><li> kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1 mL PBS ile hücre mono tabakasının yıkayın. </li><li> 0.5 ml tripsin-EDTA ekleyin. dikkatli bir şekilde çanak girdap ve tripsin-EDTA aspire. 37 ° C de 3 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 için kültür plaka inkübe edin. Gerçek inkübasyon süresi, kullanılan hücre kuşağı ile değişir. NOT: Bu süre boyunca, yeni bir 12 oyuklu plaka hazırlanması ve steril kapaklar her fişleri 15 mm çapında bir ekleyin. lisin, laminin, ya da kollajen ile kaplanır Kapak slipleri kolayca ayırmak HEK293 hücrelerinin hücre eki iyileştirebilir. </li><li> Hücreler müstakil zaman, her bir 1 ml önceden ısıtılmış tam büyüme ortamı ilave edin. pipetleme ile karıştırın ve hemen lameller 12-iyi levhaya Gerekli sayıda hücre transfer edin. 1 mL toplam hacmini ayarlamak için her bir oyuğa taze tam büyüme ortamı ilave edin </li><li> 37 ° C&#39;de 24 saat ve% 5 CO 2-16 hücreleri inkübe edin. NOT: 30 sonrası -60 dakika, hücrelerin çoğunluğunun steril bir örtü slipleri yapıştırılır olacaktır. </li></ol> 5. Konfokal mikroskopi Algılama <ol><li> Hücresel lokalizasyon <ol><li> 16 sonra, - hücreleri 12 çukurlu bir tabakta steril lameller üzerine yakın akışa kadar büyütülmüş olan, 24 saat, 5 uM nihai yoğunluk olarak, her bir göze, membran prob, DII ekleyin. Hücreler, 37 ° C&#39;de 30 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 inkübe izin verin. </li><li> 30 dakika sonra, dengelenmiş bir büyüme ortamı çıkarın ve soğuk PBS içinde iki kere yıkama hücreleri (2-8 ° C). </li><li> Her bir oyuğa (PBS içinde), bir% 4 paraformaldehit çözeltisi 1 mL eklenerek hücreler sabitleyin. Yavaşça 15 dakika boyunca çalkalayın. Dikkat: paraformaldehid deri ve soluma yoluyla orta derecede toksik ve olası kanserojen olarak belirlemiştir. Kimyasal paraformaldehit tartım ve taşıma sırasında kullanılan gereken davlumbaz, havalandırmalı denge muhafazaları veya başka koruma önlemleri duman. &lt;/ Li&gt; <li> PBS içinde iki kez duran hücreleri yıkayın. uL DAPI (4&#39; , 6-diamidino-2-fenilindol) çözeltisi (0.5 ug / mL) her birine 200-300 de ilave edilir ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. </li><li> PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Dikkatlice plaka kapak slipi çıkarın ve aşırı PBS kapalı fitil. montaj ortamına (% 50 h / h gliserol / su) bir damla yüklü mikroskop lamı üzerine ters çevirin. Slaytları fazla montaj orta çıkarın. </li></ol></li><li> Hücresel içselleştirme <ol><li> 16 sonra, - hücreleri 12 çukurlu bir tabakta steril lameller üzerine yakın akışa kadar büyütülmüş olan, 24 saat, dengelenmiş bir büyüme ortamı kaldırmak ve taze ekleyin DMEM ortamı (37 ° C), ısıtılmıştır. 37 ° C&#39;de 1 saat ve% 5 CO2 inkübe hücreleri. </li><li> 30 dakika boyunca (0 10 -12, 10 -9 ve 10 6 M) farklı konsantrasyonları ile ligandın hücreleri tedavi ve farklı zamanlarda 10 -6 M ligandı (0 ile tedavi,10, 30 ve 60 dakika). </li><li> (- 8 ° C, 2), soğuk PBS içinde iki kere hücreleri yıkayın. Her bir oyuğa (PBS içinde), bir% 4 paraformaldehit çözeltisi 1 mL eklenerek hücreler sabitleyin. Yavaşça 15 dakika boyunca çalkalayın. </li><li> PBS içinde iki kez hücreleri yıkayın. Dikkatlice plaka kapak slipi çıkarın ve aşırı PBS kapalı fitil. montaj ortamına (% 50 h / h gliserol / su) bir damla yüklü mikroskop lamı üzerine ters çevirin. Slaytları fazla montaj orta çıkarın. </li></ol></li><li> mikroskopisi <ol><li> cıva lambası güç, PC mikroskop, tarayıcı ve lazer gibi, konfokal mikroskop donanım açın. Yazılımı başlatmak, işletim sistemi hesabına giriş yapılandırmasını kontrol ve lazer seçin. talimatlara göre sırayla odaklı mikroskopi sisteminin farklı birimleri açın. </li><li> Mikroskop sahnede hazırlanan slaytlar yerleştirin. sahne kumandasını kullanarak objektif lens üzerinde numuneyi yerleştirin. sedir yağı bir damla ekleyinyağ daldırma objektif seçildiğinde lamel. Merceği bakan slaytlarda kapağını fişleri yerleştirin. </li><li> Floresan mikroskobu altında ilgi hücreleri bulun. </li><li> tarama moduna geçin. lazer gücü ve emisyon fluorofor spektral aralığı seçin. akort lazer yoğunluğu ve diğer parametrelere göre yüksek kalitede eş odaklı görüntüler çekin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+and+molecular+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocytosis and molecular sorting.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).</li>
<li>Hausott, B., Klimaschewski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+turnover+and+receptor+trafficking+in+regenerating+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neuro%22%5BJournal%5D)">Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons.</a> Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).</li>
<li>Kallal, L., Benovic, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+green+fluorescent+proteins+to+study+G-protein-coupled+receptor+localization+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking.</a> Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).</li>
<li>Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+of+the+Aequorea+victoria+green-fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.</a> Gene. 111, 229-233 (1992).</li>
<li>Spector, D. L., Goldman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+and+Expressing+GFP+Fusion+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins.</a> CSH protocols. 2006, (2006).</li>
<li>Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+an+indicator+to+monitor+membrane+protein+overexpression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).</li>
<li>von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+vectors+for+the+expression+of+green+fluorescent+protein+fusion+proteins+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants.</a> Gene. 221, 35-43 (1998).</li>
<li>Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+green+fluorescent+protein+for+visualization+of+cell-specific+gene+expression+and+subcellular+protein+localization+during+sporulation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).</li>
<li>Kain, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+reporter+of+gene+expression+and+protein+localization%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization.</a> BioTechniques. 19, 650-655 (1995).</li>
<li>Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+ligand-mediated+internalization+of+G+protein-coupled+receptor+as+a+novel+pharmacological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach.</a> Life Sci. 80, 17-23 (2006).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonist-Activated+Bombyx+Corazonin+Receptor+Is+Internalized+via+an+Arrestin-Dependent+and+Clathrin-Independent+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway.</a> Biochemistry. 55, 3874-3887 (2016).</li>
<li>Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+G+protein-coupled+receptor+kinases+and+arrestins+during+receptor+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization.</a> Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).</li>
<li>Ferguson, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+beta-arrestin+in+mediating+agonist-promoted+G+protein-coupled+receptor+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization.</a> Science. 271, 363-366 (1996).</li>
<li>Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropin-releasing+hormone+receptors%3A+structure+and+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways.</a> Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).</li>
<li>Yan, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Expression+Profile+of+the+Gonadotropin-Releasing+Hormone+Receptor+in+Common+Chinese+Cuttlefish%2C+Sepiella+japonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+A+Ecol+Genet+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica.</a> J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+activation+of+the+G+protein-coupled+receptor+BNGR-A21+by+the+neuropeptide+corazonin+from+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%2C+dually+couples+to+the+G%28q%29+and+G%28s%29+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades.</a> J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).</li>
<li>Lu, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+Characterization%2C+and+Expression+Profile+of+Estrogen+Receptor+in+Common+Chinese+Cuttlefish%2C+Sepiella+japonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+A+Ecol+Genet+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica.</a> J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Burada sunulan protokol HEK293 hücrelerinde hücre içi lokalizasyonu ve eksprese GPCR füzyon proteininin internalizasyonunu tespit etmek için etkin ve kolay yorumlanabilir bir yöntem sağlar. Teknik kolayca HEK293 ve BMN hücreleri 16 Bombyx mori kaynaklı corazonin reseptörünün hücresel yerini ve internalizasyon için birçok farklı gen ve hücre tipleri için uyarlanabilir. Bu güçlü testin başarılı uygulama birkaç anahtar faktöre dayanır. Önemlisi verimli transfeks...

Hücreler taşımak için yük trafik mekanizmalara sahip hücre dışı malzemeler-tür ligandlar, mikroorganizmalar, besin ve zar-ötesi proteinden-bir bilgi, enerji ve diğer amaçlar 1, 2 hücre olarak. Hücresel homeostazı, doku işlevinin ve genel hücrenin hayatta kalması için kritik öneme sahiptir. Floresan füzyon proteinlerinin hücre bazlı ekspresyon yolları 3 sinyal lokalizasyonu ve G-protein bağlı reseptörler (GPCR), transmembran reseptörleri, internalizasyonunu incelemek için etkili bir yoldur. Doğrudan floresans saptama teknikleri ile bir arada Aequorea victoria akvaryum balığındaki yeşil floresan protein (GFP) ile etiketlenmiş füzyon proteinlerinin ekspresyonu, geniş kabul görmüştür protein gibi araştırma 4, 5, 6. GFP tabanlı Detectiüzerinde sabitleme eserler 7 kaçınırken yaşayan hücrelerin gerçek zamanlı görüntüleme izin verme avantajına sahiptir. Çok yönlü klonlama vektörleri bir dizi, 9, çeşitli hücrelerde 8 GFP protein füzyonlarının ekspresyonunu kolaylaştırmak için inşa edilmiştir. pEGFP-N1 vektörü memeli hücrelerinde daha parlak floresans ve daha yüksek ifadesi için doğal tipte GFP arasından optimize edilmiş olan bir arttırılmış yeşil fluoresan protein (EGFP) kodlayan yaygın olarak kullanılan ve ticari olarak plazmid vektörüdür. EGFP flüoresan sinyal memeli hücrelerinde ifade gözlemlemek için, floresans mikroskopisi tercihen eş odaklı mikroskopi ile 488 nm&#39;de eksitasyon ve 507 nm&#39;de emisyon ile yapılmalıdır. Hücre içi lokalizasyonu ve reseptörlerin ligand aracılı içselleştirme İzleme GPCR&#39;lerin 10 sinyal iletimini ve araştırmak üzere yaygın bir tekniktir </s11,&gt; yukarı. Bir çok durumda, internalizasyonunu GPCR&#39;lerin duyarsızlaştırma (agonistlerin mevcudiyetinde rağmen teşvik cevabının hafifleme) 12, 13 neden olmaktadır. içsel reseptörleri lizozom dahil edilmiş ve bozulmuş ya da reseptörler ve deneylerde kullanılan hücre çizgilerinin yapısına bağlı olarak, hücre yüzeyine geri geri dönüştürülebilir edilebilir. Gonadotropin salgılatıcı hormon reseptörleri (GnRHRs) GPCR familyasına aittir ve hücre dışı bir amino-terminali, bir hücre içi -COOH terminal ile, tipik bir GPCR protein yapısına sahip ve yedi zar-ötesi (TM) 14 alanlarla kullanılabilir. (Sepiella japonica gelen GnRHR geni ile) yeniden birleştirici plazmit Sj GnRHR-EGFP transfeksiyonu ve (HEK293 hücrelerinde ifade edilir) EGFP-etiketli Sj GnRHR konfokal mikroskopi tespit Previou bildirilmiştirsinsi ve GFP floresan transmembran protein lokalizasyonu deneyleri 15 muhabir olarak kurulmuştur. Şimdi, S. japonica gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH Sj) ile aktive Sj GnRHR içselleştirilmesi, eş odaklı mikroskopi ile zaman ve doza bağlı şekillerde gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>HEK293 hücre hattı&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM / Yüksek glikoz</td><td>Hiklon</td><td>SH30022.01</td><td>Yüksek glikoz 4.0 mM L-glutamin</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>PuFei</td><td>1101-100</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td> <td>Genomu</td><td>GNM10010</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Genomu</td><td>GNM15140</td><td></td></tr><tr><td>%0.25 Tripsin ve %0.02 EDTA</td><td>Genomu</td><td></td><td></td>GNM25200</tr><tr><td>Opti-MEM (1x)</td><td>GIBCO, Life Technologies tarafından</td><td>31985-062</td><td>azaltılmış serum ortamı</td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>Reaktif 1</td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>Reaktif 2</td></tr><tr><td>DAPI Boyama Çözeltisi</td><td>Beyotime</td><td>C1006</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Beyotime</td><td>C1036</td><td></td></tr><tr><td>Antifade Montaj Ortamı</td><td>Beyotime</td><td>P0126</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co.(SCRC)</td><td>80096618</td><td></td></tr><tr><td>100 mm hücre kültürü</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka&nbsp;</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0092</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu plaka&nbsp;</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0093</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Camı</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları</td><td>Citoglas</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>Termo Bilimsel Forma CO2 İnkübatör</td><td>Thermo</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5II lazer taramalı konfokal mikroskop</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td>5100001311</tr></tbody></table>

aynı odaklı mikroskopi ile ligand-aktif g protein-eşli reseptör özümseme tespiti

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM), yüksek kontrastlı görüntüleme için optik bir görüntüleme tekniğidir. Yeşil floresan proteini (GFP) gibi floresan füzyon proteinlerini ekspresyonlarını, lokalizasyonlarını ve işlevlerini belirlemek için görselleştirmek güçlü bir yaklaşımdır. Hedef proteinlerin hücre altı lokalizasyonu, tanımlama, karakterizasyon ve fonksiyonel analizler için önemlidir. İçselleştirme, uyaranlara uygun hücresel yanıtları sağlamak için G proteinine bağlı reseptör (GPCR) sinyalini kontrol eden baskın mekanizmalardan biridir. Burada, HEK293 hücrelerinde GPCR'nin hücre altı lokalizasyonunu ve içselleştirilmesini konfokal mikroskopi ile tespit etmek için deneysel bir yöntem tanımlanmıştır. Ek olarak, bu deney hücre kültürü ve transfeksiyon hakkında bazı ayrıntılar sağlar. Bu protokol, yaygın olarak bulunan çeşitli floresan markörlerle uyumludur ve proteinlerin çoğunun hücre altı lokalizasyonunun yanı sıra GPCR'nin içselleştirilmesinin görselleştirilmesi için de geçerlidir. Bu teknik, araştırmacıların memeli hücre dizilerinde GPCR gen ekspresyonunu verimli bir şekilde manipüle etmelerini sağlamalı ve GPCR hücre altı lokalizasyonu ve içselleştirilmesi üzerine çalışmaları kolaylaştırmalıdır.

Şekil 1, bir eş odaklı mikroskop sisteminin bir örneğini göstermektedir. Şekil 2, HEK293 hücrelerinde pEGFP-N1 ekspresyonunu göstermektedir. GFP sinyali sitoplazma ile çekirdek saptandı. Şekil 3, daha önce yayınlanmış sonuçlar 15 ile uyumlu HEK293 hücrelerinde S. japonica gelen GnRHR hücre içi lokalizasyonu göstermektedir. Zaman CLSM altında Sj GnRHR (Sj GnRHR-EGFP) C-termininde EGFP eti...

Bu protokol, memeli hücrelerinde G-protein kenetli reseptör (GPCR) içselleştirmenin konfokal mikroskopi bağlanmasını anlatır. Temel hücre kültürü, transfeksiyon, ve konfokal mikroskopi prosedürü içeren füzyon ifade GPCR hücre içi lokalizasyonu ve içselleşmesini tespit etmek için etkin ve kolay yorumlanabilir bir yöntem sağlar.

Aynı odaklı mikroskopi ile ligand-aktif G protein-eşli reseptör özümseme tespiti

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

Bu deneyin genel amacı, memeli hücrelerde eksprese edilen GPCR füzyon proteinlerinin hücre altı lokalizasyonunu ve internalizasyonunu tespit etmek için verimli ve kolayca yorumlanabilir bir yöntem sunmaktır. Bu yöntem, reseptör internalizasyonu ve geri dönüşümü gibi hücre altı protein lokalizasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kolay ve verimli bir şekilde kullanılabilmesidir.Böylece bu yöntem, GPCR'lerin izlenmesi ve konumlandırılmasına dair içgörü sağlayabilir. Ayrıca, sitoplazmik ve nükleer proteinler gibi diğer sistemler için de uygulanabilir. HEK293 hücreleri metin protokolüne göre geri kazanılıp pasajlandıktan sonra, hücreler yaklaşık konfluense ulaştığında, dengelenmiş büyüme ortamını dökün, iki mililitre PBS ekleyin ve hücreleri yıkamak için kabı dairesel hareketlerle sallayın.PBS'yi dökün ve bir mililitre trypsin EDTA ekleyin. Hücrelerin tamamen sindirilmesi için kapla dikkatlice dairesel hareketler yapın ve solüsyonu aspire edin. Ardından, kabı 37 °C sıcaklıktaki su ceketli CO2 inkübatörüne üç dakika boyunca yerleştirin.Hücreler inkübe olurken, her bir kuyucuğa iki mililitre dengelenmiş büyüme besiyeri ekleyerek a

detection-ligand-activated-g-protein-coupled-receptor-internalization

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, kemotaksis soruşturma için ayrıntılı canlı hücre görüntüleme yöntemleri açıklanmaktadır. Biz göç eden hücreleri olayları sinyal Spatiotemporal dinamiklerini izlemek için floresan mikroskobik yöntemler sunuyoruz. Ölçüm sinyal olayların bir GPCR sinyal ağı daha chemoattractants ve kontroller ökaryotik hücrelerin yönlü göç algılama degrade nasıl elde ettiğini anlamak için bize izin verir.

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Biz GPCRs çeşitli hedef konumlarda doğal olmayan amino asit, p-azido-L-fenil alanin-kodlayan ve genetik olarak farklı uygulamalarda Azido grubunun çok yönlülüğünü gösterir. Bunlar, bir GPCR olan ligand bağlama cebinde tortuları tanımlamak için hedef foto-çapraz teknolojisi ve bir peptid epitop ya da flüoresan probu ile GPCRs alana özgü bioorthogonal modifikasyonunu içerir.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

Bir özel poliklonal antikor, hücre dışı epitopuna kullanarak canlı nöronlar yüzeyinde proteini etiket için bir yöntem tarif eder. Hücre yüzeyi üzerinde antikor tarafından bağlanan ve daha sonra endositoz üzerinden içsel protein Protein kalan ayırt veya inkübasyon sırasında yüzeye, kaçırılan edilebilir.

Canlı Kültür Nöronlar Antikor Besleme sonra Hücre-yüzey ve İçselleştirilmiş Proteinlerin Diferansiyel Etiketleme

Burada açıklanan flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil yetim G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) fonksiyonel olarak aktive edici ligandın (ler) in belirlenmesi için, bir orta-throughput ters farmakoloji tarama sistemidir.

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Klatrin aracılı endositoz, hızlı ve oldukça dinamik bir süreç, sinyal reseptörleri de dahil olmak üzere birçok proteini içselleştirir. Burada açıklanan protokol, bireysel endositik olayların kinetiğini doğrudan görselleştirir. Bu, endositik makinenin çekirdek üyelerinin birbirleriyle nasıl koordine olduğunu ve protein yükünün bu süreci nasıl etkilediğini anlamak için gereklidir.

TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme

Reseptör ticareti ligandlarına sinyal ve hücre yanıt modüle ve kendisi ligand bağlı sinyal dahil olmak üzere hücre koşulları, yanıt verici olmaktadır. Burada, biz kantitatif immün ve colocalizational analizi kullanılarak ilaca bağlı reseptör ticaretini değerlendirmek için güçlü ve esnek bir teknik açıklar.

Colocalizational Analizi Reseptör Sonrası içselleştirme Ticareti Uyuşturucu kaynaklı Değişiklikleri İzleme

Burada anjiotensin II tedavi tarafından başlatılan endositoz sırasında yeşil flüoresan protein etiketli anjiotensin tip 1a reseptörlerini eksprese görüntü hücrelere bir protokol mevcut. Bu teknik, zaman içinde, üç boyutlu olarak reseptör ve lizozom ko-lokalizasyonunu analiz yazılımı kullanılarak daha sonra etiket, ikinci bir fluoresan işaretleyici ile lizozomlar ve benzerini kapsamaktadır.

Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Bu protokol, farmakolojik olarak önemli G proteini bağlantılı reseptör sınıflarından biri olan insan 1A serotonin reseptör proteininin (5-HT1AR) yeniden uzlaştırılması için burada açıklandığı gibi, integral membran proteinlerini (IMP'ler) dev unilamellar lipid veziküllerine (GUVs) dahil etmek için güçlü ve genelleştirilebilir bir teknik olarak agarose şişmesini kullanır.

G-protein Bağlantılı Reseptörleri (GPCR) içeren Model Lipid Membranlarının yapımı

Bu çalışmada, rekombinant G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerindeki küçük molekül kütüphanelerini taramak için 384 kuyucuklu plakalar için yüksek verimli, hücre içi kalsiyum floresan testi açıklanmaktadır. Hedef, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü, Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilir. Bu tahlil, aynı hücreleri tek bir "çift eklemeli" tahlilde kullanarak agonistleri ve antagonistleri tanımlar.

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

Öğrenin, konfokal mikroskopi kullanarak memeli hücrelerde GPCR içselleşmesini nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, reseptör dinamiklerini ve hücresel sinyalleşmeyi incelemek için güvenilir bir protokol sunar.

Aynı odaklı mikroskopi ile ligand-aktif G protein-eşli reseptör özümseme tespiti

Daha fazla video keşfet