Embriyonik Kök Hücre Pluripotansını Yüksek Verimli İnhibitör Taramayla Düzenleyen Kinazları Tanımlamak İçin Basit Bir Yöntem

Bu taramanın genel amacı, embriyonik kök hücre pluripotentliğini modüle eden küçük moleküllü protein kinaz inhibitörlerini tanımlamaktır. Bu yöntem, embriyonik kök hücre pluripotentliğini düzenleyen yeni protein kinaz sinyal yolaklarını tanımlayarak embriyonik kök hücre sinyalleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu nedenle, bu tekniğin ana avantajı, ekranın standart laboratuvar ekipmanı ve kolayca bulunabilen reaktifler kullanılarak gerçekleştirilmesinin nispeten kolay olmasıdır.

Bu yöntem için ilk olarak, pluripotents sinyal yolaklarındaki çoğu araştırmanın kinome'un geniş dalgalarını tamamen göz ardı ettiğini fark ettiğimizde aklımıza geldi. 10 santimetrelik plakalara beş mililitre %0,1 jelatin ekleyerek jelatin kaplı 10 santimetrelik tabaklar hazırlayın. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe ettikten sonra jelatini aspire edin ve plakayı iki dakika kurumaya bırakın.

Ardından, mililitre başına 100 nanogram GST etiketli LIF, %10 fetal buzağı serumu ve %5 nakavt serum replasmanı içeren standart fare ES hücre ortamındaki kaplanmış tabakların üzerine herhangi bir standart fare ES hücre hattını yerleştirin. Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 CO2'de kültürleyin ve ortamı her gün değiştirin. Fare ES hücrelerini, ortamı aspire ederek ve plaka başına beş mililitre fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayarak her iki günde bir yaklaşık% 80 birleşim hızında geçirin.

Ardından, fare ES hücrelerinin plakası başına bir mililitre tripsin EDTA ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tripsinlenmiş hücreleri dört mililitre ortamda tekrar askıya alın ve hücreleri beş dakika boyunca 1200 RPM'de santrifüjleyin. Elde edilen hücre peletini beş mililitre ortamda iyice yeniden süspanse edin, tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.

10 mikrolitrelik bir hücre süspansiyonu ve 10 mikrolitre tripan mavisini birleştirerek hücreleri sayın. Karışımı bir hücre sayma odasına yerleştirin veya bir hemositometre ve ışık mikroskobu kullanın. Daha sonra, 3000 fare ES hücresini, çok kanallı bir pipet kullanarak 100 mikrolitre ortamın son hacminde %0,1 jelatin kaplı 96 oyuklu plakalara tohumlayın.

Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak kinaz inhibitörlerini bir ila 100 seyreltmede uygulayın. İnhibitörü ve hücre süspansiyonunu karıştırmak için ortamı nazikçe pipetleyin. Ardından, kaplama yüzeyi boyunca eşit dağılımı sağlamak için hücrelerin bir saat boyunca bir doku kültürü başlığına yerleşmesine izin verin.

Ortamı değiştirmeden hücreleri 48 saat boyunca kültürleyin. Tarama analizine başlamak için, çok kanallı bir aspiratör ve pipetler kullanarak 96 kuyulu fare ES hücre plakasını 200 mikrolitre PBS'de yıkayın. Yıkadıktan sonra, hücre ekstraktlarını 150 mikrolitre lizis tamponunda karıştırın.

Ekstraktları, V tabanlı 96 oyuklu plakalarda 30 dakika boyunca 1500 kez G'de santrifüjleme ile berraklaştırın. Ardından, 100 mikrolitre süpernatanı, 96 kuyulu vakumlu nokta grafiği manifoldu kullanarak bir nitroselüloz membran üzerine hareketsiz hale getirin. Membranı kurulayın ve tutarlı bir aktarım sağlamak için 40 mililitre Ponceau S ile boyayın.

Membranı TBST ile yıkadıktan sonra, TBST artı% 3 sütle bloke edin. Daha sonra, zarı Nanog ve Dnmt3b antikorları içinde, gece boyunca bloke edici tamponda bir ila 1000 seyreltmede inkübe edin. Ertesi gün, zarı TBST'de 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.

Daha sonra, bloke edici tamponda bir ila 10.000 seyreltmede 30 mililitre ikincil antikor içinde inkübe edin. Dijital bir immünoblotlama görüntüleme sistemi kullanarak zarı geliştirin. Devam etmeden önce konvansiyonel immünoblotlama kullanılarak ekranda tanımlanan kinaz inhibitörlerini doğrulamak çok önemlidir.

Bu, daha fazla aşağı akış analizinden önce yanlış pozitiflerin kaldırılmasına yardımcı olur. Ekran verilerini analiz edin ve inhibitörleri metin protokolünde açıklandığı gibi iyi niyetli pluripotens düzenleyiciler olarak doğrulayın. Burada, gerçekleştirilen ekrandan temsili bir Nanog nokta grafiği gösterilmektedir.

Astarlanmış veya naif pluripotentliği tetikleyen pozitif kontrol inhibitörleri vurgulanır. Ayrıca, gerçekleştirilen ekrandan temsili bir Dnmt3b nokta grafiği de gösterilir. Astarlanmış veya naif pluripotentliği sağlayan pozitif kontrol inhibitörleri tekrar vurgulanır.

Bu grafikte, inhibitörler Nanog / Dnmt3b oranı için sıralandı. Naif veya astarlanmış pluripotentliği stabilize eden inhibitörleri tanımlamak için iki katlı bir Nanog - Dnmt3b oran eşiği ayarlanmıştır. Summed Nanog ve Dnmt3b sinyalleri de sağlanır.

Ek olarak, daha fazla doğrulama için seçilen kinaz inhibitörleri not edilir. Burada, seçilen kinaz inhibitörlerinin, Nanog ve Dnmt3b immünoblotlarının konvansiyonel bir immünoblot validasyonu ve ayrıca Nanog / Dnmt3b oranı ve toplam sinyal sağlanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, embriyonik kök hücre pluripotentliğini modüle eden küçük moleküllü kinaz inhibitörlerinin nasıl tanımlanacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 72 saat içinde yapılabilir. Bu yöntem, pluripotentliği kontrol eden kinaz sinyal yolları hakkında bilgi sağlayabilse de, embriyonik kök hücre farklılaşmasına ve epigenetik değiştiriciler gibi diğer düzenleyici sistemlere de uygulanabilir. Prosedürü takiben, epigenetik değiştiricileri hedefleyenler gibi küçük molekül inhibitörlerinin diğer kütüphaneleri, pluripotent düzenlemedeki yeni oyuncuları tanımlamak için kullanılabilir.

Geliştirildikten sonra, bu teknik araştırma grubumuzun yeni pluripotents sinyal yollarını aydınlatmasının yolunu açtı. Bu tekniği, pluripotentliği düzenlemede amplifiye edilmiş yol için yeni bir rol tanımlamak için kullanıyoruz.