Genetik Mühendisliğine Genel Bir Bakış
Genetik mühendisliği, bir organizmanın DNA'sının amaçlı olarak değiştirilmesidir. Bu alandaki ilerlemeler, bilim adamlarının biyomedikal araştırma ve tarımsal amaçlar için genetiği değiştirilmiş hücreler ve organizmalar üretmelerine izin vermiştir. Bununla birlikte, gen terapisi olarak bilinen, insanlarda terapötik olarak kullanılmak üzere genetik teknolojilerin uygulanması hala devam eden bir çalışmadır.
Bu videoda, genetik mühendisliği tarihindeki bazı önemli keşifleri, bugün üzerinde çalışılan başlıca soruları, bir organizmanın genomunu değiştirmek için önemli araçları ve bu teknolojilerin çeşitli uygulamalarını tartışacağız.
Genetik mühendisliğinin tarihini gözden geçirerek başlayalım.
Bilim adamlarının genleri doğrudan manipüle etme yeteneği, genetik materyalin kimliğini çözmeye dayanıyordu. 1928'de Frederick Griffith, ısıyla öldürülen öldürücü bakterilerin ve canlı, ancak öldürücü olmayan bir suşun bir karışımını farelere enjekte etmenin hastalığa yol açtığını gözlemledi ve bu da onu ölüden canlı bakterilere aktarılan bir "dönüştürücü ilke" hipotezine yol açtı.
1944'te Oswald Avery, Colin Macleod ve Maclyn McCarty, bakterinin DNA'sını bu dönüşümden sorumlu olarak tanımladılar. Sonuç, 1952'de Alfred Hershey ve Martha Chase'in, bakteri hücrelerinin enfeksiyonu sırasında iletilen proteinin değil, virüsün DNA'sı olduğunu göstermek için radyoaktif olarak etiketlenmiş bakteriyofaj kullandıklarında daha da doğrulandı.
Yine 1952'de Joshua Lederberg, bakteriler arasında iletilebilen küçük, dairesel DNA parçaları olan plazmitlerin varlığını varsaydı. Aynı zamanda, virüslerin hücreler arasında DNA iletmek için vektör görevi gördüğü transdüksiyonu da tanımladı.
1970'lerden başlayarak, Hamilton Smith gibi araştırmacılar, DNA'yı belirli dizilerde "kesen" kısıtlama endonükleazları gibi genetik mühendisliğinin bazı pratik "araçlarını" keşfetmeye başladılar. Bu araçları kullanarak, 1972'de Paul Berg, iki farklı virüsün DNA'sını birleştirerek ilk "rekombinant" DNA molekülünü üretti ve paralel olarak, Stanley Cohen ve Herbert Boyer, bir plazmide bir antibiyotik direnç geni yerleştirerek ve bu yapıyı E. coli bakterisine dönüştürerek ilk rekombinant organizmayı üretti.
1973'te Rudolf Jaenisch, SV40 viral DNA içeren bir fare olan ilk transgenik çok hücreli organizmayı yarattı, ancak 1981 yılına kadar diğer birkaç laboratuvar, eklenen genleri yavrularına geçirebilen ilk transgenik fareleri yarattı. 1980'lerin ortalarında, Mario Capecchi ve Oliver Smithies ilk olarak homolog rekombinasyonun özellikle genleri hedeflemek için kullanılabileceğini keşfetti ve 1989'da bu yöntemi, bir genin işlevsiz hale getirildiği ilk nakavt faresini oluşturmak için kullandı.
Şimdi, genetik mühendisliğindeki bazı temel soruları inceleyelim.
Ayrılmaz bir araştırma alanı, bir organizmanın genomunu değiştirmek için en iyi yöntemi belirlemektir. Modifikasyon sürecinin verimliliği ve hücresel DNA'da istenmeyen değişiklik risklerini en aza indirmek için modifikasyonun belirli genleri hedeflemesi gerekip gerekmediği de dahil olmak üzere bir dizi faktörün dikkate alınması gerekir.
Bir konakçı hücrenin genomunu değiştirmek için, "genetik yapı" olarak bilinen bu modifikasyonu yapmak için yapay olarak bir araya getirilmiş DNA dizisinin o hücreye başarılı bir şekilde iletilmesi gerekir. Bu alandaki araştırmalar, sitotoksisiteyi sınırlarken verimliliği en üst düzeye çıkarmayı amaçlamaktadır. Organizma düzeyinde, araştırmacılar, hedef hücre popülasyonlarına yapı dağıtımını iyileştirmek için retroviral parçacıklar veya nanoparçacıklar gibi vektörlerin nasıl değiştirileceğini inceler.
Son olarak, genetik mühendisliğinin tarımsal veya terapötik kullanımlara başarılı bir şekilde uygulanıp uygulanamayacağına büyük ilgi var. Bu teknolojiler, genleri silinmiş veya "nakavt edilmiş" fareler gibi güçlü araştırma araçları oluşturmak veya herbisit direnci gibi basit, tek özellikleri ekinlere eklemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, olumsuz koşullarda gelişen mahsuller üretmek gibi karmaşık problemler, muhtemelen aynı anda birden fazla yolun değiştirilmesini gerektirecektir. Ayrıca, genetik hastalıkların tedavisi için gen terapilerinin geliştirilmesi, genetik yapıların insan hücrelerine güvenli ve etkili bir şekilde iletilmesini gerektirmektedir.
Şimdi araştırmacılar tarafından kullanılan genetik mühendisliği araçlarına ve teknolojilerine bir göz atalım.
Genetik yapılar oluşturmak için klasik yöntem, DNA parçalarının sindirildiği ve daha sonra yeni bir plazmit oluşturmak için DNA ligazları kullanılarak belirli bir sırayla yeniden birleştirildiği kısıtlama enzimi bazlı klonlamadır. Daha yeni teknikler arasında, kısıtlama enzimi sindirim bölgelerine ihtiyaç duymadan DNA parçalarını izole etmek ve değiştirmek için homolog rekombinasyon kullanan yeniden birleştirme yer alır.
DNA, çeşitli yöntemlerle hücrelere verilebilir. Transformasyon veya transfeksiyon, çıplak DNA'yı sırasıyla bakteri veya ökaryotik hücrelere alma işlemidir. Kalsiyum gibi iki değerlikli katyonlar, hücre zarlarını daha gözenekli hale getirebilir ve bu da eksojen DNA moleküllerinin alımını artıracaktır. Elektroporasyon, aynı görevi yerine getirmek için bir elektrik alanı kullanırken, DNA'yı çevreleyen lipid nanopartikülleri hücre zarı ile birleşebilir ve yükünü serbest bırakabilir. Transdüksiyon, DNA'nın lentivirüs gibi viral bir vektör tarafından transferini ifade eder.
Genetik yapıların çok hücreli organizmalara iletilmesi ek hususlar gerektirir. Birden fazla hücre tipi mevcut olduğunda, virüsler veya nanopartiküller gibi hedeflenen vektörler hücre iletiminin özgüllüğünü arttırır. Bitkilerde araştırmacılar, DNA'yı bitki hücrelerine aktarabilen bir bitki patojeni olan agrobacterium'u bir gen dağıtım aracı olarak seçtiler. "Biyolistikler", DNA kaplı altın boncukları hücrelere iletmek için bir "gen tabancasının" kullanılmasını ifade eder.
Son olarak, teslim edilen DNA yapılarının, uzun vadeli etkiler elde etmek için konakçı genomunda kalıcı değişiklikler yapması gerekir. Bu, verilen DNA yapısının konakçı DNA'ya rastgele entegrasyonu ile meydana gelebilir ve bu, yapının transpozaz adı verilen DNA "kes ve yapıştır" enzimleri için tanıma bölgeleriyle etiketlenmesiyle geliştirilebilir. Öte yandan, homolog rekombinasyon yoluyla gen hedefleme gibi teknikler, belirli genomik bölgelere entegrasyona izin verir. Belirli lokuslarda çift iplikli kırılmalar oluşturmak için özel olarak tasarlanmış nükleazları kullanan genom düzenleme olarak bilinen tekniklerdeki son gelişmeler, gen hedefleme verimliliğini büyük ölçüde artırır.
Şimdi, genetik mühendisliği teknolojilerinin günümüzde nasıl uygulandığına bir göz atalım.
Ökaryotlardaki hücresel fonksiyonlar organellere bölünmüştür ve transgenik protein ekspresyonunu bireysel bölmelere hedeflemek daha spesifik biyolojik etkilere izin verebilir. Bu deneyde, araştırmacılar, birden fazla PCR ürünü arasındaki homolog örtüşme bölgelerinin, kısıtlama enzimleri kullanılmadan tam bir yapının oluşturulmasına izin verdiği Gibson montaj tekniğini kullanarak GFP etiketli bir raportör yapısı oluşturdular. Bu yapıları bitki hücrelerine iletmek için biyolistik transfeksiyon kullanıldı ve araştırmacılar kloroplastı hedef alan GFP ekspresyonunu gösterebildiler.
Kanser hücreleri genellikle yüzey reseptörlerini aşırı eksprese eder ve araştırmacılar bu reseptörleri gen terapisi kullanarak hedefleyebilirler. Burada, bilim adamları farede insan mesane kanseri için bir model oluşturdular. Bunu, mesane kanseri hücrelerine bir adenoviral vektörün topikal olarak verilmesi takip eder. Kanser hücrelerinde lusiferaz ekspresyonunun gözlemlenmesi, raportör genin başarılı bir şekilde verildiğini gösterdi.
Son olarak, bir hedef organizmada tam biyolojik yolların mühendisliğinde ilerleme kaydedilmektedir. Burada, antibiyotik eritromisin için biyosentetik yolun her bir geni, konakçı bakteri olan Saccharopolyspora erythraea'dan PCR yoluyla izole edildi ve optimal ifadeye izin vermek için bir dizi genin aynı düzenleyici unsurlar tarafından kontrol altına alındığı operon benzeri yapılarda birleştirildi. Bu yapılar daha sonra sentez yolunu yeniden oluşturmak için E. coli'ye dönüştürüldü ve heterolog olarak üretilen ürün daha sonra saflaştırılabilir ve işlevsellik açısından test edilebilir.
Az önce JoVE'nin genetik mühendisliğine genel bakışını izlediniz. Bu videoda, genetik mühendisliğinin tarihçesini tartıştık, alandaki temel soruları, araçları inceledik ve genetik mühendisliği uygulamalarından birkaç örnek sunduk. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Genetik mühendisliği - bir organizmanın DNA'sını kasıtlı olarak değiştirme süreci - güçlü araştırma araçları ve model organizmalar oluşturmak için kul…
Genetik mühendisliği, bir organizmanın DNA'sının amaçlı olarak değiştirilmesidir. Bu alandaki ilerlemeler, bilim adamlarının biyomedikal araştırma ve tarımsal amaçlar için genetiği değiştirilmiş hücreler ve organizmalar üretmelerine izin vermiştir. Bununla birlikte, gen terapisi olarak bilinen, insanlarda terapötik olarak kullanılmak üzere genetik teknolojilerin uygulanması hala devam eden bir çalışmadır.
Bu videoda, genetik mühendisliği tarihindeki bazı önemli keşifleri, bugün üzerinde çalışılan başlıca soruları, bir organizmanın genomunu değiştirmek için önemli araçları ve bu teknolojilerin çeşitli uygulamalarını tartışacağız.
Genetik mühendisliğinin tarihini gözden geçirerek başlayalım.
Bilim adamlarının genleri doğrudan manipüle etme yeteneği, genetik materyalin kimliğini çözmeye dayanıyordu. 1928'de Frederick Griffith, ısıyla öldürülen öldürücü bakterilerin ve canlı, ancak öldürücü olmayan bir suşun bir karışımını farelere enjekte etmenin hastalığa yol açtığını gözlemledi ve bu da onu ölüden canlı bakterilere aktarılan bir "dönüştürücü ilke" hipotezine yol açtı.
1944'te Oswald Avery, Colin Macleod ve Maclyn McCarty, bakterinin DNA'sını bu dönüşümden sorumlu olarak tanımladılar. Sonuç, 1952'de Alfred Hershey ve Martha Chase'in, bakteri hücrelerinin enfeksiyonu sırasında iletilen proteinin değil, virüsün DNA'sı olduğunu göstermek için radyoaktif olarak etiketlenmiş bakteriyofaj kullandıklarında daha da doğrulandı.
Yine 1952'de Joshua Lederberg, bakteriler arasında iletilebilen küçük, dairesel DNA parçaları olan plazmitlerin varlığını varsaydı. Aynı zamanda, virüslerin hücreler arasında DNA iletmek için vektör görevi gördüğü transdüksiyonu da tanımladı.
1970'lerden başlayarak, Hamilton Smith gibi araştırmacılar, DNA'yı belirli dizilerde "kesen" kısıtlama endonükleazları gibi genetik mühendisliğinin bazı pratik "araçlarını" keşfetmeye başladılar. Bu araçları kullanarak, 1972'de Paul Berg, iki farklı virüsün DNA'sını birleştirerek ilk "rekombinant" DNA molekülünü üretti ve paralel olarak, Stanley Cohen ve Herbert Boyer, bir plazmide bir antibiyotik direnç geni yerleştirerek ve bu yapıyı E. coli bakterisine dönüştürerek ilk rekombinant organizmayı üretti.
1973'te Rudolf Jaenisch, SV40 viral DNA içeren bir fare olan ilk transgenik çok hücreli organizmayı yarattı, ancak 1981 yılına kadar diğer birkaç laboratuvar, eklenen genleri yavrularına geçirebilen ilk transgenik fareleri yarattı. 1980'lerin ortalarında, Mario Capecchi ve Oliver Smithies ilk olarak homolog rekombinasyonun özellikle genleri hedeflemek için kullanılabileceğini keşfetti ve 1989'da bu yöntemi, bir genin işlevsiz hale getirildiği ilk nakavt faresini oluşturmak için kullandı.
Şimdi, genetik mühendisliğindeki bazı temel soruları inceleyelim.
Ayrılmaz bir araştırma alanı, bir organizmanın genomunu değiştirmek için en iyi yöntemi belirlemektir. Modifikasyon sürecinin verimliliği ve hücresel DNA'da istenmeyen değişiklik risklerini en aza indirmek için modifikasyonun belirli genleri hedeflemesi gerekip gerekmediği de dahil olmak üzere bir dizi faktörün dikkate alınması gerekir.
Bir konakçı hücrenin genomunu değiştirmek için, "genetik yapı" olarak bilinen bu modifikasyonu yapmak için yapay olarak bir araya getirilmiş DNA dizisinin o hücreye başarılı bir şekilde iletilmesi gerekir. Bu alandaki araştırmalar, sitotoksisiteyi sınırlarken verimliliği en üst düzeye çıkarmayı amaçlamaktadır. Organizma düzeyinde, araştırmacılar, hedef hücre popülasyonlarına yapı dağıtımını iyileştirmek için retroviral parçacıklar veya nanoparçacıklar gibi vektörlerin nasıl değiştirileceğini inceler.
Son olarak, genetik mühendisliğinin tarımsal veya terapötik kullanımlara başarılı bir şekilde uygulanıp uygulanamayacağına büyük ilgi var. Bu teknolojiler, genleri silinmiş veya "nakavt edilmiş" fareler gibi güçlü araştırma araçları oluşturmak veya herbisit direnci gibi basit, tek özellikleri ekinlere eklemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, olumsuz koşullarda gelişen mahsuller üretmek gibi karmaşık problemler, muhtemelen aynı anda birden fazla yolun değiştirilmesini gerektirecektir. Ayrıca, genetik hastalıkların tedavisi için gen terapilerinin geliştirilmesi, genetik yapıların insan hücrelerine güvenli ve etkili bir şekilde iletilmesini gerektirmektedir.
Şimdi araştırmacılar tarafından kullanılan genetik mühendisliği araçlarına ve teknolojilerine bir göz atalım.
Genetik yapılar oluşturmak için klasik yöntem, DNA parçalarının sindirildiği ve daha sonra yeni bir plazmit oluşturmak için DNA ligazları kullanılarak belirli bir sırayla yeniden birleştirildiği kısıtlama enzimi bazlı klonlamadır. Daha yeni teknikler arasında, kısıtlama enzimi sindirim bölgelerine ihtiyaç duymadan DNA parçalarını izole etmek ve değiştirmek için homolog rekombinasyon kullanan yeniden birleştirme yer alır.
DNA, çeşitli yöntemlerle hücrelere verilebilir. Transformasyon veya transfeksiyon, çıplak DNA'yı sırasıyla bakteri veya ökaryotik hücrelere alma işlemidir. Kalsiyum gibi iki değerlikli katyonlar, hücre zarlarını daha gözenekli hale getirebilir ve bu da eksojen DNA moleküllerinin alımını artıracaktır. Elektroporasyon, aynı görevi yerine getirmek için bir elektrik alanı kullanırken, DNA'yı çevreleyen lipid nanopartikülleri hücre zarı ile birleşebilir ve yükünü serbest bırakabilir. Transdüksiyon, DNA'nın lentivirüs gibi viral bir vektör tarafından transferini ifade eder.
Genetik yapıların çok hücreli organizmalara iletilmesi ek hususlar gerektirir. Birden fazla hücre tipi mevcut olduğunda, virüsler veya nanopartiküller gibi hedeflenen vektörler hücre iletiminin özgüllüğünü arttırır. Bitkilerde araştırmacılar, DNA'yı bitki hücrelerine aktarabilen bir bitki patojeni olan agrobacterium'u bir gen dağıtım aracı olarak seçtiler. "Biyolistikler", DNA kaplı altın boncukları hücrelere iletmek için bir "gen tabancasının" kullanılmasını ifade eder.
Son olarak, teslim edilen DNA yapılarının, uzun vadeli etkiler elde etmek için konakçı genomunda kalıcı değişiklikler yapması gerekir. Bu, verilen DNA yapısının konakçı DNA'ya rastgele entegrasyonu ile meydana gelebilir ve bu, yapının transpozaz adı verilen DNA "kes ve yapıştır" enzimleri için tanıma bölgeleriyle etiketlenmesiyle geliştirilebilir. Öte yandan, homolog rekombinasyon yoluyla gen hedefleme gibi teknikler, belirli genomik bölgelere entegrasyona izin verir. Belirli lokuslarda çift iplikli kırılmalar oluşturmak için özel olarak tasarlanmış nükleazları kullanan genom düzenleme olarak bilinen tekniklerdeki son gelişmeler, gen hedefleme verimliliğini büyük ölçüde artırır.
Şimdi, genetik mühendisliği teknolojilerinin günümüzde nasıl uygulandığına bir göz atalım.
Ökaryotlardaki hücresel fonksiyonlar organellere bölünmüştür ve transgenik protein ekspresyonunu bireysel bölmelere hedeflemek daha spesifik biyolojik etkilere izin verebilir. Bu deneyde, araştırmacılar, birden fazla PCR ürünü arasındaki homolog örtüşme bölgelerinin, kısıtlama enzimleri kullanılmadan tam bir yapının oluşturulmasına izin verdiği Gibson montaj tekniğini kullanarak GFP etiketli bir raportör yapısı oluşturdular. Bu yapıları bitki hücrelerine iletmek için biyolistik transfeksiyon kullanıldı ve araştırmacılar kloroplastı hedef alan GFP ekspresyonunu gösterebildiler.
Kanser hücreleri genellikle yüzey reseptörlerini aşırı eksprese eder ve araştırmacılar bu reseptörleri gen terapisi kullanarak hedefleyebilirler. Burada, bilim adamları farede insan mesane kanseri için bir model oluşturdular. Bunu, mesane kanseri hücrelerine bir adenoviral vektörün topikal olarak verilmesi takip eder. Kanser hücrelerinde lusiferaz ekspresyonunun gözlemlenmesi, raportör genin başarılı bir şekilde verildiğini gösterdi.
Son olarak, bir hedef organizmada tam biyolojik yolların mühendisliğinde ilerleme kaydedilmektedir. Burada, antibiyotik eritromisin için biyosentetik yolun her bir geni, konakçı bakteri olan Saccharopolyspora erythraea'dan PCR yoluyla izole edildi ve optimal ifadeye izin vermek için bir dizi genin aynı düzenleyici unsurlar tarafından kontrol altına alındığı operon benzeri yapılarda birleştirildi. Bu yapılar daha sonra sentez yolunu yeniden oluşturmak için E. coli'ye dönüştürüldü ve heterolog olarak üretilen ürün daha sonra saflaştırılabilir ve işlevsellik açısından test edilebilir.
Az önce JoVE'nin genetik mühendisliğine genel bakışını izlediniz. Bu videoda, genetik mühendisliğinin tarihçesini tartıştık, alandaki temel soruları, araçları inceledik ve genetik mühendisliği uygulamalarından birkaç örnek sunduk. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Genetik mühendisliği, bir organizmanın DNA'sının amaçlı olarak değiştirilmesidir. Bu alandaki ilerlemeler, bilim adamlarının biyomedikal araştırma ve tarımsal amaçlar için genetiği değiştirilmiş hücreler ve organizmalar üretmelerine izin vermiştir. Bununla birlikte, gen terapisi olarak bilinen, insanlarda terapötik olarak kullanılmak üzere genetik teknolojilerin uygulanması hala devam eden bir çalışmadır.
Bu videoda, genetik mühendisliği tarihindeki bazı önemli keşifleri, bugün üzerinde çalışılan başlıca soruları, bir organizmanın genomunu değiştirmek için önemli araçları ve bu teknolojilerin çeşitli uygulamalarını tartışacağız.
Genetik mühendisliğinin tarihini gözden geçirerek başlayalım.
Bilim adamlarının genleri doğrudan manipüle etme yeteneği, genetik materyalin kimliğini çözmeye dayanıyordu. 1928'de Frederick Griffith, ısıyla öldürülen öldürücü bakterilerin ve canlı, ancak öldürücü olmayan bir suşun bir karışımını farelere enjekte etmenin hastalığa yol açtığını gözlemledi ve bu da onu ölüden canlı bakterilere aktarılan bir "dönüştürücü ilke" hipotezine yol açtı.
1944'te Oswald Avery, Colin Macleod ve Maclyn McCarty, bakterinin DNA'sını bu dönüşümden sorumlu olarak tanımladılar. Sonuç, 1952'de Alfred Hershey ve Martha Chase'in, bakteri hücrelerinin enfeksiyonu sırasında iletilen proteinin değil, virüsün DNA'sı olduğunu göstermek için radyoaktif olarak etiketlenmiş bakteriyofaj kullandıklarında daha da doğrulandı.
Yine 1952'de Joshua Lederberg, bakteriler arasında iletilebilen küçük, dairesel DNA parçaları olan plazmitlerin varlığını varsaydı. Aynı zamanda, virüslerin hücreler arasında DNA iletmek için vektör görevi gördüğü transdüksiyonu da tanımladı.
1970'lerden başlayarak, Hamilton Smith gibi araştırmacılar, DNA'yı belirli dizilerde "kesen" kısıtlama endonükleazları gibi genetik mühendisliğinin bazı pratik "araçlarını" keşfetmeye başladılar. Bu araçları kullanarak, 1972'de Paul Berg, iki farklı virüsün DNA'sını birleştirerek ilk "rekombinant" DNA molekülünü üretti ve paralel olarak, Stanley Cohen ve Herbert Boyer, bir plazmide bir antibiyotik direnç geni yerleştirerek ve bu yapıyı E. coli bakterisine dönüştürerek ilk rekombinant organizmayı üretti.
1973'te Rudolf Jaenisch, SV40 viral DNA içeren bir fare olan ilk transgenik çok hücreli organizmayı yarattı, ancak 1981 yılına kadar diğer birkaç laboratuvar, eklenen genleri yavrularına geçirebilen ilk transgenik fareleri yarattı. 1980'lerin ortalarında, Mario Capecchi ve Oliver Smithies ilk olarak homolog rekombinasyonun özellikle genleri hedeflemek için kullanılabileceğini keşfetti ve 1989'da bu yöntemi, bir genin işlevsiz hale getirildiği ilk nakavt faresini oluşturmak için kullandı.
Şimdi, genetik mühendisliğindeki bazı temel soruları inceleyelim.
Ayrılmaz bir araştırma alanı, bir organizmanın genomunu değiştirmek için en iyi yöntemi belirlemektir. Modifikasyon sürecinin verimliliği ve hücresel DNA'da istenmeyen değişiklik risklerini en aza indirmek için modifikasyonun belirli genleri hedeflemesi gerekip gerekmediği de dahil olmak üzere bir dizi faktörün dikkate alınması gerekir.
Bir konakçı hücrenin genomunu değiştirmek için, "genetik yapı" olarak bilinen bu modifikasyonu yapmak için yapay olarak bir araya getirilmiş DNA dizisinin o hücreye başarılı bir şekilde iletilmesi gerekir. Bu alandaki araştırmalar, sitotoksisiteyi sınırlarken verimliliği en üst düzeye çıkarmayı amaçlamaktadır. Organizma düzeyinde, araştırmacılar, hedef hücre popülasyonlarına yapı dağıtımını iyileştirmek için retroviral parçacıklar veya nanoparçacıklar gibi vektörlerin nasıl değiştirileceğini inceler.
Son olarak, genetik mühendisliğinin tarımsal veya terapötik kullanımlara başarılı bir şekilde uygulanıp uygulanamayacağına büyük ilgi var. Bu teknolojiler, genleri silinmiş veya "nakavt edilmiş" fareler gibi güçlü araştırma araçları oluşturmak veya herbisit direnci gibi basit, tek özellikleri ekinlere eklemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, olumsuz koşullarda gelişen mahsuller üretmek gibi karmaşık problemler, muhtemelen aynı anda birden fazla yolun değiştirilmesini gerektirecektir. Ayrıca, genetik hastalıkların tedavisi için gen terapilerinin geliştirilmesi, genetik yapıların insan hücrelerine güvenli ve etkili bir şekilde iletilmesini gerektirmektedir.
Şimdi araştırmacılar tarafından kullanılan genetik mühendisliği araçlarına ve teknolojilerine bir göz atalım.
Genetik yapılar oluşturmak için klasik yöntem, DNA parçalarının sindirildiği ve daha sonra yeni bir plazmit oluşturmak için DNA ligazları kullanılarak belirli bir sırayla yeniden birleştirildiği kısıtlama enzimi bazlı klonlamadır. Daha yeni teknikler arasında, kısıtlama enzimi sindirim bölgelerine ihtiyaç duymadan DNA parçalarını izole etmek ve değiştirmek için homolog rekombinasyon kullanan yeniden birleştirme yer alır.
DNA, çeşitli yöntemlerle hücrelere verilebilir. Transformasyon veya transfeksiyon, çıplak DNA'yı sırasıyla bakteri veya ökaryotik hücrelere alma işlemidir. Kalsiyum gibi iki değerlikli katyonlar, hücre zarlarını daha gözenekli hale getirebilir ve bu da eksojen DNA moleküllerinin alımını artıracaktır. Elektroporasyon, aynı görevi yerine getirmek için bir elektrik alanı kullanırken, DNA'yı çevreleyen lipid nanopartikülleri hücre zarı ile birleşebilir ve yükünü serbest bırakabilir. Transdüksiyon, DNA'nın lentivirüs gibi viral bir vektör tarafından transferini ifade eder.
Genetik yapıların çok hücreli organizmalara iletilmesi ek hususlar gerektirir. Birden fazla hücre tipi mevcut olduğunda, virüsler veya nanopartiküller gibi hedeflenen vektörler hücre iletiminin özgüllüğünü arttırır. Bitkilerde araştırmacılar, DNA'yı bitki hücrelerine aktarabilen bir bitki patojeni olan agrobacterium'u bir gen dağıtım aracı olarak seçtiler. "Biyolistikler", DNA kaplı altın boncukları hücrelere iletmek için bir "gen tabancasının" kullanılmasını ifade eder.
Son olarak, teslim edilen DNA yapılarının, uzun vadeli etkiler elde etmek için konakçı genomunda kalıcı değişiklikler yapması gerekir. Bu, verilen DNA yapısının konakçı DNA'ya rastgele entegrasyonu ile meydana gelebilir ve bu, yapının transpozaz adı verilen DNA "kes ve yapıştır" enzimleri için tanıma bölgeleriyle etiketlenmesiyle geliştirilebilir. Öte yandan, homolog rekombinasyon yoluyla gen hedefleme gibi teknikler, belirli genomik bölgelere entegrasyona izin verir. Belirli lokuslarda çift iplikli kırılmalar oluşturmak için özel olarak tasarlanmış nükleazları kullanan genom düzenleme olarak bilinen tekniklerdeki son gelişmeler, gen hedefleme verimliliğini büyük ölçüde artırır.
Şimdi, genetik mühendisliği teknolojilerinin günümüzde nasıl uygulandığına bir göz atalım.
Ökaryotlardaki hücresel fonksiyonlar organellere bölünmüştür ve transgenik protein ekspresyonunu bireysel bölmelere hedeflemek daha spesifik biyolojik etkilere izin verebilir. Bu deneyde, araştırmacılar, birden fazla PCR ürünü arasındaki homolog örtüşme bölgelerinin, kısıtlama enzimleri kullanılmadan tam bir yapının oluşturulmasına izin verdiği Gibson montaj tekniğini kullanarak GFP etiketli bir raportör yapısı oluşturdular. Bu yapıları bitki hücrelerine iletmek için biyolistik transfeksiyon kullanıldı ve araştırmacılar kloroplastı hedef alan GFP ekspresyonunu gösterebildiler.
Kanser hücreleri genellikle yüzey reseptörlerini aşırı eksprese eder ve araştırmacılar bu reseptörleri gen terapisi kullanarak hedefleyebilirler. Burada, bilim adamları farede insan mesane kanseri için bir model oluşturdular. Bunu, mesane kanseri hücrelerine bir adenoviral vektörün topikal olarak verilmesi takip eder. Kanser hücrelerinde lusiferaz ekspresyonunun gözlemlenmesi, raportör genin başarılı bir şekilde verildiğini gösterdi.
Son olarak, bir hedef organizmada tam biyolojik yolların mühendisliğinde ilerleme kaydedilmektedir. Burada, antibiyotik eritromisin için biyosentetik yolun her bir geni, konakçı bakteri olan Saccharopolyspora erythraea'dan PCR yoluyla izole edildi ve optimal ifadeye izin vermek için bir dizi genin aynı düzenleyici unsurlar tarafından kontrol altına alındığı operon benzeri yapılarda birleştirildi. Bu yapılar daha sonra sentez yolunu yeniden oluşturmak için E. coli'ye dönüştürüldü ve heterolog olarak üretilen ürün daha sonra saflaştırılabilir ve işlevsellik açısından test edilebilir.
Az önce JoVE'nin genetik mühendisliğine genel bakışını izlediniz. Bu videoda, genetik mühendisliğinin tarihçesini tartıştık, alandaki temel soruları, araçları inceledik ve genetik mühendisliği uygulamalarından birkaç örnek sunduk. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What key discoveries established DNA as the genetic material?
Frederick Griffith's 1928 experiments with bacteria suggested a transforming principle. Oswald Avery, Colin Macleod, and Maclyn McCarty identified DNA as responsible for transformation in 1944. Alfred Hershey and Martha Chase confirmed in 1952 that viral DNA, not protein, transmits genetic information during bacterial infection using radioactively labeled bacteriophage.
Q2: How do restriction enzymes and DNA ligases work together in genetic engineering?
Restriction enzymes cut DNA at specific sequences, breaking it into fragments. DNA ligases then join these fragments in desired orders to create new plasmids. This restriction enzyme-based cloning method was foundational for generating genetic constructs before newer techniques like recombineering and gene targeting emerged.
Q3: What are the main methods for delivering DNA into cells?
Transformation and transfection use divalent cations like calcium to increase cell membrane permeability for naked DNA uptake. Electroporation applies electric fields for the same purpose. Lipid nanoparticles surround DNA and fuse with membranes, while transduction uses viral vectors like lentiviruses to transfer genetic material into cells.
Q4: How do homologous recombination and genome editing differ in targeting genes?
Homologous recombination allows integration into specific genomic sites by matching DNA sequences, enabling precise gene targeting. Genome editing uses custom-designed nucleases to generate double-strand breaks at specific loci, greatly improving targeting efficiency. Both techniques minimize off-target effects compared to random DNA integration.
Q5: What is the difference between knockout mice and transgenic mice?
Transgenic mice contain inserted foreign genes, like SV40 viral DNA, and can pass these genes to offspring. Knockout mice have specific genes rendered nonfunctional through homologous recombination. Rudolf Jaenisch created the first transgenic mouse in 1973, while Mario Capecchi and Oliver Smithies generated the first knockout mouse in 1989.
Q6: How is genetic engineering applied to treat cancer using gene therapy?
Researchers target cancer cells that over-express surface receptors using adenoviral vectors. In bladder cancer models, topical delivery of the vector to cancer cells enables successful gene transfer. Luciferase reporter genes confirm successful delivery, demonstrating how gene therapy can target specific cancer cell populations for therapeutic intervention.
Q7: What challenges remain in applying genetic engineering to complex agricultural problems?
Simple traits like herbicide resistance are achievable, but complex problems such as stress tolerance require modifying multiple pathways simultaneously. Safe and efficient delivery of genetic constructs to target cells remains challenging. Additionally, minimizing off-target effects and ensuring long-term stability of modifications are critical considerations for successful agricultural applications.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
0:49
Historical Highlights
3:41
Key Questions
5:25
Prominent Methods
8:09
Applications
10:11
Summary