Aynı odaklı mikroskopi ile ligand-aktif G protein-eşli reseptör özümseme tespiti

Bu deneyin genel amacı, memeli hücrelerinde eksprese edilen GPCR füzyon proteinlerinin hücre altı lokalizasyonunu ve içselleştirilmesini tespit etmek için verimli ve kolay yorumlanabilir bir yöntem sağlamaktır. Bu yöntem, reseptör içselleştirmesi ve geri dönüşümü gibi hücre altı protein lokalizasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kolay ve verimli bir şekilde kullanılabilmesidir.

Dolayısıyla bu yöntem, GPCR'lerin izlenmesi ve konumlandırılması konusunda içgörü sağlayabilir. Ayrıca sitoplazmik ve nükleer protein gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. HEK293 hücrelerini metin protokolüne göre geri kazandıktan ve geçirdikten sonra, hücreler birleşmeye yakın bir şekilde büyüdüğünde, dengelenmiş büyüme ortamını atın, iki mililitre PBS ekleyin ve hücreleri yıkamak için tabağı döndürün.

PBS'yi atın ve bir mililitre tripsin EDTA ekleyin. Hücreleri tamamen sindirmek için, tabağı dikkatlice döndürün ve çözeltiyi aspire edin. Ardından, tabağı bu 37 santigrat derece su ceketli C02 inkübatöre üç dakika koyun.

Hücreler kuluçkaya yatırılırken, her oyuğa iki mililitre dengelenmiş büyüme ortamı ekleyerek altı oyuklu bir plaka hazırlayın. Daha sonra, hücreler tabağın dibinden kaldırıldığında, tabağa bir mililitre dengeli büyüme ortamı ekleyin. Pipetleme ile karıştırın ve hazırlanan altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna hemen 0.1 mililitre hücre süspansiyonu aktarın.

Süspansiyonu kuyucuklara nazikçe pipetleyin ve hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Ertesi gün, hücrelerin %85-95 oranında birleştiğinden emin olun. Daha sonra, iki steril mikrosantrifüj tüpüne, bir tüpe üç mikrogram plazmit DNA ve 100 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı ekleyin.

Bu arada, başka bir tüpe dokuz mikrolitre reaktif bir ve 100 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Seyreltilmiş plazmit karışımını seyreltilmiş reaktif ile birleştirin.

Daha sonra çözeltiyi yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Hücrelerin ortamını aspire edin ve FBS olmadan 1.5 mililitre taze DMEM ekleyin. Ardından, her bir oyuğa damla damla 215 mikrolitre DNA transfeksiyon reaktif karışımı ekleyin ve plakayı döndürerek hafifçe karıştırın.

Plakayı 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de dört ila sekiz saat inkübe edin. Ardından, ortamı %10 FBS'li taze DMEM ile değiştirin. Herhangi bir deney yapmadan önce hücreleri 24 ila 48 saat daha inkübe edin.

Transfeksiyon verimliliği, farklı hücre hatlarında büyük ölçüde değişebilir. Bu nedenle, kullanılan belirli hücre tipine bağlı olarak, biriktirme ve bıçaklama işleminin optimizasyonu gerekli olabilir. Büyüme ortamını altı kuyulu kültür plakasından çıkarın.

Ardından, hücre tek tabakasını yıkamak için bir mililitre PBS kullanın. 0,5 mililitre tripsin EDTA ekleyin, tabağı döndürün ve çözeltiyi aspire edin. Ardından, kültür plakasını 37 santigrat derecede üç dakika inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 15 milimetre çapında steril lameller yerleştirin. Hücreleri küçük bir hacimde taze tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin ve gerekli sayıda hücreyi lameller ile 12 oyuklu plakaya aktarın. Ardından, hücreleri 16 ila 24 saat inkübe edin.

16 ila 24 saatlik inkübasyondan sonra, hücreler birleşmeye yakın bir şekilde büyüdüğünde, her bir oyuğa beş mikromolar membran probu dereotu ekleyin ve hücreleri 30 dakika boyunca inkübatöre geri koyun. Dengelenmiş büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri iki kez yıkamak için soğuk PBS kullanın. Daha sonra, her oyuğa bir mililitre% 4 PFA ekleyin ve hücreleri sabitlemek için hücreleri 15 dakika çalkalayın.

PBS ile sabit hücreleri iki kez yıkayın, ardından her bir oyuğa 200 ila 300 mikrolitre DAPI ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Hücreleri PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, lamelleri plakadan dikkatlice çıkarın ve fazla tamponu fitilleyin. Lamelleri, bir damla montaj ortamı ile yüklenmiş mikroskop slaytlarına ters çevirin.

Ardından, fazla montaj ortamını kızaklardan çıkarın. Birleşme noktasına yakın büyümüş hücreleri kullanarak, dengelenmiş büyüme ortamını çıkarın ve taze ısıtılmış DMEM ekleyin. Hücreleri bir saat inkübe edin.

Hücreleri 30 dakika boyunca farklı konsantrasyonlarda ligand ile tedavi edin. Ve hücreleri, burada gösterilen farklı süreler için 10 ila negatif altı molar ligand ile tedavi edin. Hücreleri iki kez yıkamak için soğuk PBS kullanın, ardından hücreleri 15 dakika boyunca hafifçe çalkalamadan önce her bir oyuğa PBS'de bir mililitre% 4 PFA ekleyin.

Hücreleri PBS'de iki kez yıkadıktan sonra, lamelleri plakanın kuyucuklarından dikkatlice çıkarın ve bu videoda daha önce gösterildiği gibi monte edin. Konfokal mikroskopi yapmak için, cıva lamba gücü, PC mikroskobu, tarayıcı ve lazer dahil olmak üzere konfokal mikroskobun donanımını açın. Yazılımı başlatın, ardından yapılandırmayı kontrol edin ve lazeri seçin.

Konfokal mikroskopi sisteminin farklı birimlerini talimatlara göre açın. Hazırlanmış bir slaytı mikroskop tablasına yerleştirin ve numuneyi objektif merceğin üzerine konumlandırmak için tabla kontrolörünü kullanın. Yağa daldırma lensi için, lamel üzerine bir damla sedir yağı ekleyin ve lamel lense bakacak şekilde slaytı yönlendirin.

Floresan altında, ilgilendiğiniz hücreleri bulun, ardından tarama moduna geçin ve emisyon floroforunun lazer gücünü ve spektral aralığını seçin. Lazer yoğunluğunu ve diğer parametreleri ayarlayarak yüksek kaliteli görüntüler yakalayın. Bu şekil, HEK293 hücrelerinde pEGFP-N1'in ekspresyonunu göstermektedir.

GFP sinyali sitoplazmada ve çekirdekte tespit edildi. S-Japonica veya SjGnRHR'den gonadotropin salgılatıcı hormon reseptörlerinin HEK293 hücrelerindeki hücre altı lokalizasyonu burada gösterilmiştir. EGFP reseptörleri yeşil renktedir ve hücre zarını vurgulayan Dil boyaması kırmızı renktedir.

Reseptörlerin plazma zarına lokalize olduğu görülür. SjGnRHR'lerin içselleştirilmesini görselleştirmek için, hücreler farklı konsantrasyonlarda gonadotropin salgılayan hormon ile tedavi edildi. Burada görüldüğü gibi, reseptörlerin içselleştirilmesi doza bağımlı bir şekilde ilerledi ve reseptör, 10 ila eksi altı molar ligand ile hücre yüzeyinden tamamen içselleştirildi.

Farklı zaman periyotları için 10 ila eksi altı molar ligand ile tedavi edildiğinde, içselleştirilmiş SjGnRHR'ler agonist simülasyonundan 10 dakika sonra tespit edilebilir ve aşırı içselleştirme 60 dakika sonra meydana geldi. HEK293 hücrelerinde gösterildiği gibi, her iki deneyde de, floresan SjGnRHR EGFP füzyon proteini esas olarak plazma zarına lokalize edildi ve hücrelere dramatik ve hızlı bir şekilde içselleştirildi. Bu prosedürü denerken, hücreleri bakteri, mantar ve mikoplazma kontaminasyonu olmadan doğru koşullar altında tutmayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, protein reseptörlerinin V'yi geçmesindeki ikinci gibi ek soruları yanıtlamak için hücre kontrolü ve immobilizasyon gibi yöntemler gerçekleştirilebilir. Her gelişmeden sonra teknoloji, hücre biyolojisi ve biyokimya alanındaki araştırmacıların, çeşitli hücre hatlarındaki transmembran reseptörlerinin lokalizasyonunu ve içselleştirilmesini keşfetmelerinin yolunu açtı.