Name: Embriyonik Kök Hücre Pluripotansını Yüksek Verimli İnhibitör Taramayla Düzenleyen Kinazları Tanımlamak İçin Basit Bir Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Öğrenin, yüksek verimli inhibitör taramasıyla embriyonik kök hücre pluripotansını düzenleyen kinazları tanımlamak için basit bir yöntem. Bu teknik, standart laboratuvar ekipmanları kullanılarak 72 saatte tamamlanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CACW bir Tıbbi Araştırma Konseyi doktora öğrencisi tarafından desteklenmektedir. GMF kısmen Tıbbi Araştırma Konseyi Yeni Araştırmacı Ödülü (MR / N000609 / 1) ve Tenovus İskoçya araştırma ödeneği tarafından desteklenmektedir.

1. Küçük Molekül Kinaz İnhibitör Kütüphanelerinin Harmanlanması <ol><li> Herkes tarafından erişilebilen kinaz inhibitör koleksiyonlarından elde edilen harmanlama inhibitörü kütüphaneleri, örneğin 228 güçlü ve seçici kinaz inhibitörlerinden (http://lincs.hms.harvard.edu) oluşan bir koleksiyon olan Harvard Medical School&#39;tan Entegre Ağa Dayalı Hücresel İmzalar Kütüphanesi (LINCS) Ve endüstriyel araştırmacılar tarafından bir araya getirilen 376 bileşik koleksiyonu olan Protein Kinaz İnhibitör Seti (PKIS) (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 bulunmaktadır. Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen bileşiklerden bir ısmarlama kinaz önleyici koleksiyonu monte edin. NOT: Laboratuarımızda, hepsi ticari kaynaklardan temin edilebilen 51 primer hedef kinazı kapsayan 72 güçlü ve seçici takım kinaz inhibitörü topluluğunu bir araya getirdik. </li><li> Birden fazla konsantrasyonda optimum yüksek verimli işleme için kinaz inhibitörlerini 96 oyuklu plakalar halinde bir araya getirin (kullanım 1, 0.1 aNd 0.01 mM). Her bir plakaya sırasıyla saf DMSO içeren referans plakaları ve sırasıyla naif ve primer pluripotent durumu teşvik ettiği bilinen referans kontrol inhibitörleri PD173074 (FGFRi) ve Ruxolitinib&#39;i (JAKi) ekleyin. Elektronik tablo veya benzeri bir yazılımda açıklama yapın. </li></ol> 2. MESC Kültür Hazırlama Şartları ve Prosedürleri <ol><li> 10 cm tabaklara% 0.1 (w / v) jelatin 5 ml ekleyerek% 0.1 jelatin kaplı 10 cm yemekleri hazırlayın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Jelatı alın ve 2 dakika boyunca tabağı kurumaya bırakın. </li><li> 100 ng / mL GST-LIF,% 10 Fetal Buzağı Serum ve% 5 Nakavt Serumu içeren standart mESC ortamında (bkz. Malzeme Tablosu )% 0.1 jelatin kaplı 10 cm bulaşıkların 37 ° C&#39;lik% 5 CO 2&#39;de herhangi bir standart mESC hattını kültürleyin Değiştirme. Her geçen gün medyayı değiştirin ve her iki günde bir% 80 konfluenasyondaki MESC&#39;leri 1: 5-1: 10&#39;luk bir seyreltme ile geçirin. </li><li> MESC&#39;leri geçmek için, ortamı aspire edin ve 5 mL o ile yıkayın.F fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkanır. </li><li> MESC plakası başına 1 mL tripsin-EDTA (% 0.05 0.05 tripsin,% 0.02 EDTA) ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 4 mL&#39;lik mESC medyumunda tripsinize edilmiş hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve 5 dakika süreyle 1,200 rpm&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Tek bir hücre süspansiyonu üretmek için yukarı ve aşağı pipetleme, 5 mL&#39;lik mESC ortamı içinde hücre topağını iyice süspanse edin. </li><li> 10 mcL hücre süspansiyonu ve 10 mcL Trypan Mavisi (% 0.4) birleştirerek hücreleri sayın. Bir hücre sayma odasına yerleştirin veya bir hemositometre ve ışık mikroskopu kullanın. </li><li> Çok kanallı bir pipet kullanarak% 0.1 jelatin kaplı 96 gözlü plakalara, son hacimde 100 uL medyaya 3 x 10 3 mESC tohumlayın. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak kinaz inhibitörlerini 1: 100 seyreltmede (1 uL inhibitör 100 uL medyaya ilave edilir) uygulayın. İnhibitör ve hücre süspansiyonunu karıştırmak için hafifçe pipetle sıkıştırın, daha sonra eşit dağılımı sağlamak için 1 saat boyunca hücrelerin bir doku kültürü kapağına yerleşmesine izin verin.Kaplama yüzeyi. Medyayı değiştirmeden 48 saat boyunca kültür hücreleri. NOT: 1 / 0.1 / 0.01 mM stok plakaları, sırasıyla 10/1 / 0.1 μM son bir inhibitör konsantrasyonu verecektir. Hedef dışı etkileri en aza indirirken birincil hedef kinazların etkin bir şekilde inhibe edilmesini sağlamak için, ekranı 1 μM son konsantrasyonda başlatmanızı öneririz. </li></ol> 3. Kinaz İnhibitör Tarama Analizi <ol><li> Çok kanallı aspiratör ve pipetleri kullanarak 200 mcL PBS&#39;de 96 oyuklu mESC plakalarını yıkayın. </li><li> 150 μL liziz tamponu (20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 1 NP-40 (v / v),% 0.5 sodyum deoksikolat (w / v), 10 mM β-gliserofosfat , 10 mM sodyum pirofosfat, 1 mM NaF, 2 mM Na3V04, Komple Proteaz İnhibitörü Kokteyl Tabletleri). </li><li> Özleri, V-tabanlı 96 oyuklu plakalarda 30 dakika 1,500 xg&#39;de santrifüjle açıklayın. </li><li> Bir nitrol üzerine 100 μL süpernatantları hareketsiz hale getirinLüloz membran kullanılarak 96 oyuklu vakum nokta leke manifoldu kullanıldı. </li><li> Membranı kurutun ve tutarlı transferi sağlamak için 40 mL Ponceau S ile leke uygulayın. </li><li> Membranı TBST ile yıkayın ve TBST /% 3 (ağırlık / hacim) sütte bloke edin. </li><li> Nanog ve Dnmt3b antikorlarında TBST /% 3 (ağırlık / hacim) süt tozu içinde gece boyunca 1: 1000 (v / v) seyreltme ile inkübe edin. </li><li> Membranları TBST içinde 3 x 10 dakika yıkayın ve TBST /% 3 (ağırlık / hacim) sütte 1: 10,000 (v / v) seyreltilmiş 30 mL ikincil antikor içerisinde inkübe edin. </li><li> Dijital immünobotlama görüntüleme sistemi kullanarak geliştirin. NOT: Mümkünse, Nanog ve Dnmt3b&#39;yi tespit etmek için kantitatif floresans immünoblotlama kullanın. Bununla birlikte, floresans immünoblotlama ile Dnmt3b için arka plan sinyali çok yüksektir. Bu nedenle, 800 nm floresans anti-tavşan (Nanog) ve anti-fare-HRP (Dnmt3b) sekonder antikorlar kullanılır. </li></ol> 4. Ekran Verilerinin Analizi ve Bona Fide Pluripens Regülatörleri Olarak İnhibitörlerin Validasyonu <p class="jove_content"&gt; NOT: Bu sadece iyi niyetli pluripotens modülatörlerinin tanımlanmasını sağlamak için kritik bir adımdır. Hem Nanog: Dnmt3b oranına, hem de genel sinyal temelli inhibitörlerin, mESC sağkalımını olumsuz yönde etkileyen kinaz inhibitörlerinin daha ileri analiz için seçilmemesini sağlamak için ayrılması zorunludur. <ol><li> İmmünoblot analizi yazılımı kullanarak Nanog ve Dnmt3b sinyalini nicelleştirin ve değerleri bir elektronik tabloya veya benzer bir yazılıma aktarın. DMSO kontrolü ile karşılaştırıldığında tüm numuneler için Nanog: Dnmt3b oranını hesaplayın. Ayrıca, kinaz inhibitörlerinin, mESC canlılığını değiştirerek Nanog: Dnmt3b oranını etkilemediğinden emin olmak için toplam Nanog ve Dnmt3b sinyalini belirleyin. </li><li> Saf bulleşikliği (Nanog: Kontrolten daha yüksek olan Dnmt3b oranı) ve başlatılmış pluripotansı (Nanog: Dnmt3b oranı kontrolden düşük) teşvik eden inhibitörleri tanımlamak için sıralı Nanog: Dnmt3b oranlarını kullanın. Kontrol değerlerinden 2x sapma değerinde kesme değerini ayarlayın ve toplam Nanog + Dnmt3b sinyali üreten kinaz inhibitörlerini filtreleyinNaif (yüksek Nanog: Dnmt3b oranı) ve astarlanmış (düşük Nanog: Dnmt3b oranı) pluripotent durumları stabilize eden kinaz inhibitörlerinin yüksek bir güven listesinin üretilmesi için DMSO kontrol değerinin% 50&#39;si. </li><li> 2 mL&#39;lik ortamda 6 kuyucukta 2 x 105 hücreye mESC&#39;leri ekleyerek kinaz inhibitörlerini doğrulayın ve ortam değiştirmeden 48 saat boyunca 1 uM&#39;de kinaz inhibitörleri ekleyin. </li><li> MESC&#39;leri liziz tamponunda Lyse edin ve geleneksel SDS-PAGE imünoblotlama ile Nanog ve Dnmt3b ekspresyonunu analiz edin. </li><li> Çabukluğun, 48 saatlik inhibitör tedavisinin ardından muhafaza edildiğinden emin olmak için, Naif pluripotik belirteçler Klf2 ve Klf4 ve Oct4&#39;ün SDS-PAGE immünoblotlaması ile isabetlerini doğrulayın. </li></ol>

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+primed+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).</li>
<li>Boroviak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-Specific+Profiling+Delineates+the+Emergence+and+Progression+of+Naive+Pluripotency+in+Mammalian+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis.</a> Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).</li>
<li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448 (7150), 196-199 (2007).</li>
<li>Brons, I. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).</li>
<li>Festuccia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esrrb+is+a+direct+Nanog+target+gene+that+can+substitute+for+Nanog+function+in+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).</li>
<li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klf4+reverts+developmentally+programmed+restriction+of+ground+state+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency.</a> Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).</li>
<li>Chambers, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li>
<li>Findlay, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+domains+of+Sos1%2FGrb2+are+finely+tuned+for+cooperative+control+of+embryonic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate.</a> Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).</li>
<li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).</li>
<li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+stimulation+of+the+Erk1%2F2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).</li>
<li>Elkins, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+characterization+of+the+Published+Kinase+Inhibitor+Set%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).</li>
<li>Williams, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erk5+Is+a+Key+Regulator+of+Naive-Primed+Transition+and+Embryonic+Stem+Cell+Identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity.</a> Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).</li>
<li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules.</a> Science. 352 (6290), (2016).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+reprogramming+of+fibroblasts+into+neural+stem+cells+by+signaling-directed+transcriptional+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar bu çalışmadan doğan herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ettiler.

Burada, naif başlangıçlı pluripotent geçişin düzenlenmesinde kinaz sinyal yollarının rolünü araştırmak için yaygın olarak erişilebilen bir metodolojiyi göstermektedir. Bu ESC alanında önemli bir soruyu ele alıyor. Yüksek verimli genomik ve transkriptomik yaklaşımlar, naif ve başlangıçlı pluripotent durumların anahtar transkripsiyonel regülatörlerini tanımlamak için rutin olarak kullanılır, ancak pluripotens sinyal şebekelerini aydınlatmanın zor olduğu kanıtlanmıştır. Şimdi, mESC&#39;lerde naif başlangıçlı pluripotent geçişini kontrol eden kinazları tanımlamak için kimyasal inhibitörleri kullanan esnek bir strateji sunuyoruz. Bu, hücrenin sinyal verme ve ESC biyolojisi üzerine çalışan çoğu laboratuarda bulunan basit ekipman, reaktifler ve malzemeler üzerine kuruludur. Bu platformun başarısı için kritik olan, naif ve başlatılmış pluripotent durumlar arasındaki geçişin nicelleştirilmesi için sağlam bir analiz geliştirmemizdir. Bu tahlilin oluşturulması, hücre platinde önemli iteratif değişiklikler gerektirdiYoğunluk, inhibitör inkubasyon zamanı ve immunoblotlama koşulları. Küçük molekül yaklaşımları, terapötik ESC uygulamalarında rasyonel kullanım için çekiş kazanmaktadır 15 , 16 . Küçük molekül taramalarının önemli bir gücü, araç bileşimlerinin etkin hücre alımı için tasarlanmış ve / veya modifiye edilmiş olmasıdır. Transfeksiyon etkinliği sınırlayıcı değildir ve lentivirüs gibi tehlikeli iletim sistemlerinin kullanılması gerekli değildir. Ayrıca, inhibitörler sıklıkla bir kinaz ailesi ( örn. , Fgfr1-4, Jak1-3) içindeki birden fazla izoformu inhibe eder ve RNAi ve CRISPR / Cas9 gibi genetik / genetik girişim tekniklerini engelleyen fonksiyonel fazlalığın üstesinden gelir. Hem akademik hem de farmasötik ilaç keşfi programlarından daha güçlü ve seçici araç bileşikleri elde edildiğinde, az öğrenilen ve iyi anlaşılmayan kinazlar ESC araştırmasının ön planına itilecektir. Bu nedenle, bu yüksekKaba yeme tarama yaklaşımı, temel ESC düzenleyici ağlarına yeni araştırma yolları açacaktır. Bu teknolojinin küçük bir kısıtlaması, en güçlü ve seçici küçük molekül inhibitörleri bile in vivo çoklu ilgisiz kinazlarla etkileşime girip engellemektir. Bununla birlikte, gittikçe genişleyen kinaz inhibitörü profil verisi, kinaz inhibitörlerinin işlevsel hedeflerinin kolayca tanımlanmasına izin verir (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -inhibitors). Son olarak, prensip olarak, platformumuz, yüksek kaliteli immünoblot antikorlarının bulunduğu herhangi bir küçük molekül toplama ve / veya hücresel tahlilin sorgulanması için uygulanabilir. Bu, pluripotens regülasyonunda çoklu düzenleyici sistemlerin incelenmesine ve çeşitli hücresel prosesleri değiştiren küçük molekül inhibitörlerinin tanımlanmasını kolaylaştıracaktır. Özellikle, epijen gibi ortaya çıkan küçük molekül koleksiyonlarınınYapısal Genomik Konsorsiyumu (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) tarafından geliştirilen tik problar, pluripotent geçişlerin daha yeni regülatörlerini ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir.

Embriyonik kök hücreler (ESC&#39;ler), pluripotens 1 olarak bilinen bir fenomen olan yetişkin vücuttaki herhangi bir hücre türüne kendi kendine yenilenme veya ayırma kapasitesine sahiptir. Yeni kanıtlar, &quot;naif&quot; ve &quot;astarlanmış&quot; pluripotency olarak adlandırılan, gelişimsel olarak farklı pluripotent durumların var olduğunu ortaya koymaktadır. Naif ESCler, preimplantasyon embriyo 3&#39;dekine benzer bir gelişim halini temsil eder. Buna karşın, başlatılmış pluripotent ESC&#39;ler pluripotency&#39;den çıkmak ve özelleştirilmiş embriyonik soylara ayırmak için hazırlanırlar 4 , 5 . Naive ve primer pluripotent devletler ayrı gen düzenleyici ağlarla işaretlenir. Naif pluripotik, Nanog, Krueppel benzeri transkripsiyon faktörleri (Klfs), Rex1 2 ve Esrrb gibi anahtar pluripotens transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonuyla karakterizedir <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 6. Fare ESC&#39;lerde (mESC&#39;ler), başlangıçtaki pluripotens, naif belirteçlerin azaltılmış ifadesi ve de novo DNA metil transferaz Dnmt3b&#39;yi içeren spesifik bir gen ekspresyon imza ile karakterize edilir 7 . In vivo , primer pluripotent implant sonrası epiblast kök hücreleri (EpiSCs) 4 , 5 ek olarak Epiblast markörü Fgf5&#39;i ve Brachyury 8 gibi soy primingin belirteçlerini ifade eder. MESC&#39;ler , in vitro saf ön provizyonlu pluripotent geçişleri kontrol eden prob mekanizmalarına uygulanabilir bir model sağlar. Lösemi inhibitör faktör (LIF) ve fetal sığır serumu (FBS) ile kültürlendiğinde, mESC&#39;ler saf ve başlangıçlı pluripotent durumlar arasında dinamik geçiş yapar 9 , 10 . Naif bir gen düzenleyici ağı teşvik etmek için LIF-Jak-Stat3 sinyalizasyon işlevleri 11 </Fibroblast büyüme faktörü 4 (Fgf4) Erk1 / 2 yolak yoluyla otokrin sinyalizasyon, astar hal 12&#39;ye geçişi sağlar. Bununla birlikte, protein kinazların farklı pluripotent durumların belirlenmesindeki rolünü sistematik olarak değerlendirmek de bir meydan okuma olmaya devam etmektedir. Burada, saf ön hazırlıklı pluripotent geçiş kinaz regülatörleri için hedeflenmiş küçük moleküler elekleri gerçekleştirmek için nicel ve ölçeklenebilir bir platform açıklanmaktadır. Basit parazit mukavemeti stabilize etme yeteneği ile kinaz inhibitörlerini ortaya çıkarmak ve doğrulamak için basit mESC kültür koşullarını ve standart reaktifleri, malzemeleri ve ekipmanları kullanırız. Ayrıca, epigenetik düzenleyicileri hedef alan gelişmekte olan inhibitör kütüphaneleri gibi diğer küçük molekül koleksiyonlarının taranması da dahil olmak üzere, bu teknoloji için potansiyel genişletilmiş uygulamaları tartışıyoruz.

<table><tbody><tr><td><güçlü>mESC media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCE mESC'ler</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp; SCRC-1023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>Final: 2 mM</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Final: 50 U / ml</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Final: 0.1 mM</td></tr><tr><td>Lösemi İnhibitör Faktörü (GST füzyonu)</td> <td>MRC-PPU reaktifleri ve hizmetleri</td><td></td><td>Final: 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Lösemi İnhibitör Faktör</td><td>Termo</td><td>PMC9484</td><td>Final: 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>Final: 0.1 mM</td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Final: 1 mM</td></tr><tr><td>Nakavt Serum Replasmanı</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>Final: %5</td></tr> <tr><td>Tanımlanmış Fetal Sığır Serumu</td><td>Fisher</td><td>10703464</td><td>Final:% 10</td></tr> <tr><td><güçlü > Adı< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü ></td></tr> <tr><td>< güçlü >TC malzemeler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol</td><td>kırmızısı Termo</td><td>25300054&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Domuz derisinden elde edilen jelatin</td><td>Sigma</td><td>1890</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96 Kuyulu Mikroplakalar</td><td>Termo</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>V-tabanlı 96 kuyulu plakalar</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651261</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Lysis Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris tamponu</td><td>VWR</td><td>103157P</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>VWR</td><td>97061</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>%1 NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Deoksikolat</td><td>Sigma</td><td>D6750-100g</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; -gliserofosfat</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Pirofosfat</td><td>Sigma</td><td>13472-36-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Florür</td><td>Sigma</td><td>450022</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Ortovanadat</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Roche Tam Proteaz İnhibitörü Kokteyl Tabletleri</td><td>Sigma</td><td>CO-RO</td><td></td></tr> <<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Sigma</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Süt Tozu</td><td>Marvel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Western Blotting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protran BA 85 Nitroselüloz 0.45 ve benzeri; M&nbsp; Gözenek boyutu (20 cm x 20 cm Levhalar) (25 Sayfa)</td><td>GE</td><td>10401191</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P7170-1L</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Laboratuvar Ekipmanları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minifold I Sistem</td><td>GE</td><td>10447850</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc görüntüleyici</td><td>BioRad</td><td>1708280&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LiCor Odyssey Görüntüleyici</td><td>LiCor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Antikorlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare Nanog</td><td>Reprocell</td><td>RCAB001P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Dnmt3b</td><td>Imgenex</td><td>IMG-184A</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Eşek Anti-Tavşan</td><td>Licor</td><td>926-32213</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare-HRP</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf2</td><td>Millipore</td><td>09-820</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4</td><td>R& D Sistemleri</td><td>AF3158</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

embriyonik kök hücre pluripotansını yüksek verimli İnhibitör taramayla düzenleyen kinazları tanımlamak İçin basit bir yöntem

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embriyonik kök hücreler (ESC&#39;ler), kendi kendini yenileyebilir veya pluripotency olarak bilinen bir fenomen olan tüm hücre tiplerine farklılaşabilir. Belirgin pluripotent durumlar &quot;naif&quot; ve &quot;astarlanmış&quot; pluripotency olarak adlandırılmıştır. Saf önlemli geçişi kontrol altına alan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Özellikle, kinetik fonksiyonu araştırmak için yüksek kaliteli alet bileşiklerinin mevcudiyetinin artmasına rağmen, naif ve başlangıçlı pluripotent durumları belirten protein kinazlar hakkında kötü bilgi sahibiyiz. Burada, fare ESC&#39;lerindeki naif başlatılmış pluripotent geçişin kinaz düzenleyicileri için hedeflenmiş küçük moleküler ekranlar gerçekleştirmek için ölçeklenebilir bir platform açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, basit hücre kültürü koşullarını ve standart reaktifleri, materyalleri ve ekipmanı kullanarak, pluripotens üzerine şimdiye dek değinilmemiş etkileri olan kinaz inhibitörlerini açığa çıkarır ve onaylar. Bu teknolojinin potansiyel uygulamalarını tartışıyoruz, diğer küçük moleküllerin taranması da dahilGiderek sofistike kinaz inhibitörleri ve ortaya çıkan epigenetik araç bileşiklerinin kütüphaneleri gibi koleksiyonlar.

Burada sunulan prosedürü kullanarak ( Şekil 1 ), 228 güçlü ve seçici kinaz inhibitörünün LINCS kütüphanesini tarayarak mESC pluripotensini modüle edenleri belirledik. Kütüphane, 1: 100 seyreltme için 0.1 mM konsantrasyonda ve mESC&#39;lerde 1 uM son tarama konsantrasyonunda hazırlanır. 48 saat sonra, mESC&#39;ler parçalandı ve Nanog ve Dnmt3b ifadesinin kantitatif nokta leke analizi için ekstraktlar hazırlandı ( Şekil 2 , üstte). Diğer tarama konsantrasyonlarından elde edilen sonuçlar burada kısalık olarak gösterilmez. Nanog: Dnmt3b oranı her kinaz inhibitörü ve bileşenler için sıralanır ve 2x kesme uygulanır ( Şekil 2 , alt). Kontrolle ilgili toplam Nanog ve Dnmt3b sinyali, inhibitör sıralamasına bindirilir ve önemli mESC toksisitesini gösteren inhibitörlerin triazasyonuna izin vermek için 0.5x kesime tabi tutulur. Safevatı stabilize eden kinaz inhibitörlerini seçinGeleneksel Nanog / Dnmt3b immünoblotlama ( Şekil 3 ) kullanılarak doğrulanır. Bu inhibitörlerin primer kinaz hedefleri Tablo 1&#39;de sunulmuştur. Bu ekranın, astarlanmış hali stabilize eden inhibitörleri tanımlamak için uygulanabilirliğini de göstermekteyiz 14 . <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig1.jpg" /> Şekil 1: Saf başlangıçlı geçiş modüle eden kinaz inhibitörlerinin taranması için iş akışı. MESC, 1 uM&#39;lik nihai konsantrasyonda bir 228 bileşik kinaz inhibitör kütüphanesi ile muamele edildi. Lizatlar hazırlandı ve immüno nokta-leke analizi için nitroselüloz membranlara aktarıldı ve Nanog ve Dnmt3b seviyeleri belirlendi (Şekil 14 , Williams ve diğerleri 14&#39;den adapte edildi). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig1large.jpg" target="_blank">Görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a><html> Bu rakamın daha yükseği yok. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig2.jpg" /> Şekil 2: Naive ile hazırlanmış pluripotens ekran analizi ve inhibitör tanımlama. (Üstteki) Temsilci Nanog ve Dnmt3b immüno nokta-lekeli görüntüler. (Alt) Her kinaz inhibitörü için Nanog ve Dnm3b değerleri DMSO kontrolüne göre belirlendi ve Nanog: Dnmt3b oranları ve toplam nispi Nanog + Dnmt3b sinyali belirlendi ve inhibitörler DMSO kontrolüne kıyasla sıralandı. Nanog: Dnmt3b oranını, DMSO kontrolünün üstünde veya altındaki 2 misli eşiğin ötesinde değiştirenlerin, naif veya başlatılmış pluripotensin sürücüleri olduğu tespit edildi. DMSO kontrolünün 2x altında bir eşik değeri, mESC sağkalımını tehdit eden inhibitörlerin triaj edilmesi için ayarlandı. Daha ileri doğrulama için seçilen inhibitörler vurgulanır. (Şekil, Williams ve diğerleri 14&#39;den uyarlanmıştır ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu rakamın daha büyük sürümünü görmek için lütfen tıklayınız. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig3.jpg" /> Şekil 3: Belirlenen seçilmiş isabet bileşiklerinin doğrulanması. MESC&#39;ler ya 1 uM AZD4547 (seçici bir FGFR önleyicisi) ya da Şekil 2&#39;deki ekrandan belirlenen belirtilen inhibitörler ile muamele edildi. Nanog: Dnmt3b seviyeleri standart SDS-PAGE ve immünoblot analizi ile belirlendi. Göreceli Nanog: Dnmt3b ve Nanog + Dnmt3b&#39;nin sayısal değerleri aşağıdaki tabloda gösterilmiştir ve naif pluripotent durumu stabilize eden inhibitörler yeşil renkte vurgulanmıştır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> bileşik </td><td colspan="2"> Birincil Hedefler </td><td> Diğer Hedefler </td></tr><tr><td> AV-951 </td><td colspan="2"> VEGFR </td><td></td></tr><tr><td> HG-6-64-01 </td><td colspan="2"> ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K </td><td></td></tr><tr><td> WH-4-023 </td><td colspan="2"> Lck </td><td> src </td></tr><tr><td> R406 </td><td colspan="2"> Syk </td><td></td></tr><tr><td> GW-572016 </td><td colspan="2"> HER2 </td><td> EGFR </td></tr><tr><td> KIN001-244 </td><td colspan="2"> PDK1 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-4-145 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-7043 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, FGFR ve TAO1 </td><td></td></tr><tr><td> GW786034 </td><td colspan="2"> VEGFR1&#39;inin </td><td> VEGFR2, VEGFR3 &amp;# 160; </td></tr><tr><td> AZD-1480 </td><td colspan="2"> JAK2&#39;dir </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1: Seçilen isabet bileşikleri ve bunların primer kinaz hedefleri.

Burada, saf ön hazırlıklı pluripotent geçiş kinaz regülatörleri için hedeflenmiş küçük molekül ekranları gerçekleştirmek için nicel ve ölçeklenebilir bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik Kök Hücre Pluripotansını Yüksek Verimli İnhibitör Taramayla Düzenleyen Kinazları Tanımlamak İçin Basit Bir Yöntem

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Bu taramanın genel amacı, embriyonik kök hücre pluripotentliğini modüle eden küçük moleküllü protein kinaz inhibitörlerini tanımlamaktır. Bu yöntem, embriyonik kök hücre pluripotentliğini düzenleyen yeni protein kinaz sinyal yolaklarını tanımlayarak embriyonik kök hücre sinyalleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu nedenle, bu tekniğin ana avantajı, ekranın standart laboratuvar ekipmanı ve kolayca bulunabilen reaktifler kullanılarak gerçekleştirilmesinin nispeten kolay olmasıdır.Bu yöntem için ilk olarak, pluripotents sinyal yolaklarındaki çoğu araştırmanın kinome'un geniş dalgalarını tamamen göz ardı ettiğini fark ettiğimizde aklımıza geldi. 10 santimetrelik plakalara beş mililitre %0,1 jelatin ekleyerek jelatin kaplı 10 santimetrelik tabaklar hazırlayın. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe ettikten sonra jelatini aspire edin ve plakayı iki dakika kurumaya bırakın.Ardından, mililitre başına 100 nanogram GST etiketli LIF, %10 fetal buzağı serumu ve %5 nakavt serum replasmanı içeren standart fare ES hücre ortamındaki kaplanmış tabakların üzerine herhangi bir standart fare ES hücre hattını yerleştirin. Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 CO2'de kültürleyin ve ortamı her gün değiştirin. Fare ES hücrelerini, ortamı aspire ederek ve plaka başına beş mililitre fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayarak her iki günde bir yaklaşık% 80 birleşim hızında geçirin.Ardından, fare ES hücrelerinin plakası başına bir mililitre tripsin EDTA ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tripsinlenmiş hücreleri dört mililitre ortamda tekrar askıya alın ve hücreleri beş dakika boyunca 1200 RPM'de santrifüjleyin. Elde edilen hücre peletini beş mililitre ortamda iyice yeniden süspanse edin, tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.10 mikrolitrelik bir hücre süspansiyonu ve 10 mikrolitre tripan mavisini birleştirerek hücreleri sayın. Karışımı bir hücre sayma odasına yerleştirin veya bir hemositometre ve ışık mikroskobu kullanın. Daha sonra, 3000 fare ES hücresini, çok kanallı bir pipet kullanarak 100 mikrolitre ortamın son hacminde %0,1 jelatin kaplı 96 oyuklu plakalara tohumlayın.Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak kinaz inhibitörlerini bir ila 100 seyreltmede uygulayın. İnhibitörü ve hücre süspansiyonunu karıştırmak için ortamı nazikçe pipetleyin. Ardından, kaplama yüzeyi boyunca eşit dağılımı sağlamak için hücrelerin bir saat boyunca bir doku kültürü başlığına yerleşmesine izin verin.Ortamı değiştirmeden hücreleri 48 saat boyunca kültürleyin. Tarama analizine başlamak için, çok kanallı bir aspiratör ve pipetler kullanarak 96 kuyulu fare ES hücre plakasını 200 mikrolitre PBS'de yıkayın. Yıkadıktan sonra, hücre ekstraktlarını 150 mikrolitre lizis tamponunda karıştırın.Ekstraktları, V tabanlı 96 oyuklu plakalarda 30 dakika boyunca 1500 kez G'de santrifüjleme ile berraklaştırın. Ardından, 100 mikrolitre süpernatanı, 96 kuyulu vakumlu nokta grafiği manifoldu kullanarak bir nitroselüloz membran üzerine hareketsiz hale getirin. Membranı kurulayın ve tutarlı bir aktarım sağlamak için 40 mililitre Ponceau S ile boyayın.Membranı TBST ile yıkadıktan sonra, TBST artı% 3 sütle bloke edin. Daha sonra, zarı Nanog ve Dnmt3b antikorları içinde, gece boyunca bloke edici tamponda bir ila 1000 seyreltmede inkübe edin. Ertesi gün, zarı TBST'de 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.Daha sonra, bloke edici tamponda bir ila 10.000 seyreltmede 30 mililitre ikincil antikor içinde inkübe edin. Dijital bir immünoblotlama görüntüleme sistemi kullanarak zarı geliştirin. Devam etmeden önce konvansiyonel immünoblotlama kullanılarak ekranda tanımlanan kinaz inhibitörlerini doğrulamak çok önemlidir.Bu, daha fazla aşağı akış analizinden önce yanlış pozitiflerin kaldırılmasına yardımcı olur. Ekran verilerini analiz edin ve inhibitörleri metin protokolünde açıklandığı gibi iyi niyetli pluripotens düzenleyiciler olarak doğrulayın. Burada, gerçekleştirilen ekrandan temsili bir Nanog nokta grafiği gösterilmektedir.Astarlanmış veya naif pluripotentliği tetikleyen pozitif kontrol inhibitörleri vurgulanır. Ayrıca, gerçekleştirilen ekrandan temsili bir Dnmt3b nokta grafiği de gösterilir. Astarlanmış veya naif pluripotentliği sağlayan pozitif kontrol inhibitörleri tekrar vurgulanır.Bu grafikte, inhibitörler Nanog / Dnmt3b oranı için sıralandı. Naif veya astarlanmış pluripotentliği stabilize eden inhibitörleri tanımlamak için iki katlı bir Nanog - Dnmt3b oran eşiği ayarlanmıştır. Summed Nanog ve Dnmt3b sinyalleri de sağlanır.Ek olarak, daha fazla doğrulama için seçilen kinaz inhibitörleri not edilir. Burada, seçilen kinaz inhibitörlerinin, Nanog ve Dnmt3b immünoblotlarının konvansiyonel bir immünoblot validasyonu ve ayrıca Nanog / Dnmt3b oranı ve toplam sinyal sağlanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, embriyonik kök hücre pluripotentliğini modüle eden küçük moleküllü kinaz inhibitörlerinin nasıl tanımlanacağını iyi anlamış olmalısınız.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 72 saat içinde yapılabilir. Bu yöntem, pluripotentliği kontrol eden kinaz sinyal yolları hakkında bilgi sağlayabilse de, embriyonik kök hücre farklılaşmasına ve epigenetik değiştiriciler gibi diğer düzenleyici sistemlere de uygulanabilir. Prosedürü takiben, epigenetik değiştiricileri hedefleyenler gibi küçük molekül inhibitörlerinin diğer kütüphaneleri, pluripotent düzenlemedeki yeni oyuncuları tanımlamak için kullanılabilir.Geliştirildikten sonra, bu teknik araştırma grubumuzun yeni pluripotents sinyal yollarını aydınlatmasının yolunu açtı. Bu tekniği, pluripotentliği düzenlemede amplifiye edilmiş yol için yeni bir rol tanımlamak için kullanıyoruz.

a-simple-method-to-identify-kinases-that-regulate-embryonic-stem-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz bir fare ES hücre tabanlı testin Wnt / β-katenin ve kardiyojenik indüksiyon sırasında BMP sinyal aktivasyonu için kritik zaman pencere tanımlamak için kullandıklarını açıklarlar. Bu yöntem, güvenilir bir kardiyojenik verimliliği rakamlarla standart bir platform sağlar ve diğer hücre soylarının çalışma için geçerlidir.

Kardiyojenik İndüksiyon Verimlilik miktarının için modifiye Fare Embriyonik Kök Hücre tabanlı Testi

Biz yüksek içerik görüntüleme ile otomatik hücre kültür birleştirerek yüksek verimli bir şekilde, çoklu hücresel süreçleri ve yapıları görselleştirmek ve ölçmek için bir metodoloji açıklanmaktadır. Bu yöntemler daha fonksiyonel ek açıklama genomların yardım yanı sıra hastalık gen ağları ve potansiyel ilaç hedefleri belirleyebilir.

Nörodejeneratif Hastalıklar Yüksek İçerik Tarama

Biz hızla belirlemek ve fare embriyonik kök hücre bakım ve kendini yenileme düzenleyen genlerin karakterize bir floresan reporter assay açıklar.

Fare Embriyonik Kök Hücre Bakım ve Kendini yenileme Regulate Genler Okumak Oct4GiP Reporter Assay

Burada, ayrışmış tek hücrelerin koloni dışı tip tek tabakalı (NCM) büyümesine dayanan insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür protokollerini sunuyoruz. Rho ile ilişkili kinaz inhibitörleri veya laminin izoform 521 (LN-521) kullanan bu yeni yöntem, büyük miktarlarda homojen hPSC'lerin üretilmesi, genetik manipülasyon ve ilaç keşfi için uygundur.

İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök

protokoller, insan embriyonik kök hücreleri ve transcriptome çalışmalarına dayalı iki in vitro gelişimsel toksisite test sistemleri (UKK ve UKN1) açıklar. test sistemleri, insan gelişimsel toksisite tehlike tahmin ve hayvan çalışmaları, maliyet ve kimyasal güvenlik testi için gerekli süreyi azaltmak için katkıda bulunabilir.

Kimyasal Güvenlik Tarama ve Sistem Biyolojisi Veri Üretimi Gelişim Toksisite Tahliller Tabanlı İnsan Pluripotent Kök Hücre

Protein fosforilasyonu, hücrelerin hücre dışı ortamlarındaki bilgileri nasıl yorumladığının ve ona nasıl yanıt verdiğinin merkezi bir özelliğidir. Burada, ilgilenilen bir substratı (substratları) fosforile eden kinazları hızlı bir şekilde tanımlamak için memeli hücrelerinden saflaştırılmış kinazları kullanan yüksek verimli bir tarama protokolü sunuyoruz.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik

Bu çalışmada sunulan protokol analizi akış sitometrisi kullanılarak, pozitif ve negatif pluripotent kök hücresi belirleyicilerinin kinetik ölçümleri ile yeniden programlama ilerlemesi gerçek zamanlı izleme için yöntemler tarif etmektedir. protokol aynı zamanda iPSC oluşturma sırasında morfolojisi ve işaretleyici veya muhabir ifade görüntüleme bazlı değerlendirmesini içerir.

Somatik yeniden programlanması Kinetik Ölçümü ve Gerçek Zamanlı Görselleştirme

Burada sunulan Protokolü küçük moleküller karaciğer hastalığının tedavisi için tanımlamak için bir platform açıklar. Adım adım açıklamasını nasıl iPSCs hücrelere 96-şey plakaları hepatosit özellikleri ile ayırt etmek ve küçük moleküller için potansiyel terapötik etkinlik ile ekran için hücreleri kullanmak için ayrıntılı sunulmaktadır.

İnsan kullanarak Pluripotent kök hücre kaynaklı hepatosit benzeri hücreler indüklenen ilaç bulma için

Bu kağıt akış sitometresi-tabanlı bir tahlil kimyasal inhibitörleri ekran kitaplıklarına inhibitörleri ve T hücre reseptör sinyal etkileyen hedefleri tanımlaması için kullanır. Yöntem tanımlamak burada da yüksek üretilen iş gösterimleri için genişletilebilir.

T-hücre reseptör üzerinden tarama kimyasal inhibitörü kütüphanelerin sinyal arabulucu tanımlaması

Etiket, zenginleştirmek ve protein kinaz CK2 hücre lysate veya doku homogenate gibi karmaşık bir biyolojik örnekten yüzeylerde belirlemek için bu iletişim kuralını hedefidir. Bu yöntem CK2 Biyoloji benzersiz özelliklerini bu amaç için kaldıraç görevi yapar.

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

Kiaz inhibitörlerinin taranması için kendi kendine biraraya getirilen insan proteinmikrodizilerinin üretimi için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur.

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

Öğrenin, yüksek verimli inhibitör taramasıyla embriyonik kök hücre pluripotansını düzenleyen kinazları tanımlamak için basit bir yöntem. Bu teknik, standart laboratuvar ekipmanları kullanılarak 72 saatte tamamlanabilir.

Embriyonik Kök Hücre Pluripotansını Yüksek Verimli İnhibitör Taramayla Düzenleyen Kinazları Tanımlamak İçin Basit Bir Yöntem

Daha fazla video keşfet