Embriyonik Kök Hücre Pluripotansını Yüksek Verimli İnhibitör Taramayla Düzenleyen Kinazları Tanımlamak İçin Basit Bir Yöntem
May 12th, 2017
Burada, saf ön hazırlıklı pluripotent geçiş kinaz regülatörleri için hedeflenmiş küçük molekül ekranları gerçekleştirmek için nicel ve ölçeklenebilir bir protokol sunuyoruz.
Bu taramanın genel amacı, embriyonik kök hücre pluripotentliğini modüle eden küçük moleküllü protein kinaz inhibitörlerini tanımlamaktır. Bu yöntem, embriyonik kök hücre pluripotentliğini düzenleyen yeni protein kinaz sinyal yolaklarını tanımlayarak embriyonik kök hücre sinyalleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu nedenle, bu tekniğin ana avantajı, ekranın standart laboratuvar ekipmanı ve kolayca bulunabilen reaktifler kullanılarak gerçekleştirilmesinin nispeten kolay olmasıdır.
Bu yöntem için ilk olarak, pluripotents sinyal yolaklarındaki çoğu araştırmanın kinome'un geniş dalgalarını tamamen göz ardı ettiğini fark ettiğimizde aklımıza geldi. 10 santimetrelik plakalara beş mililitre %0,1 jelatin ekleyerek jelatin kaplı 10 santimetrelik tabaklar hazırlayın. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe ettikten sonra jelatini aspire edin ve plakayı iki dakika kurumaya bırakın.
Ardından, mililitre başına 100 nanogram GST etiketli LIF, %10 fetal buzağı serumu ve %5 nakavt serum replasmanı içeren standart fare ES hücre ortamındaki kaplanmış tabakların üzerine herhangi bir standart fare ES hücre hattını yerleştirin. Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 CO2'de kültürleyin ve ortamı her gün değiştirin. Fare ES hücrelerini, ortamı aspire ederek ve plaka başına beş mililitre fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayarak her iki günde bir yaklaşık% 80 birleşim hızında geçirin.
Ardından, fare ES hücrelerinin plakası başına bir mililitre tripsin EDTA ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tripsinlenmiş hücreleri dört mililitre ortamda tekrar askıya alın ve hücreleri beş dakika boyunca 1200 RPM'de santrifüjleyin. Elde edilen hücre peletini beş mililitre ortamda iyice yeniden süspanse edin, tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
10 mikrolitrelik bir hücre süspansiyonu ve 10 mikrolitre tripan mavisini birleştirerek hücreleri sayın. Karışımı bir hücre sayma odasına yerleştirin veya bir hemositometre ve ışık mikroskobu kullanın. Daha sonra, 3000 fare ES hücresini, çok kanallı bir pipet kullanarak 100 mikrolitre ortamın son hacminde %0,1 jelatin kaplı 96 oyuklu plakalara tohumlayın.
Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak kinaz inhibitörlerini bir ila 100 seyreltmede uygulayın. İnhibitörü ve hücre süspansiyonunu karıştırmak için ortamı nazikçe pipetleyin. Ardından, kaplama yüzeyi boyunca eşit dağılımı sağlamak için hücrelerin bir saat boyunca bir doku kültürü başlığına yerleşmesine izin verin.
Ortamı değiştirmeden hücreleri 48 saat boyunca kültürleyin. Tarama analizine başlamak için, çok kanallı bir aspiratör ve pipetler kullanarak 96 kuyulu fare ES hücre plakasını 200 mikrolitre PBS'de yıkayın. Yıkadıktan sonra, hücre ekstraktlarını 150 mikrolitre lizis tamponunda karıştırın.
Ekstraktları, V tabanlı 96 oyuklu plakalarda 30 dakika boyunca 1500 kez G'de santrifüjleme ile berraklaştırın. Ardından, 100 mikrolitre süpernatanı, 96 kuyulu vakumlu nokta grafiği manifoldu kullanarak bir nitroselüloz membran üzerine hareketsiz hale getirin. Membranı kurulayın ve tutarlı bir aktarım sağlamak için 40 mililitre Ponceau S ile boyayın.
Membranı TBST ile yıkadıktan sonra, TBST artı% 3 sütle bloke edin. Daha sonra, zarı Nanog ve Dnmt3b antikorları içinde, gece boyunca bloke edici tamponda bir ila 1000 seyreltmede inkübe edin. Ertesi gün, zarı TBST'de 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
Daha sonra, bloke edici tamponda bir ila 10.000 seyreltmede 30 mililitre ikincil antikor içinde inkübe edin. Dijital bir immünoblotlama görüntüleme sistemi kullanarak zarı geliştirin. Devam etmeden önce konvansiyonel immünoblotlama kullanılarak ekranda tanımlanan kinaz inhibitörlerini doğrulamak çok önemlidir.
Bu, daha fazla aşağı akış analizinden önce yanlış pozitiflerin kaldırılmasına yardımcı olur. Ekran verilerini analiz edin ve inhibitörleri metin protokolünde açıklandığı gibi iyi niyetli pluripotens düzenleyiciler olarak doğrulayın. Burada, gerçekleştirilen ekrandan temsili bir Nanog nokta grafiği gösterilmektedir.
Astarlanmış veya naif pluripotentliği tetikleyen pozitif kontrol inhibitörleri vurgulanır. Ayrıca, gerçekleştirilen ekrandan temsili bir Dnmt3b nokta grafiği de gösterilir. Astarlanmış veya naif pluripotentliği sağlayan pozitif kontrol inhibitörleri tekrar vurgulanır.
Bu grafikte, inhibitörler Nanog / Dnmt3b oranı için sıralandı. Naif veya astarlanmış pluripotentliği stabilize eden inhibitörleri tanımlamak için iki katlı bir Nanog - Dnmt3b oran eşiği ayarlanmıştır. Summed Nanog ve Dnmt3b sinyalleri de sağlanır.
Ek olarak, daha fazla doğrulama için seçilen kinaz inhibitörleri not edilir. Burada, seçilen kinaz inhibitörlerinin, Nanog ve Dnmt3b immünoblotlarının konvansiyonel bir immünoblot validasyonu ve ayrıca Nanog / Dnmt3b oranı ve toplam sinyal sağlanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, embriyonik kök hücre pluripotentliğini modüle eden küçük moleküllü kinaz inhibitörlerinin nasıl tanımlanacağını iyi anlamış olmalısınız.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 72 saat içinde yapılabilir. Bu yöntem, pluripotentliği kontrol eden kinaz sinyal yolları hakkında bilgi sağlayabilse de, embriyonik kök hücre farklılaşmasına ve epigenetik değiştiriciler gibi diğer düzenleyici sistemlere de uygulanabilir. Prosedürü takiben, epigenetik değiştiricileri hedefleyenler gibi küçük molekül inhibitörlerinin diğer kütüphaneleri, pluripotent düzenlemedeki yeni oyuncuları tanımlamak için kullanılabilir.
Geliştirildikten sonra, bu teknik araştırma grubumuzun yeni pluripotents sinyal yollarını aydınlatmasının yolunu açtı. Bu tekniği, pluripotentliği düzenlemede amplifiye edilmiş yol için yeni bir rol tanımlamak için kullanıyoruz.
Genel Bakış
Bu makale, naif-primed pluripotent geçişin kinaz düzenleyicilerini tanımlamayı amaçlayan hedefli küçük molekül ekranları için nicel ve ölçeklenebilir bir protokol sunar. Yöntem, embriyonik kök hücre sinyal iletimi yolaklarının anlaşılmasını artırmak için tasarlanmıştır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Kök Hücre Araştırması
- Sinyal İletimi
Arka Plan
- Embriyonik kök hücre pluripotensi çeşitli sinyal iletimi yoluyla düzenlenir.
- Önceki araştırmalar kinozların birçok bileşenini göz ardı etmiştir.
- Yeni kinaz inhibitörlerinin tanımlanması, pluripotensite düzenlemesi hakkında bilgiler sağlayabilir.
- Bu çalışma, kök hücrelerde kinaz sinyalindeki mevcut bilgilerdeki boşlukları doldurmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Embriyonik kök hücre pluripotensitesini modüle eden küçük molekül protein kinaz inhibitörlerini tanımlamak.
- Pluripotensite ile ilgili yeni protein kinaz sinyal iletimi yolunu açıklamak.
- Standart laboratuvar ekipmanları kullanarak basit bir tarama yöntemi geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre kültürü için jelatin kaplı kapların hazırlanması.
- Farklı embriyonik kök hücrelerin ekilmesi ve kinaz inhibitörlerinin uygulanması.
- İmmunoblotting teknikleriyle tarama analizi.
- Tanımlanan kinaz inhibitörlerinin konvansiyonel yöntemlerle doğrulanması.
Ana Sonuçlar
- Naif veya prime pluripotensiteyi stabilize eden kinaz inhibitörlerinin başarılı bir şekilde tanımlanması.
- Veri analizi, inhibitör seçimi için iki kat Nanog ila Dnmt3b oranı eşiğini ortaya çıkardı.
- Seçilen inhibitörlerin doğrulanması, pluripotensiteyi düzenlemede rollerini doğruladı.
- Elde edilen bilgiler, diğer düzenleyici sistemler ve farklılaşma süreçlerine uygulanabilir.
Sonuçlar
- Geliştirilen protokol, kinaz inhibitörlerinin verimli şekilde taranmasına olanak tanır.
- Bu yöntem, embriyonik kök hücre farklılaşmasının incelenmesi için uyarlanabilir.
- Gelecek uygulamaları, pluripotensite düzenlemesinde epigenetik değiştiricilerin araştırılmasını içerebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to systematically interrogate kinase signaling networks that govern pluripotency transitions, a critical inflection point in stem cell-based therapeutic development. By providing a scalable, reagent-efficient platform for target de-risking, it supports early-stage hypothesis testing and mechanistic insight into cell fate regulation. The approach enhances predictive confidence in target selection by linking kinase modulation to defined pluripotency biomarkers, informing portfolio prioritization in regenerative medicine and disease modeling pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of kinase-dependent mechanisms underlying naïve-primed pluripotency transitions.
- Operational Value: Uses standard cell culture and immunoblotting infrastructure, minimizing specialized equipment needs.
- Predictive Value: Identifies kinase inhibitors that modulate pluripotency biomarkers (Nanog/Dnmt3b) to support target hypothesis validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative immunoblot readouts (Nanog, Dnmt3b, ratio) for hit identification in kinase-focused screens.
- Operational Value: Compatible with 96-well formats and multichannel pipetting for medium-throughput compound evaluation.
- Assay Readiness: Produces normalized, reproducible signals enabling cross-plate comparison and threshold-based hit selection (e.g., two-fold Nanog/Dnmt3b ratio).
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links kinase activity to pluripotency states relevant for disease modeling and regenerative applications.
- Mechanistic De-risking: Clarifies signaling pathways upstream of core pluripotency factors, reducing ambiguity in target mechanism.
- Preclinical Relevance: Supports validation of kinase targets in stem cell-derived models prior to differentiation or tissue-specific assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, connecting target hypothesis testing to assay development and preclinical validation through measurable biomarker outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening of kinase libraries to clarify signaling nodes in pluripotency regulation.
- Screening: Enables standardized, reproducible compound screening in ESC models using accessible reagents and detection methods.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized immunoblot data (signal intensity, ratios) to prioritize hits based on pluripotency effects.
- Translational Research: Connects kinase modulation to stem cell state transitions, informing downstream differentiation and disease model relevance.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted for other small molecule libraries (e.g., epigenetic modifiers) and stem cell contexts beyond pluripotency screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in kinase-target pluripotency relationships through biomarker-linked phenotypic readouts.
- Operational Value: Leverages standard lab equipment (incubator, centrifuge, immunoblot system) for broad accessibility across discovery teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early functional validation of kinase targets in a physiologically relevant system.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization by identifying kinases that modulate defined pluripotency states.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic stem cell culture and maintenance under defined conditions.
- Dependent on access to immunoblotting infrastructure and validated antibodies (e.g., Nanog, Dnmt3b).
- Necessitates standardization of cell seeding density, inhibitor dosing, and incubation times for assay reproducibility.
- Adaptation to other model systems may require optimization of coating, media, and passaging protocols.
- False positive rates require orthogonal validation (e.g., conventional immunoblot) to confirm target engagement and specificity.
