Name: Kollajen ile indüklenen on Aggregation Pannexin1-inhibitör Parlak Mavi FCF: Türbidimetrik İnsanlar üzerinde Trombositler Yıkanmış (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Öğrenin, insan kanından yıkanmış trombosit izolasyonu ve türbidimetri ile agregasyon ölçümü yöntemini. Pannexin-1 inhibitörü Brilliant Blue FCF kullanarak kollajen uyarımına yanıtı inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı hibe (Pierre Fontana 310030_162579 / Brenda Renata Kwak 1 ve 320030_144150) yanı sıra ile İsviçre Kalp Vakfı bir hibe ile desteklenmiştir.

Beş ilgisiz sağlıklı gönüllüler trombosit izolasyon ve kümelenme testleri için kan örneği almak için alınmıştır. Yazılı onayları alınmıştır ve protokol Cenevre Üniversitesi Hastaneleri&#39;nin Merkez Etik Komitesi tarafından onaylandı. sertifikalı Tüm gönüllüler sağlıklı olmak için ve deneyler öncesinde en az 10 gün boyunca herhangi bir trombosit müdahale ilaçları almamış etmek. İnsan Kan Toplama 1. Tampon Hazırlama ve Yıkanmış Trombosit İzolasyonu <ol><li> (Cı-6H 8 O 7 • H2O, 66.6 mM), 2.5 gr trisodyum sitrat dihidrat (Na3 C6 H5 1.4 g sitrik asit monohidrat çözülmesiyle asit sitrat dektroz (CD) bir 100 ml sulu çözelti hazırlayın O 7 • 2 H2O, 85 mM) ve susuz D (+) 2 g - glikoz ihtiva eder. Çözeltinin pH değeri yaklaşık 4.5 olan. </li><li> Şöyle Tyrode tampon için stok çözelti hazırlayın<ol><li> , Nispi final konsantrasyon 2.73 M, 238 53.6 mM olan, 10 g NaHCC 3 ve 0.58 g NaH2 4 * H damıtılmış H2O 500 mL 2 O 80 g NaCl, 2 g KCI çözülmesiyle stok çözelti hazırlayın 1 mM ve 8.4 mm. 4 ° C&#39;de çözelti tutun. </li><li> O 4 ° C&#39;de çözüm tutun H2 damıtılmış 500 ml içinde 10.15 g MgCl2 x 6 H2O (100 mM) eritilmesi ile stok solüsyonu 2 hazırlayın. </li><li> 10.95 g O, 4 ° C &#39;de çözüm tutun 2 O 500 ml damıtılmış H2 (100 mM) CaCl2 * 6H eritilerek stok çözelti 3 hazırlanır. </li></ol></li><li> 136,5 mM NaCl, 2.68 mM KCI, nihai konsantrasyonlara karşılık gelir Bu damıtık H2O ile 50 mL&#39;lik bir son hacim içinde stok çözeltisi 1 2.5 mL seyreltilerek Tyrode tamponu hazırlayın 11.9 mM NaHCOj 3 ve 0.42 mM NaH2? 4 * H2O 7.35 pH ayarlamak ve 0.22 um f filtre edilerek sterilizeiltrelerini. </li><li> 5 ml stok çözeltisi 1 seyreltilmesi ile Tyrode albümin% 0.35 tamponu (TA tamponu 7) hazırlanması, stok çözeltisi 2, 1 mL stok solüsyonu 3, 0.5 mL 1 M HEPES, 200 g / L, insan serum albümini, 1.8 ml 2 ml ve susuz D (+) 0.1 g - 100 mL&#39;lik nihai bir hacim içinde glükoz damıtık H2O <ol><li> 1 N HCI ile 7,35 pH ayarlama ve damıtılmış H2O (toplam hacmin% 10) eklenmesi ile 295 mOsm / L ozmolarite ayarlayın. Bu çözelti içinde nihai konsantrasyonları şunlardır: 124 mM NaCI, 2.44 mM KCI, 10.82 mM NaHCOj 3, 0.38 mM NaH2? 4 * H2O, 0.91 mM MgCl2 x 6 H2O, 1.82 mM CaCl2 * 6 H2O . tüm deney boyunca 37 ° C &#39;de TA tamponu tutun. </li></ol></li></ol> 2. Kan Toplama <ol><li> Con 50 ml tüplere, bir 19 G iğne ve bir ya da düşük turnike kullanılarak antekubital damardan, venöz kan 45-50 mL toplamak(Kan 6 hacim 1 hacim ACD) ettirilmesi ACD antikoagülan. trombin ve doku faktörü yok etmek için kan ilk 1-2 mL atın. <ol><li> Toplandıktan sonra yavaşça tersini tüp ACD ile kan karıştırın. 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca örnek inkübe. </li></ol></li></ol> İnsan 3. Bileşik Trombositler Yıkanmış <ol><li> 37 ° C&#39;ye kadar santrifüj önceden ısıtın. Bütün santrifüjleme aşamaları aşağıda bu sıcaklıkta gerçekleştirilir. </li><li> 13 dakika PRP elde etmek için 250 x g&#39;de 15 ml tüpler (tüp başına 5 mL) ve santrifüj toplanmış kan gönderir. Not: Örnek üç tabakadan üretimindeki bu santrifüjleme aşaması sonucu: 1) üst tabaka, plazma, trombositler oluşur ve beyaz kan hücrelerinin çok küçük bir bölümü. 2) ara tabaka, beyaz kan hücreleri açısından zengin bir bölümü. 3) esas olarak kırmızı kan hücrelerinden oluşur alt tabaka. </li><li> Üst la pipetleme PRP toplayınYer dikkatli bir şekilde maksimum kırmızı ve beyaz kan hücreleri ile kirlenmesini önlemek ve 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca inkübasyona yeni bir 15 mL tüpe. </li><li> (5 ml PRP) 12 dakika boyunca 2200 x g&#39;de PRP santrifüjleyin. NOT: Bu santrifüj aşaması düşük frenle veya frensiz yapılmalıdır. </li><li> Süpernatant (trombosit bakımından fakir plazma) çıkarın ve dikkatli bir şekilde bir plastik pastör pipeti kullanılarak, heparin 2 uL / mL içeren ta tamponu, 10 mL (5000 U / ml) ve 25 uM PGI2 2.5 uL / mL pelletini. 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> (Düşük fren veya fren olmadan) 1,900 x g&#39;de 8 dakika boyunca 25 uM PGI2 ve santrifüj 2.5 uL / mL ekleyin. </li><li> Süpernatantı ve bir plastik pastör pipeti kullanılarak 25 uM PGI2 2.5 uL / mL içeren 5 ml ta tamponu ile pelletini. 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> İnkübasyon sırasında, trombosit süspansiyonu 150 uL pipetleyinve 1.5 ml tüp otomatize hücre sayacı (bu doğru akım direnci değişiklikleri ölçerek kan hücrelerinin boyutunu tespit eder) kullanılarak, trombositler sayısı. </li><li> 10 dakika inkübasyondan sonra, trombosit süspansiyonuna 25 uM PGI2 2.5 uL / mL eklemek ve hemen sonra 8 dakika boyunca 1.900 x g&#39;de santrifüj. </li><li> Süpernatantı ve ta tamponu yeterli bir hacmi ile 250.000 trombosit / uL bir konsantrasyona pelletini U 0.01 apiraz 32 uL / mL ihtiva eden (hücre sayısı uL 500.000, 10 ml ta tamponu içinde tekrar süspansiyon yani ise) / ml (son konsantrasyon, 0.32 U / ml). Not: apiraz yüksek konsantrasyonu agonistleri yokluğunda, ATP 10, 11 kendiliğinden salgılanmasıyla oluşan P2X1 reseptörlerinin desensitizasyon önlemek için kullanılır. Kollajen ile indüklenen tepkileri hızlı parakrin ile uyarılmaktadır Bu önemlidir, çünkü / ATP tarafından P2X1 otokrin aktivasyon fr yayımlananom trombosit aktive. trombosit sinyal yolu kritik P2X1 fonksiyonunun korunmasına gerektirmez ise, 0.02 U / ml apiraz kullanın. (Mahaut-Smith ve ark., 10 gözden) çeşitli çalışmalar 0.02 U / ml apiraz ihmal edilebilir P2X1 yanıtlarla ADP reseptör P2Y1 duyarsızlaştırma engellediğini göstermiştir. </li><li> aggregometric ölçümleri yapılmadan önce, 37 ° C&#39;de en az 30 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu inkübe edin. Hazırlama 5 ile 8 saat boyunca stabildir. </li></ol> 4. agregometri <ol><li> Tyrode tampon içinde fibrinojen (56 mg / ml) hazırlayın. </li><li> Cam küvet içine trombosit süspansiyonu pipetleyin 260 uL (Şekil 1A, sol küvet) - bekletme oyuklarında, bu 37 ° C &#39;de 3 dakika 10 fibrinojen uL (56 mg / ml) ve bir manyetik karıştırma çubuğu içeren, daha sonra 2 süspansiyonu inkübe agregometre (Şekil 1B ve 1C) içinde. </li><li> Panx1 ile önceden kuluçkayaönleyicisi Parlak Mavi ÜİT 37 ° C &#39;de, 7 dakika için 2.8 mM veya 28 mM stok çözeltisi (nihai konsantrasyon 100 uM ve 1 sırasıyla mM), 10 uL eklenmesiyle gerçekleştirilebilir. </li><li> 10 uL fibrinojen (56 mg / ml), trombositler olmadan 10 uL Parlak Mavi FCF (2.8 mM veya 28 mM) ve TA tamponu ihtiva eden bir küvete OD&#39;si ölçülerek, bir varsayımsal% 100 agregasyon değerine agregometre kalibre edin. <ol><li> Bir toplama de altında otomatik olarak karıştırıldı küvet yerleştirilir ve (agregasyon da 1 kullanılırsa, örneğin, pres F1) agregometrede bağlantılı bilgisayarın klavyesi karşılık gelen düğmesine basın. NOT: Aşağıda açıklanan Bu deney Parlak Mavi ÜİT içerir. Kalibrasyon için kullanılan bileşik deney koşulu için ayarlanmalıdır. </li></ol></li><li> Otomatik karıştırma altında deney için kullanılacak olan aynı trombosit örnek kullanarak, bir varsayımsal% 0 agregasyon değerine agregometre kalibreg. <ol><li> İyi bir araya getirilmesinde küvet koyun ve agregometre bağlantılı bilgisayarın klavyesinde karşılık gelen düğmeye basın. Devam etmeden önce yaklaşık 20-30 sn bekleyin. Bu gecikme hiçbir toplama agonistleri eklemeden önce olur sağlamak için hizmet vermektedir. Not: trombosit sayısında herhangi bir fark ölçülen OD üzerinde bir etkiye sahip gibi,% 0 kalibrasyon adımı, her bir ölçüm için tekrar edilmesi gerekmektedir. </li></ol></li><li> küvet içine, (75 uM son), araşidonik asidin arzu edilen agonist 20 uL, örneğin 15 ug / ml kolajen (1 ug / mL nihai) ya da 1.125 mM ekleyin. Hemen agregometrede bağlantılı bilgisayarın klavyesi karşılık gelen düğmeye basarak sürekli otomatik karıştırma altında kayıt başlar. Not: agonist ilave trombosit aktivasyonuna yol açar. Trombosit agregalar açık deneyde (Şekil 1A sonunda cam küvet içinde ayırt edilebilir; Right küvet). </li><li> kayıt otomatik 6 dakika sonra durur. Bu noktada, bilgisayarın tasarruf simgesine tıklayarak verileri kaydetmek. Not: agregasyon hızının hesaplanması yüzdesi olarak kümelenme işlemi uç sonuçlar ifade bilgisayar tarafından gerçekleştirilir. </li><li> Verileri analiz edin. <ol><li> Yıkanmış trombositler süspansiyonlar ve trombosit agregasyonunun türbidimetrik ölçüm hazırlanması için protokoller ek detaylı bilgi için bu alanda 12, 13, uzmanlar tarafından kaleme diğer kağıtlar bakın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogenesis+of+platelets+from+megakaryocyte+proplatelets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets.</a> J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).</li>
<li>Andrews, R. K., Berndt, M. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15507277">Platelet physiology and thrombosis.</a> Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).</li>
<li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).</li>
<li>Creager, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+of+the+CAPRIE+trial%3A+efficacy+and+safety+of+clopidogrel.+Clopidogrel+versus+aspirin+in+patients+at+risk+of+ischaemic+events%5BTitle%5D)+AND+%22Vasc+Med%22%5BJournal%5D)">Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events.</a> Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).</li>
<li>Born, G. V., Cross, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14056485">The Aggregation of Blood Platelets.</a> J Physiol. 168, 178-195 (1963).</li>
<li>Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BPlatelet+aggregation%3A+a+tool+for+clinical+investigation+and+pharmacological+study+Methodology%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biol+Clin+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">[Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology].</a> Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).</li>
<li>Molica, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+a+polymorphism+in+the+Pannexin1+gene+in+collagen-induced+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation.</a> Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).</li>
<li>Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+human+platelet+activation+by+surface+pannexin-1+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels.</a> J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).</li>
<li>Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+food+dye+FD%26C+Blue+No.+1+is+a+selective+inhibitor+of+the+ATP+release+channel+Panx1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).</li>
<li>Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2X1+receptor+and+platelet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signal%22%5BJournal%5D)">The P2X1 receptor and platelet function.</a> Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).</li>
<li>Hechler, B., et al. <a target="_blank" href="http://jpet.aspetjournals.org/content/314/1/232">Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4',4'',4'''-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt].</a> J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).</li>
<li>Cazenave, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+washed+platelet+suspensions+from+human+and+rodent+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood.</a> Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).</li>
<li>Jarvis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+aggregation%3A+turbidimetric+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Platelet aggregation: turbidimetric measurements.</a> Methods Mol Biol. 272, 65-76 (2004).</li>
<li>Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+volume+changes+associated+with+light+transmittance+changes+in+the+platelet+aggregometer%3A+dependence+upon+aggregating+agent+and+effectiveness+of+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus.</a> Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).</li>
<li>Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+turbidity+to+the+stages+of+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation.</a> Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).</li>
<li>Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+evaluation+of+platelet+aggregation+in+whole+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood.</a> Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).</li>
<li>Hayward, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+methods+for+determining+reference+intervals+for+light+transmission+platelet+aggregation+tests+on+samples+with+normal+or+reduced+platelet+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts.</a> Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).</li>
<li>Frelinger, A. L. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+function+tests%2C+independent+of+platelet+count%2C+are+associated+with+bleeding+severity+in%5BTitle%5D)+AND+%22ITP.+Blood%22%5BJournal%5D)">Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in.</a> ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).</li>
<li>Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+spontaneous+aggregation+in+platelet-rich+plasma+is+increased+in+habitual+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers.</a> Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).</li>
<li>Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+exercise+and+exercise+conditioning+on+blood+platelet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function.</a> Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).</li>
<li>Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregometry+detects+platelet+hyperreactivity+in+healthy+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals.</a> Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).</li>
<li>Cattaneo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+Standardization+of+Light+Transmission+Aggregometry%3A+A+Consensus+of+the+Working+Party+from+the+Platelet+Physiology+Subcommittee+of+SSC%2FISTH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH.</a> J Thromb Haemost. , (2013).</li>
<li>Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+hemichannel+and+pannexin+channel+electrophysiology%3A+how+do+they+differ%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ?</a> FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).</li>
<li>European Food Safety Authority. <a target="_blank" href="https://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/1853">Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive.</a> EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).</li>
<li>Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+gel-filtered+human+platelets%3A+isolation+and+characterization+in+a+medium+containing+no+added+Ca2%2B%2C+Mg2%2B%2C+or+K%2B%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+.</a> J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Kanama riskini artıran olmadan tromboz önlemek amacıyla trombosit fonksiyonunu modüle edebilen yeni ilaç bulmakta büyük bir ilgi vardır. Bu amaç için, güvenilir ve tekrarlanabilir bir insan plateletlerinde agregasyon karşılıklarının izlenmesi için, in vitro laboratuar testleri kesinlikle gereklidir. Bulanıklık agregometri gerçekleştirmek için kolay bir tekniktir. Ancak, bazı önlemler unutulmaması gerekir. toplama işlemi karıştırıldıktan büyük ölçüde bağımlı olduğu gibi ölçümler sürekli karıştırma altında gerçek...

Trombositler, kan ve pıhtılaşma ile ana işlevi-birlikte önemli bileşenleridir, kan damar hasarı sonrası kanamayı durdurmak için faktörlerin-olduğunu. Trombositler, kemik iliği 1 megakaryosit türetilmiş küçük (2-3 um) nukleussuz fragmanlarıdır. Trombositler ve bu süreçte mercek şeklinde yapılar olarak görünür, aktif olmayan halde dolaşır. endotelyumdaki kesinti üzerine, trombosit delik, birincil hemostaz adı verilen bir işlem takmak için kan damarı hasar bölgesinde toplanır. Başlangıçta, trombositler yaralanma yapışma aşama 2&#39;de bir sonucu olarak maruz kollajen ve von Willebrand faktörü gibi bir alt endotelial moleküller, ekleyin. Sonra, şekil değiştirebilir ve kimyasal haberciler-aktivasyon aşamasını salgılar. Son olarak, reseptörleri toplanma aşaması köprü ile birbirine bağlanır. Primer hemostaz stabilize fibrin birikimi, pıhtılaşma aktivasyonu kapsayan bir ikincil işlem takip ederBaşlangıç trombus 2 s. Miyokardiyal enfarktüs 3 olarak akut iskemik olaylar nedeniyle sıklıkla bir aterosklerotik plak fiziksel parçalama (kopma) arasında meydana trombusları. Güncel antiplatelet ilaçlar bu yaygın hastalığın tedavisinde temel taşlarıdır ancak klinik yarar kanama riskinde artış ile sınırlıdır. Kardiyovasküler hastalarda, aspirin ve anti-P2Y12 bileşikleri en çok önerilen ilaçlar, tromboksan A2 ve trombosit aktivasyonu giden ana yollar sırasıyla ADP yollar 4, hedef. Ancak, optimum antitrombotik etkileri ve hemorajik riski dengelemek olurdu yeni hedeflere doğru yenilikçi araştırmalar hala gereklidir. Bugüne 1960&#39;lardan 5 itibaren, türbidimetrik agregometri trombosit reaktivitesi ve i bilgimizi arttırmak, araştırma önemli bir rol oynamıştırİnsanlarda anti-trombotik reaktiflerin potansiyelinin kontrolü n. Türbidimetrik ilk kan örneklerinden ekstrakte PRP uygulanmıştır. Gerçekten de, kan toplama sitrat trombosit bütünlüğü ve işlevi üzerinde herhangi bir etkiye sahip olmaksızın PRP hızlı ve büyük üretimine izin verir içeren tüpler içerisinde gerçekleştirildi. Bununla birlikte, PRP kısa süreli kararlılık (yaklaşık 3 saat) ve trombin gibi kalan plazmatik enzim, ve potansiyel olarak artefakt agregasyon profilleri ile bağlantılı düşük kalsiyum konsantrasyonlu PRP kullanımı için önemli bir rahatsızlık vardır. Önemli bir ilerleme ek bir santrifüjleme ve yıkama 6 numaralı adımları ile trombosit izolasyonu için bir yöntemin geliştirilmesi olmuştur. bir izo-ozmotik bir fosfat tamponu (Tyrode tamponu) içeren glikoz, insan serum albumini ve iki değerli c tekrar askıya alınmadan önce Kısacası, PRP asit sitrat dektroz (CD) üzerinde alınan tam kandan izole edilir ve trombosit seri santrifüj aşamasından sonra izole ediliralar (Ca2 + ve Mg2 +). trombosit reaktivite değişiklikleri önlemek için, Tyrode tamponu pH dikkatli bir şekilde 7.35-7.4 tutulur. Ayrıca, trombositlerin arzu edilmeyen aktivasyonunun, bir santrifüj aşamasından önce (PGI2) prostasiklin ilave edilerek baskılanmaktadır. Son olarak, apiraz eklenmesi ATP / ADP etkisine karşı dirençli hale gelen yıkanmış trombositler engeller. Elde edilen trombosit süspansiyonu pıhtılaştırıcı faktörler sahip değildir ve PRP çözümlere kıyasla gibi platelet stabilitesi, en azından iki kat artar. Buna ek olarak, trombositler aktif olmayan fakat sağlam garanti eder türbidimetrik ölçümlerin tekrarlanabilirlik ve aslında optimal bir şekilde agonistleri veya trombosit agregasyon antagonistlerinin işlem çalışma olanağı sağlar. Bu yöntemi kullanarak, son çalışmada göstermiştir ki, bir genetik yaklaşım Panx1 kanallarının oluşumunu inhibe etmek (knock-out fareler) ya da farmakolojik ile Panx1 kanal aktivitesini azaltarakindirgenmiş kolajen ile uyarılan platelet birikmesini 7 yaklaşır. Panx1 her yerde bulunan bir insan trombositleri 7, 8 de dahil olmak üzere bir çok hücre tipinde ifade edilir, ATP-salım kanalları oluşturur. İnsan inhibe çeşitli agonistlerin ilavesinden önce daha çok ya da daha az spesifik kimyasal blokerleri (probenesid, meflokin, 10 Panx1 peptitler) bir panelin bir 7 dakika ön inkübasyon, kolajen ile uyarılan bu yıkanmış plateletler üzerinde Aslında, bulanıklık derecesi gösterdi platelet agregasyon AA ve ADP trombosit tepkileri etkilenmemektedir. Biz Panx1 kanallardan ATP salma, kolajen ile uyarılan agregasyonuna yol açan GPVI sinyalleme yolağında müdahale olduğunu göstermiştir. İlginç bir şekilde, başka hastalıkların (probenesid, meflokin) uygulamaları ile birden çok FDA onaylı bileşikler trombositlerde Panx1 kanallarının aktivitesini etkiler. Bir yandan, bu seçmek için yeni terapötik perspektifler açıyoryanıtını verdiler trombosit reaktivitesi değiştirin. Öte yandan, bir bu bileşiklerin potansiyel ikincil etkilerini dikkate almalıdır. Bu bağlamda, güvenli gıda boyası Parlak Mavi FCF Panx1 9 seçici bir inhibitörü olarak tarif edilmiştir birden fazla şeker ve enerji içecekleri kullanılır. Burada bir trombosit agregasyon antagonisti olarak Parlak Mavi FCF boya etkisini araştırmak üzere uyarlanmış insan yıkanmış trombositler ve trombosit agregasyon türbidimetrik ölçümleri izolasyonu için bir protokol açıklar.

<table><tbody><tr><td>sitrik asit monohidrat (C6H8O7*H2O)</td><td>Roth</td><td>5949-29-1</td><td>göz hasarı/tahrişi tehlikesi</td></tr><tr><td>trisodyum sitrat dihidrat (Na3C6H5O7</alt>*2H<alt>2</alt>O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804-D</td><td></td></tr> <tr><td>(+)-glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-Sodyum</td><td></td></tr> <tr><td>klorür (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-Potasyum</td><td></td></tr> <tr><td>klorür (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-Sodyum</td><td></td></tr> <tr><td>bikarbonat (NaHCO<alt>3</alt>)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td>-</td></tr><tr><td>Sodyum dihidrojenofosfat monohidrat (NaH<alt>2PO4*H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-Magnezyum</td><td></td></tr> <tr><td>klorür hekzahidrat (MgCl2*6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272-Kalsiyum</td><td></td></tr> <tr><td>klorür hekzahidrat (CaCl2*6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442909</td><td>göz hasarı/tahrişi tehlikesi</td></tr><tr><td>N-2-hidroksietilpiperazin-N-2-etan sülfonik asit (Hepes)</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>15630-insan</td><td></td></tr> <tr><td>serum albümini</td><td>CSL Behring</td><td>00257/374-hidroklorik</td><td></td></tr> <tr><td>asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Solunum sistemi için aşındırıcı ve tahriş edicidir. Ciddi cilt ve göz hasarlarına neden olabilir.</td></tr><tr><td>Eppendorf 5810 R</td><td>Fisher Scientific</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>heparin</td><td>Drosspharm AG / SA</td><td>20810</td><td></td></tr><tr><td>prostasiklin I2 (PGI2)</td> <td>Cayman</td><td>18220-patateslerden</td><td></td></tr> <tr><td>apyraz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6535-fibrinojen</td><td></td></tr> <tr><td>(Hemocomplettan)</td> <td>CSL Behring</td><td>HS 73466011-trombo-agragometre</td><td></td></tr> <tr><td>SD-Medical</td><td>SD-Innovation</td><td>TA8V-Parlak</td><td></td></tr> <tr><td>mavi FCF (Erioglaucine disodyum tuzu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>80717</td><td>Uzun süreli etkilerle sucul yaşama zararlı (Çevreye salınmasını önleyin)</td></tr><tr><td>kollajen</td><td>Horm, Nycomed-araşidonik</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>asit</td><td>Bio/Data corporation</td><td>C/N 101297</td><td></td></tr> <tr><td>hücreli sayıcı Sysmex KX-21N</td><td>Sysmex Digitana&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-056-cam</td><td></td></tr> <tr><td>küvetler</td><td>SD-Innovation</td><td>THCV1000</td><td></td></tr> <tr><td>manyetik karıştırıcılar</td><td>SD-Innovation</td><td>THA100</td><td>-</td></tr></tbody></table>

kollajen ile indüklenen on aggregation pannexin1-inhibitör parlak mavi fcf: türbidimetrik İnsanlar üzerinde trombositler yıkanmış

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Türbidimetrik birine ait kullanım ya da agonist bir kombinasyonu ile (yıkanmış trombositler), ya plazma (platelet bakımından zengin plazma, PRP) &#39;de ya da tampon maddesi içinde süspansiyon haline getirildi, trombosit agregasyonunu ölçülmesi için tatbik edilen bir laboratuar tekniğidir. plazma ortamından ve antikoagülan yokluğunda ayrılır, yıkanır platelet kullanımı içsel trombosit özelliklerini incelemek için izin verir. agonistleri, arakidonik asit (AA), adenozin, di-fosfat (ADP), büyük panelin arasında, trombin ve kollajen en sık kullanılanlardır. agregasyon yanıtı sürekli karıştırma altında trombosit süspansiyonu zamanla görece optik yoğunluk (OD) ölçerek belirlenir. Homojen süspansiyon içinde trombositler bir agonistin eklenmesinden sonra ışığın geçişini sınırlandırmak, trombosit şekil değişimi OD küçük geçici artış meydana oluşur. Bu ilk Aktivasyon aşamasından sonra, trombosit pıhtıları, res olarak süspansiyon içinden ışığın geçmesine izin veren, yavaş yavaş meydanave ön muamele OD azalmıştır. toplama işlemi sonunda, trombosit bakımından fakir plazma ya da tampon OD ile karşılaştırıldığında, bir yüzde olarak ifade edilir. Titiz kalibrasyon her denemenin başında dolayısıyla esastır. Genel bir kural olarak: Kalibrasyon% 0 hiçbir trombositlerden oluşan süspansiyon ortamının OD ölçümü% 100 arasında bir değere temsil ederken olmayan bir uyarılan platelet süspansiyonu OD ölçümü ile ayarlanır. Trombosit agregasyonu, genellikle gerçek zamanlı agregasyon eğrisinin olarak görülür. Türbidimetrik platelet fonksiyonunun incelenmesi için en yaygın olarak kullanılan laboratuar tekniklerinden biridir ve tarihi altın standart olarak kabul edilir ve platelet toplanmasını inhibe etmeyi hedefleyen yeni farmasötik maddelerin geliştirilmesi için kullanılır. Burada, insan hazırlanması yıkanmış plateletler ve insan kolajen kaynaklı agregasyonun 2) türbidimetrik analiz trombositler son kimliklerini olduğu gıda boyası Parlak Mavi FCF ile ön işleme tabi tutulmuş, yıkanmış) 1 için ayrıntılı protokoller tarifPannexin1 (Panx1) kanallarının bir inhibitörü olarak tified.

agregasyonu yazılım otomatik agregasyon eğri oluşturur ve yüzde olarak maksimum agregasyon değerlerini vermektedir. değerleri istatistiksel analiz ve çubuk grafikler halinde maksimum toplanma değerleri görselleştirmek için bir veri analiz yazılımı kopyalanabilir. İsteğe bağlı olarak, toplama eğrileri her bir nokta eğrileri görselleştirmek için bir tablo yazılımı içine ve daha sonra istatistiksel yazılım (örneğin, GraphPad) art arda verilebilir. Bazı araştırmacılar, trombosit etk...

Biz bulanıklık derecesi agonist kaynaklı trombosit agregasyon ölçümleri ile takip insan kanından yıkanıp trombosit izolasyonu için basit bir yöntem tarif eder. Bir örnek olarak, Pannexin1 kanalı inhibitörü Parlak Mavi FCF ile bir ön kuluçkalama sonrası kollajen insan trombosit agregasyon cevap üzerinde çalışma yapılması için bu yöntemi uygulanır.

Kollajen ile indüklenen on Aggregation Pannexin1-inhibitör Parlak Mavi FCF: Türbidimetrik İnsanlar üzerinde Trombositler Yıkanmış

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

Bu prosedürün genel amacı, insan kanından yıkanmış trombositlerin izolasyonu için basit bir yöntemi ve ardından türbidimetri ile agonistle indüklenen trombosit agregasyon ölçümlerini tanımlamaktır. Bu yöntem, pannexin-1 inhibisyonunun agonistle indüklenen trombosit agregasyonu üzerindeki etkileri gibi, insan trombosit biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hızlı ve kolay uygulanabilir olmasıyla birlikte, agregasyon yanıtlarının güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde izlenmesine olanak tanımasıdır.Işık transmisyon agregometrisi sadece araştırma amaçlı kullanılmamakta, aynı zamanda kanama bozukluğu olan hastalarda trombosit fonksiyonlarının incelenmesi için de kullanılmaktadır. Başlangıç için, yaklaşık 4,5 pH değerine sahip 100 mililitre ACD çözeltisi hazırlamak üzere 1,4 gram sitrik asit monohidratı, 2,5 gram trisodyum sitrat dihidratı ve iki gram susuz D-glikozu distile su içerisinde çözün. Ardından, 2,5 mililitre stok çözeltiyi 15 mililitre distile su nihai hacmine seyrelterek Tyrode tamponu hazırlayın.Bir normal hidroklorür ekleyerek pH'ı 7,35'e ayarlayın ve çözeltiyi 0,22 mikronluk bir filtre kullanarak filtre steril

turbidimetry-on-human-washed-platelets-effect-pannexin1-inhibitor

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Trombosit adezyon kaskad kayma akışı varlığında yer alır, konvansiyonel (statik) iyi plaka deneyleri için bir faktör değildir. Bu makale, fizyolojik kesme akış koşulları taklit etmek için iyi bir mikroakışkan plaka formatı kullanan bir trombosit agregasyonu tahlil raporları.

Mikroakışkan Akış Hücreler kullanarak Akış altında Trombosit Yapışma ve toplama

Bu video, kayma stresinin trombositler üzerindeki etkisini değerlendirme yöntemini göstermektedir. Antikor tedavisi, mekanoreseptör komplekslerinde ayrışma ve konformasyonel değişikliklere neden olur, trombositleri aktive eder ve yüzeydeki belirteçleri eksprese eder. Bu belirteçler immün boyama ve akış sitometrisi ile gözlenir.

Kayma Gerilmesinin Mekanosensoriyel Reseptörlere Karşı Antikorlarla Tedavi Edilen Trombositler Üzerindeki Etkileri

Bu video, önceden işlenmiş, yıkanmış insan trombositlerinde kollajen kaynaklı trombosit agregasyonunu değerlendirmek için türbidimetrik analizi göstermektedir. Kontrol kuyuları kollajen kaynaklı agregasyon gösterirken, yüksek konsantrasyonda inhibitörler Pannexin-1 kanallarını bloke eder, böylece değişmemiş bulanıklıktan belirgin olan kollajen kaynaklı trombosit agregasyonunu inhibe eder.

Önceden İşlem Görmüş İnsan Trombositlerinin Kollajen Kaynaklı Agregasyonunu İzlemek için Bir Türbidimetrik Analiz

Bu makale aynı zamanda trombosit fonksiyonu ve pıhtılaşmayı ölçen hemostaz deneysel model tanımlamaktadır. Trombosit ve fibrin floresans gerçek zamanlı olarak ölçülür ve platelet yapışma oranı, bir pıhtılaşma hızının, pıhtılaşma başlangıcı belirlenir. Model transfüzyonu için konsantreleri akışı altında trombosit prokoagülan özelliklerini belirlemek için kullanılır.

Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Koni plaka Viskozimetre kullanılarak trombosit yüzey reseptörlerine Tekdüzen kesme uygulamak için bir çözüm içi yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, diğer hücre türlerine ve hücre parçalara kesme uygulamak için daha geniş ölçüde kullanılabilir ve belirli bir ligand-reseptör çifti hedeflemek gerekmez.

Koni-plaka viskozimetre ile ınsan trombosit ve hücre yüzeyi reseptörleri için Tekdüzen kesme tahlil

Ayarlanabilir yoğunluğa sahip RGD ile işlevselleştirilmiş avidin-biyotin bağları kullanılarak tek göç eden trombositlerin görüntülenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanır ve trombositlerin avidin-biyotin bağını koparmak için yeterli kuvvet ürettiğini ortaya çıkarır.

RGD İşlevselleştirilmiş Avidin-Biotin Bağları Kullanarak Trombosit Migrasyonunu İncelemek İçin Bir İn Vitro Test

Prokoagülan trombosit oluşumu, artmış tromboz riski ile ilişkilendirilmiştir. Burada, prokoagülan trombositlerin ayırt edici özellikleri olan fosfatidilserin ve mikrovezikül salınımının maruziyetini ölçmeyi amaçlayan, yıkanmış trombositleri insan kanından izole etmek için kesin bir protokol sunulmaktadır.

İnsan Saflaştırılmış Trombositlerinden Fosfatidilserin Maruziyeti ve Mikrovezikül Salınımının Ölçülmesiyle Prokoagülan Trombosit Karakterizasyonu

Akış altındaki trombosit fonksiyonu değerlendirilebilir ve simüle edilmiş hemostatik resüsitasyon, travma ve transfüzyon tıbbında uygulamaları olan bir mikroakışkan cihaz kullanılarak modellenebilir.

Trombosit Fonksiyonunun Değerlendirilmesinde Mikroakışkanlar

Trombosit metabolizması, özellikle kanama ve trombotik bozukluklarda trombosit hiper ve hipoaktivitesinin rolü ile ilgili olduğu için ilgi çekicidir. Bazı metabolik tahliller için trombositlerin plazmadan izole edilmesi gereklidir; Burada sunulan, yıkanmış trombositlerden hücre içi metabolitlerin izole edilmesi için bir yöntemdir.

Kantitatif metabolik akı çalışmaları için yıkanmış insan trombositlerinin hazırlanması

Trombositler için çok renkli akış sitometrisi, klasik trombosit alt popülasyonları içinde istirahat, agregatör, prokoagülan ve apoptotik trombositler gibi yeni trombosit alt tiplerini tanımlayabilir. Bu, çeşitli trombosit agonistleri tarafından indüklenen farklı alt popülasyon modellerinin karşılaştırılmasına izin verir. Burada, çok renkli bir akış sitometrisi paneli oluşturmak için bir prosedür ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Trombosit Alt Popülasyonlarının Çok Renkli Akış Sitometrisi ile Analiz Edilmesi

Mevcut protokol, nekroz, apoptoz ve trombosit aktivasyonunun örtüşen özelliklerini sergileyen prokoagülan trombositleri analiz etmek için gerekli olan kapsamlı bir dizi prosedür sağlar.

Nekroz, Apoptoz ve Trombosit Aktivasyonu Özellikleri Sergileyen Prokoagülan Trombositlerin Kapsamlı Analizi

Öğrenin, insan kanından yıkanmış trombosit izolasyonu ve türbidimetri ile agregasyon ölçümü yöntemini. Pannexin-1 inhibitörü Brilliant Blue FCF kullanarak kollajen uyarımına yanıtı inceleyin.

Kollajen ile indüklenen on Aggregation Pannexin1-inhibitör Parlak Mavi FCF: Türbidimetrik İnsanlar üzerinde Trombositler Yıkanmış (Video) | JoVE Journal

Kollajen ile indüklenen on Aggregation Pannexin1-inhibitör Parlak Mavi FCF: Türbidimetrik İnsanlar üzerinde Trombositler Yıkanmış

Daha fazla video keşfet