Name: CAPRRESI: Plazmid Geri Kazanım ve Kısıtlama Enzim Yerinin Eklenmesi ile Chimera Meclisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Öğrenin CAPRRESI yöntemiyle plazmid geri kazanım ve kısıtlama enzim yerinin eklenmesi kullanarak kimera gen montajı. Bu hızlı ve düşük maliyetli teknik, protein kodlayan genleri birleştirmek için moleküler biyolojide gen işlevi araştırmalarına yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, Meksika (hibe numarası 154833) ve Universidad Nacional Autónoma de Mexico tarafından desteklendi. Yazarlar, Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos ve Soledad Juarez&#39;e idari ve teknik tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorlar.

1. CAPRRESI Protokolü NOT: Şekil 1 , genel CAPRRESI protokolünü gösterir. Bu teknik, siliko tasarıma ve arzulanan kimeraların oluşturulmasına dayanır. <ol><li> Klonlama plasmidinin seçimi, pUC18 veya pUC19. <ol><li> Teknik taleplere en iyi uyan pUC vektörünü seçin. NOT: Her iki vektör birden fazla klonlama alanının yönlendirilmesi haricinde aynı sıraya sahiptir. Bu, oligonükleotidlerin tasarımı ve PCR plazmiti parçalanması için önemlidir. </li></ol></li><li> Vahşi tipli genlerin ve pUC18 / 19 dizilerinin in silico analizi. <ol><li> Vahşi tipli genlerin DNA dizilerini elde edin ve bir FASTA format dosyasına kaydedin ( ör . Genes.fas). NOT: pUC18 / 19 vektörlerinin sekansları pUC.fas dosyasında bulunur ( Şekil 1 , adım 1). </li><li> Hangi kısıtlama enzimini belirleyinYmes, REsearch.pl komut dosyasını çalıştırarak vahşi tipli genleri ve pUC18 / 19 dizilerini kesmeyin. Alternatif olarak, bir çevrimiçi araç ile bir kısıtlama enzim bölgesi araştırması yapın ( Şekil 1 , adım 2). <ol><li> Bir terminalin içine aşağıdakileri yazın: Perl REsearch.pl genes.fas Perl REsearch.pl pUC.fas NOT: Bu komutlar aşağıdaki çıktı dosyalarını oluşturur: genes_lin.fas, genes_re.fas, pUC_lin.fas ve pUC_re.fas. </li><li> Yabanıl tip genleri, genes_re.fas ve pUC.fas dosyalarını karşılaştırarak seçilen pUC18 / 19 vektörünün çoklu klonlama alanına klonlamak için uygun kısıtlama enzimlerini seçin. Ekin pUC18 / 19 vektörünün ampisilin direnç genine ( ampR ) göre yönünü seçin. </li></ol></li><li> Vahşi tip genlerin kodlama bölgesini (dış oligonükleotidler) büyütmek için ileri ve ters oligonükleotitler tasarlayın. Her 5 &#39;ucuna uygun kısıtlama enzimi bölgesi dahil edinOligonükleotitlerin; Bu insert yönünü belirleyecektir. <ol><li> İleri oligonükleotidlerde fonksiyonel bir ribozom bağlama sitesi ekleyin. </li><li> Her iki vahşi türevi geni de vektörün içine aynı yönde yerleştirin. </li></ol></li></ol></li><li> Kimera montajı ve plazmid bozulması için kırılma bölgelerinin seçimi. <ol><li> Translate.pl komut dosyasını çalıştırarak vahşi ve ampR genlerinin amino asit dizisini elde edin ( Şekil 1 , adım 3). <ol><li> Bir terminalin içine aşağıdakileri yazın: Perl translate.pl genes.fas Perl translate.pl ampr.fas NOT: Bu betik aşağıdaki çıktı dosyalarını oluşturacaktır: genes_aa.fas ve ampR_aa.fas. </li></ol></li><li> İki vahşi amino asit sekansını uygun bir yazılımla ( örn . KASÇI) küresel olarak hizalayın 9 . </li><li> Kimera asse için istenen kırılma bölgelerini seçin (3-6 amino asit)Sıralı hizalamaya dayalı olarak mbly. Onları FASTA formatındaki bir dosyaya kaydedin ( ör . , Regions.fas). </li><li> Seçilen amino asit uzayı kodlayan DNA sekanslarını her iki yabanıl tip gen üzerinde bulun. </li></ol></li><li> Restriksiyon enzimi alanlarını içeren eşanlamlı DNA sekanslarının üretimi. <ol><li> Kırma bölgeleri olarak seçilen her bir amino asit sekansı gerginliği için kodlayan tüm eş anlamlı DNA dizilerini elde edin ( Şekil 1 , adım 4); Bu sekanslar regions.fas dosyasında saklandı. <ol><li> Bir terminalin içine aşağıdakileri yazın: Perl synonym.pl regions.fas NOT: Bu betik regions_syn.fas çıktı dosyasını oluşturacaktır. </li></ol></li><li> Sinonim DNA dizileri üzerinde bulunan kısıtlama enzim sitelerini arayın. <ol><li> Bir terminal içine aşağıdakileri yazın: perl REsynonym.pl regions_syn.fas NOT: Bu betik, regions_syn-re.fas çıktı dosyasını oluşturacaktır. </li></ol></li><li> Her iki vahşi tipli genin eşanlamlı sekansları arasında paylaşılan bir kısıtlama enzimi seçin; Bu site kısıtlama enzimi sindirimi yoluyla kimeraları bir araya getirmek için kullanılacaktır. Seçilen kısıtlama enziminin, ne vahşi tip genleri ne de pUC18 / 19 vektör sekanslarını kesmediğini doğrulayın. <ol><li> Genes_re.fas, pUC_re.fas ve regions_syn-re.fas dosyalarında bulunan kısıtlama enzimlerini karşılaştırın. </li></ol></li><li> Silikonun orijinallerini, eşanlamlı DNA dizileri için, her iki vahşi türe ait genin karşılık gelen lokuslarında değiştirin. Eşanlamlı DNA dizilerini vahşi dizi dosyasına (genes.fas) ekleyin. </li><li> Genes.fas dosyasında bulunan genlerin amino asit dizisini elde edin ( perl translate.pl genes.fas ). </li><li> Vahşi ve eş anlamlı DNA dizilerinden çevrilen amino asit dizilerini hizalayın. Her iki dizinin de aynı olduğunu doğrulayın. </li><li> PU üzerinde bulunan ampR geni ile bu bölümün tüm adımlarını tekrarlayınC18 / 19 vektör. NOT: Amaç, ampR genini (dosya ampr.fas) iki tamamlayıcı parçaya bölmektir. AmpR genini bozmak için seçilen kısıtlama enzimi, kimera montajı için kullanılanlardan farklı olmalıdır. </li></ol></li><li> İki vahşi türe ait genin seçilen pUC18 / 19 vektörüne bağımsız olarak klonlanması (Şekil 1, adım 3). <ol><li> Seçilen pUC18 / 19 plasmid DNA&#39;sını bir plazmid DNA saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın. <ol><li> Örneğin E. coli DH5α&#39;nın pUC18 plazmid ile transforme edilmesi ve transformantların 37 ° C&#39;de katı LB-0.3 mg / mL ampisilin (Amp) üzerinde büyümesini sağlayın. Bir transformant koloni seçin, yeni bir LB-0.3 mg / mL Amp plakası inoküle edin ve gece boyunca 37 ° C&#39;de büyütün. </li><li> Önceki kültürden bir miktar alın ve 6-8 saat boyunca 37 ° C&#39;de sıvı LB-0.3 mg / mL Amp içinde büyütün. Plazmid DNA&#39;sını bir kit kullanarak çıkarın. </li></ol></li><li> PCR kullanılarak, toplam genomik DNA&#39;dan vahşi tip genler yükseltilirHarici oligonükleotidleri saflaştır. Mümkünse yüksek kaliteli DNA polimeraz kullanın. Verimi en üst düzeye çıkaran DNA polimerazını seçin. PCR, üreticinin talimatlarına ve oligonükleotidlerin erime sıcaklığına göre gerçekleştirilir. <ol><li> Kullanılan DNA polimeraz, amplikon boyutu, şablonu ve oligonükleotitlere bağlı olarak PCR döngülerini çalıştırın. Örneğin, rpoD DNA&#39;sını çoğaltmak için, 50 μL reaksiyon hazırlayın: 5 uL 10x tampon, 2 μL 50 mM MgSO 4 , 10 mM dNTP karışımı 1 uL, her 10-μM oligonükleotidin 2 μL (Tablo 2), 2 Şablon DNA&#39;sı ( E. coli DH5α toplam DNA), 35.8 μL ultra saf su ve 0.2 μL yüksek doğrulukta DNA polimeraz. Aşağıdaki PCR döngülerini çalıştırın: İlk denatürasyon için 1 dakika, ardından 30 çevrim amplifikatörü (denatürasyon için 94 ° C&#39;de 30 saniye, oligonükleotidlerin tavlanması için 60 ° C&#39;de 30 saniye ve 68 ° C&#39;de 2 dakika) genişletmek). </li><li> 1.2 g çözünürAgaroz, mikrodalga fırında ısıtılarak 100 mL&#39;lik iki damıtılmış suda yıkanır. Bir jel tepsi ve tarağı toplayın ve yatay jel şist içine koyun. Jel tepsisini eritilmiş agaroz çözeltisi ile doldurun ve katılaşmasına izin verin. Tarağı çıkarın. </li><li> Jel elektroforez odasına yerleştirilir. Odaya 1x Tris-asetat-EDTA tamponu doldurun. Jel kuyularına 50 μL PCR ürünü yükleyin. Örnekleri elektroforez ( örn . 110 V&#39;de 1 saat boyunca). </li><li> Elektroforezden sonra, jel yavaşça çalkalanarak 10 dakika boyunca 100 mg&#39;lık 1 mg / mL etidyum bromür çözeltisi içeren 100 ml&#39;lik çift damıtılmış suyla lekelenir. Jeli yavaşça sallayarak iki kez damıtılmış suda 10 dakika daha yıkayın; Yatay bir çalkalayıcı kullanın. Dikkat: Etidyum bromür toksik bir bileşiktir; Koruyucu eldiven ve pamuklu bir laboratuar önlüğü giyin. </li><li> Bir kit kullanarak jelin ilgili bantlarından vahşi tipli gen DNA&#39;yı saflaştırın. Boyanmış jelin bir UV odacığa yerleştirilmesi ile bantları görselleştirin (Önerilen dalga boyu: 300 nm). Jelin maruziyetini asgari seviyede tutun. Bir DNA saflaştırma kiti kullanın ve üreticinin talimatlarını izleyin. Dikkat: UV radyasyonu tehlikelidir; Koruyucu bir kalkan, bardak ve pamuk laboratuar ceketi takın. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına göre kısıtlama enzimleri ile saflaştırılmış vahşi tipli genleri ve pUC18 / 19 plasmid DNA&#39;yı özümleyin. Mümkünse hızlı sindirim enzimlerini kullanın. Örneğin, ultrafure su 10 uL, 10X tampon 2 mcL, Kpn I kısıtlama enzimi 1 uL ve Xba I kısıtlama enzimi 1 mcL pUC18 DNA (300 ng / μL) sindirmek 6 mcL. Reaksiyonu 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de bırakın. <ol><li> Restriksiyon enzimlerini üreticinin talimatlarına göre etkisiz hale getirin. Örneğin, çift sindirim reaksiyonunu Kpn I- Xba I&#39;i 80 ° C&#39;de 5 dakika boyunca etkisiz hale getirin. </li></ol></li><li> Karışım ekleme: hacimsel bir rasattaki vektör DNAO 3: 1. Ligasyon reaksiyonu için üreticinin talimatlarını izleyin. Mümkünse hızlı ligasyon enzimlerini kullanın (reaksiyonu 10 dakika boyunca 25 ° C&#39;de bırakın). NOT: Tipik olarak, kitleri kullanarak saflaştırma sonrası DNA konsantrasyonu, sindirim ve ligasyon reaksiyonları için yeterlidir. Örneğin, 6 μL rpoD DNA ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μL), 3 μL pUC18 DNA ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μL), 10 uL 2x tampon, 1 μL ultra safi ilave edin Su ve 1 uL T4 DNA ligazı. Ligasyon reaksiyonu 25 ° C&#39;de 10 dakika bekletilir. </li><li> Yardımcı Materyaller&#39;de açıklandığı üzere E. coli DH5α&#39;yı ligasyon reaksiyonundan 2-4 uL ile değiştirin. Dönüştürülen hücreleri katı LB / Amp / X-gal / IPTG plakalarına yerleştirin. Plakaları gece boyunca 37 ° C&#39;de bırakın. </li><li> Beyaz renkli transformant E. coli kolonilerini seçin ve yeni bir LB / Amp plakası üzerine çizin. Plakaları gece boyunca 37 ° C&#39;de bırakın &lt;/ Li&gt; <li> Ek Malzemelerde açıklandığı gibi, reaksiyonun dizilimi için adayları seçmek için bir koloni PCR yapın. Adalardan plazmid DNA&#39;yı çıkarın. Alternatif olarak, insertleri klonlamak için kullanılan aynı restriksiyon enzimleriyle aday plasmid DNA&#39;yı sindirin. </li><li> Sıralı servis sağlayıcı ile sıra adayı yapılandırmaları 10 . Bir DNA birleştirici 11 ( Şekil 1 , adım 5) kullanarak diziyi siliko olarak toplayın . </li></ol></li><li> PCR ile plazma bozunumu, ardından kısıtlama enzimi sindirimi. <ol><li> Sırasıyla vahşi tip ve ampR genleri için kırılma bölgelerindeki silico ileri ve ters oligonükleotidlerde tasarım. Eşdeğer DNA sekansı için vahşi tip fragmanı (adım 1.4&#39;te elde edilen) siliko olarak değiştirin. NOT: Bu eşanlamlı DNA sekansı bir sınır enzim bölgesi içerir. İleri ve geri oligonükleotidler tO kısıtlama enzimi sitesi. Oligonükleotidler 21-27 nükleotid arasında değişmeli ve bir sitozin veya guanin ile sonuçlanmalı ve bir kısıtlama enzimi bölgesi içermelidir. Bir ileri oligonükleotit, şablon DNA üzerindeki hedef bölgesi ile aynı sekansa sahiptir. Bir ters oligonükleotit, şablon DNA üzerindeki hedef bölgenin ters tamamlayıcı dizisidir. </li><li> PCR reaksiyonları için DNA şablonu olarak iki vahşi tipli gen yapısını kullanın ( örn., PUC18 rpoD ve pUC18 sigA ). Her bir yapının iki tamamlayıcı parçası elde edin (pUC18 rpoD σ1-σ2, pUC18 rpoD σ3-σ4, pUC18 sigA σ1-σ2 ve pUC18 sigAσ3-σ4) ( Şekil 1 , adım 6). </li><li> DNA örneklerini agaroz jel içine% 1-1.2 [w / v] yükleyin. PCR ürünlerini DNA şablondan elektroforez ile ayırın ( örn . 1 saat boyunca 110 V). Alternatif olarak, DNA şablonunu kırmak için Dpn I ile PCR reaksiyonlarını sindirin . NOT: DpnBen enzim sadece metillenmiş DNA dizilerini tanır (5&#39;-GATC-3 &#39;). <ol><li> Bir DNA saflaştırma kiti kullanarak numuneleri saflaştırın. Üreticinin yönergelerini izleyin. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına göre tüm tamamlayıcı DNA parçalarını uygun kısıtlama enzimleri ile iki kez sindirin. Mümkünse hızlı özüt restriksiyon enzimlerini kullanın. Örneğin, pUC18rpoDσ1-σ2 DNA fragmanını Afl II ve Spe I ile üreticinin protokolünü kullanarak çift-sindirin. Sindirim reaksiyonunu 37 ° C&#39;de 15 dakika bekletin. </li><li> Restriksiyon enzimlerini üreticinin talimatlarına göre etkisiz hale getirin. Örneğin, Afl II- Spe I&#39;i 80 ° C&#39;de 20 dakika boyunca etkisiz hale getirin. </li></ol></li><li> DNA ligasyonu ve bakteriyel transformasyon kullanılarak plazma geri kazanım. <ol><li> İstenilen kimerik geni birleştirmek için uygun DNA fragmanlarını hacimsel 1: 1 oranında karıştırın ( Şekil 31, adım 7). NOT: Bu yolla ampR geninin bütünlüğü restore edilerek işlevsel bir protein üretilir. <ol><li> Örneğin, 4 μL pUC18 rpoD σ1-σ2 DNA ( Afl II- Spe I ile sindirim, 150 ng / μL), 4 uL pUC18 sigA σ3-σ4 DNA&#39;sı ( Afl II- Spe I, 150 ng / μL) 10 uL 2x tampon, 2 uL ultra saf su ve 1 uL T4 DNA ligaz; Kitin arındırılmasından sonraki DNA konsantrasyonu, sindirim ve daha sonra ligasyon için yeterlidir. Ligasyon reaksiyonu 25 ° C&#39;de 10 dakika bekletilir. </li></ol></li><li> E. coli DH5α&#39;yı 3-5 μL&#39;lik kinera montaj ligasyon reaksiyonu ile (Takviye Malzemeleri) değiştirin. Gece boyunca 37 ° C&#39;de gece boyunca LB / Amp / X-gal / IPTG plakalardaki transformant hücreleri büyütün. </li><li> Beyaz renkli transformant E. coli kolonilerini seçin ve yeni bir LB / Amp plakası üzerine çizin. Plakaları gece 37&#39;de bırakın° C. </li><li> Tamamlayıcı Materyaller&#39;de açıklandığı gibi, bir sekanslama reaksiyonu için aday seçmek için bir koloni PCR yapın. % 1-1.2 (w / v) agaroz jelinde bantları elektroforez yaparak gözlemleyin (adım 2.3.2.1&#39;de açıklanmıştır). </li><li> Olumlu adaylardan kültürler kazanın. Plazmid DNA saflaştırma kiti kullanarak onlardan plazmid DNA&#39;yı çıkarın. </li></ol></li></ol> 2. Sıra Adayı Şimerik Yapılar <ol><li> Sekans servis sağlayıcısının yönergelerini izleyerek, plasmid DNA&#39;nın kalitesinin sıralama reaksiyonu için yeterince iyi olduğundan emin olun. DNA&#39;yı arıtma kitleri kullanarak çıkarın. Örneğin, sekans hizmet sağlayıcısının İnternet sayfasında, numuneler için önerilen DNA konsantrasyonuna özel dikkat gösterin. Bir DNA kantifikasyon cihazı kullanarak numunelerin konsantrasyonunu elde edin. </li><li> Sıralı aday kimerik yapılar ile sıralama servis sağlayıcı 10 . </li><li> Birleştirin se<html> In silico DNA assembler ile okuma okuma 11 . </li><li> Sıralı hizalama takımları 9 , 12 kullanarak toplayılmış karşı silico- tasarlanmış kimerik sekansları hizalayın. Kimerik genin başarıyla kaynaştığını doğrulayın. </li></ol> 3. Hazırlıklar Yapmak NOT: Canlı hücreleri içeren tüm basamaklar, Bunsen brülörü açıkken temiz bir lamine akış kaputunda yapılmalıdır. <ol><li> E. coli DH5α-yetkili hücreleri üretmek. <ol><li> E. coli-uyumlu hücreleri üretmek için, yayınlanmış protokolleri izleyin veya Ek Malzemelere bakın . Alternatif olarak, piyasada bulunan yetkili hücreleri kullanın. </li></ol></li><li> Dönüşen E. coli DH5α-yetkili hücreler. <ol><li> E. coli kültürlerinin kimyasal transformasyonu için, yayınlanan protokolleri takip edinClass = &quot;xref&quot;&gt; 13 veya Ek Malzemelere bakın . Alternatif olarak bakteriyel transformasyon için elektroporasyon kullanın. Piyasada bulunan yetkili hücreler kullanılıyorsa, üreticinin yönergelerini izleyin. </li></ol></li><li> E. coli DH5α&#39;dan genomik ve plasmid DNA&#39;yı saflaştırma. <ol><li> Ek Malzemelerde belirtildiği gibi, piyasada bulunan kitleri kullanarak veya yayınlanan protokolleri takip eden nükleik asit ekstraksiyonu gerçekleştirin 13 . </li></ol></li><li> Koloni PCR yapın. <ol><li> Sonradan sıralama reaksiyonu için aday transformant kolonileri tanımlamak için bu tekniği kullanın. NOT: Bu yöntem, dizilerin bütünlüğünün son bir doğrulamasını temsil etmez. Bu tekniğin ayrıntılı bir açıklaması Yardımcı Materyaller&#39;de mevcuttur . </li></ol></li><li> Çözümlerin hazırlanması. <ol><li> Görmek <sTrong&gt; çözüm hazırlama hakkında daha fazla bilgi için Tablo 1&#39;e bakınız. </li></ol></li><li> CAPRRESI protokolü için gereken komut dosyalarını ve sıra dosyalarını indirin. <ol><li> İstenen türlerin tüm genom dizisini içeren gen bank dosyalarını indirin, bir genom tarayıcı kullanarak seçilen genin DNA dizisini çıkarın ve fasta dosya biçiminde kaydedin. CAPRRESI protokolü için gerekli olan Perl komut dosyalarını indirin. Komut dizilerini ve sıra dosyalarını aynı dizinde saklayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes%3A+gene+splicing+by+overlap+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li>
<li>Vos, M. J., Kampinga, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR+amplification+strategy+for+unrestricted+generation+of+chimeric+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes.</a> Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).</li>
<li>Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+Precise+GFP+Fusions+in+Plasmids+Using+Yeast+Homologous+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination.</a> Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase%3A+The+universal+reagent+for+genome+tailoring%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+improved+M13+vectors+using+oligodeoxynucleotide-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis.</a> Gene. 26 (1), 101-106 (1983).</li>
<li>Gruber, T. M., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sigma+subunits+and+the+partitioning+of+bacterial+transcription+space%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space.</a> Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUSCLE%3A+multiple+sequence+alignment+with+high+accuracy+and+high+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput.</a> Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).</li>
<li>Macrogen Inc. , Seoul, Rep. Of Korea. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://dna.macrogen.com/eng/index.jsp">http://dna.macrogen.com/eng/index.jsp</a> (2016).</li>
<li>Chevreux, B. MIRA: an automated genome and EST assembler. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.chevreux.org/thesis/index.html">http://www.chevreux.org/thesis/index.html</a> 1-161 (2005).</li>
<li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sequence+alignment+using+ClustalW+and+ClustalX%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 2 (Unit 2.3) 1-22 (2002).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.molecularcloning.com/">Molecular Cloning: A laboratory manual.</a> CSHLP. , (2001).</li>
<li>Rutherford, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artemis%3A+sequence+visualization+and+annotation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Artemis: sequence visualization and annotation.</a> Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).</li>
</ol>

Yazarlar rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

CAPRRESI, PRM 2&#39;ye alternatif olarak tasarlandı. Orijinal PRM güçlü bir tekniktir; Seçilen genlerin herhangi bir kısmı boyunca DNA sekanslarının kaynaşmasına izin verir. PRM için, vahşi tipli genler aynı plazmid içine klonlanmalıdır. Bundan sonra, oligonükleotidler, plasmidde bulunan vahşi tip ve antibiyotik direnç genleri içinde tasarlanır. Plazmid parçalanması, künt uçlu, yüksek doğrulukta DNA polimerazları ve önceden tasarlanmış oligonükleotitler kullanılarak PCR ile sağlanır. Tamamlayıcı ...

Kimerik gen montajı, protein fonksiyonunu ve / veya biyoteknolojik amaçları aydınlatmak için moleküler biyolojide yaygın şekilde kullanılmaktadır. Çakışan PCR ürün amplifikasyonu 1 , plasmid geri kazanım 2 , homolog rekombinasyon 3 , CRISPR-Cas9 sistemleri 4 , bölgeye yönelik rekombinasyon 5 ve Gibson topluluğu 6 gibi genleri kaynaştırmak için farklı yöntemler mevcuttur. Bunların her biri farklı teknik avantajlar sunmaktadır; Örtüşen PCR tasarımının esnekliği, plazmid geri kazanım sırasında yapıların in vivo seçimi veya CRISPR-Cas9 ve Gibson sistemlerinin yüksek etkinliği. Öte yandan, bu yöntemlerin bazılarını yerine getirirken bazı zorluklar ortaya çıkabilir; Örneğin, ilk iki yaklaşım kör uçlu DNA fragmanlarına dayanır ve bu tür ürünlerin ligasyonu stik ile karşılaştırıldığında teknik açıdan zor olabilirKy-bitişli ligasyon. Site yönlendirmeli rekombinasyon, CreoLuxP sisteminde olduğu gibi, orijinal üzerinde fazladan DNA dizileri izi bırakabilir ( 5) . CRISPR-Cas9 bazen hedef bölgeye ek olarak diğer genom bölgelerini de değiştirebilir 4 . Burada, plasmid geri kazanım yöntemini (PRM) eşanlamlı DNA dizileri üzerindeki kısıtlama enzimi alanlarının eklenmesi ile birleştiren protein kodlayıcı genlerin kaynaştırılması için bir protokol olan plazmid kurtarma ve restriksiyon enzim bölgesi ekleme (CAPRRESI) ile kinera montajı başlattığımızdan, ligasyon verimliliğini arttırıyoruz . Amino asit dizilimi bütünlüğünü sağlamak için, sınırlama enzimi sahaları, eş anlamlı DNA sekansı uzantılarına eklenir. CAPPRESI&#39;nin yararları sıradan laboratuar reaktifleri / araçları ( örneğin enzimler, yetkili hücreler, çözeltiler ve termosikleler) kullanılarak gerçekleştirilebilmesi ve hızlı enzim (uygun enzim kullanıldığında) hızlı sonuçlar verebilmesidir. Kısıtlamaya güvenmekEş anlamlı DNA sekanslarından çıkan enzim siteleri, ilgi proteinleri içindeki tam füzyon noktalarının seçimini sınırlayabilir. Bu gibi durumlarda, hedef genler örtüşen oligonükleotidler kullanılarak kaynaştırılmalı ve sınır enzimi alanları vektörün direnç geni üzerine eklenmelidir. CAPRRESI yedi basit adımdan oluşur ( Şekil 1 ): 1) klonlama vektörü, pUC18 veya pUC196&#39;nın seçilmesi; 2) kaynaştırılacak olan vahşi tipli dizilerin in silico analizinde; 3) kimera montajı ve plasmid bozulması için kırılma bölgelerinin seçilmesi; 4) sınırlama enzimi alanlarını içeren eşanlamlı DNA sekanslarının üretilmesi; 5) vahşi tiplendirilmiş genlerin seçilen plazmite bağımsız olarak klonlanması; 6) PCR ile plasmid parçalanması, ardından kısıtlama enzimi sindirimi; Ve 7) DNA ligasyonu ve bakteri dönüşümü kullanılarak plazmid geri kazanım. Bu teknikle üretilen kimerik genler,Sıralama. PUC18 / 19 vektörleri, küçük boy ( yani 2,686 baz çiftleri), yüksek kopya sayısı, avantajlı sıralama reaksiyon özellikleri ve ticari kullanılabilirlik 7 gibi klonlama ve kimera montajı için teknik avantajlar sunar. Burada, kimera bir araya getirmek ve işlemek için bir Escherichia coli ana ürünü kullanıldı, çünkü bakteri kültürleri ucuzdur ve hızlı büyürler. Bu durumda, füzyon fragmanlarının nihai hedef plasmidlere daha sonra klonlanması gerekecektir ( örn., Bakterilerde pRK415 veya memeli hücrelerinde pCMV gibi ifade vektörleri). CAPRRESI, iki primer sigma faktörü geninin füzyonu için test edildi: E. colirpoD ve Rhizobium etlisigA . Birincil sigma faktörleri, transkripsiyonun başlatılmasından sorumlu RNA polimeraz altbirimleridir ve bunlar dört alan ( yani, σ1, σ2, σ3 ve σ4) 8&#39;den oluşur . Amino asit dizisi lengtRpoD ve sigA tarafından kodlanan proteinlerin sırasıyla sırasıyla 613 ve 685&#39;dir . RpoD ve SigA% 48 kimliğe sahiptir (% 98 kapsama alanı). Bu primer sigma faktörleri, bölgeler σ2 ve σ3 arasında iki tamamlayıcı parçaya ayrıldı. Bu tasarıma göre iki şimerik gen toplandı: chimera 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) ve kimerik 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). DNA füzyon ürünleri sıralamayla doğrulanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Platin Taq DNA polimeraz High Fidelity</td><td>Thermo Fisher</td><td>11304011</td><td>Künt/3'-A çıkıntı uçlu PCR ürünlerinin bir karışımını üretir</td></tr><tr><td>Yüksek saflıkta plazmid izolasyon kiti</td><td>Roche</td><td>11754785001</td><td>Tüm plazmit saflaştırma reaksiyonları için kullanılır</td></tr><tr><td>Yüksek saflıkta PCR ürün saflaştırma kiti</td><td>Roche</td><td>11732676001</td><td>Agaroz jellerden elde edilen tüm PCR saflaştırma reaksiyonları</td></tr> <tr><td>için kullanılırAflII restriksiyon enzimi</td><td>New England Biolabs</td><td>R0520L</td><td>5'-CTTAAG-3' dizisini tanır ve 37 °C'de keser; C</td></tr><tr><td>KpnI-HF kısıtlama enzimi</td><td>New England Biolabs</td><td>R3142L</td><td>5'-GGTACC-3' dizisini tanır ve 37 °C'de keser; C</td></tr><tr><td>SpeI-HF kısıtlama enzimi</td><td>New England Biolabs</td><td>R3133L</td><td>5'-ACTAGT-3' dizisini tanır ve 37 °C'de keser; C</td></tr><tr><td>XbaI kısıtlama enzimi</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145L</td><td>5'-TCTAGA-3' dizisini tanır ve 37 &°C'de keser; C</td></tr><tr><td>Ampisilin sodyum tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td>Antibiyotikler</td></tr><tr><td>Nalidiksik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8878-5G</td><td>Antibiyotikler</td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625-1KG</td><td>Bakteriyel hücre kültürü</td></tr><tr><td>Kazein pepton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70171-500G</td><td>Bakteriyel hücre kültürü</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td>Sodyum klorür</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05040-1KG</td><td>Bakteriyel hücre kültürü</td></tr><tr><td>XbaI kısıtlama enzimi</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0684</td><td>Hızlı sindirim XbaI enzim</td></tr><tr><td>KpnI kısıtlama enzimi</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0524</td><td>Hızlı sindirim KpnI enzyme</td></tr><tr><td>Hızlı Ligasyon Kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>Hızlı DNA ligasyon kiti</td></tr><tr><td>AflII kısıtlama enzimi</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0834</td><td>Hızlı sindirim AflII enzyme</td></tr><tr><td>SpeI kısıtlama enzimi</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD1253</td><td>Hızlı sindirim SpeI enzyme</td></tr></tbody></table>

caprresi: plazmid geri kazanım ve kısıtlama enzim yerinin eklenmesi ile chimera meclisi

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

Burada, plazmid geri kazanım ve kısıtlama enzim bölgesi ekleme (CAPRRESI) ile kinera montajını sunuyoruz. CAPRRESI orijinal plazmid geri kazanım yönteminin pek çok avantajından yararlanır ve DNA ligasyon reaksiyonlarını kolaylaştırmak için kısıtlama enzimi sindirimini sağlar (kimera montajı için gerekli). Bu protokol için, kullanıcılar aynı plazmite vahşi tip genleri klonlamışlardır (pUC18 veya pUC19). Kimeraların birleştirilmesi gereken amino asit dizisi bölgelerinin in silico seçiminden sonra, kullanıcılar şifreleyen tüm eşanlamlı DNA dizilerini elde eder. Geçici Perl betiği, kullanıcıların tüm eş anlamlı DNA dizilerini belirlemelerini sağlar. Bu adımdan sonra, başka bir Perl betiği tüm eş anlamlı DNA dizileri üzerinde kısıtlama enzim siteleri arar. Bu siliko analiz de pUC18 / 19 plazmidlerinde bulunan ampisilin direnç genini ( ampR ) kullanarak gerçekleştirilir. Kullanıcılar, PCR ile wildfit ve ampR genlerini parçalamak için eşanlamlı bölgeler içerisindeki oligonükleotidleri tasarlarlar . Obt&#39;dan sonraTamamlayıcı DNA fragmanlarını arındırma ve saflaştırma, kısıtlama enzimi sindirimi gerçekleştirilir. Şimera montajı, uygun tamamlayıcı DNA fragmanlarının bağlanmasıyla gerçekleştirilir. Küçük ebat (2.686 baz çifti), yüksek kopya sayısı, avantajlı sıralama reaksiyon özellikleri ve ticari kullanılabilirlik gibi teknik avantajlar sundukları için CAPRRESI için pUC18 / 19 vektörleri seçilmiştir. Kimera montajı için restriksiyon enzimlerinin kullanımı, künt uçlu ürünler üreten DNA polimerazlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. CAPRRESI, protein kodlayan genlerin eritilmesi için hızlı ve düşük maliyetli bir yöntemdir.

Şekil 1 , CAPRRESI&#39;yi tasvir etmektedir. Bu yöntemi kullanarak, iki kimerik gen, iki bakteriyel primer sigma faktörünün alanlarını değiştirerek ( yani, E. coli RpoD ve R. etli SigA) toplandı. RpoD ve sigA genlerinin DNA dizileri sırasıyla GenBank genom dosyalarından Artemis Genome Browser 14 kullanılarak NC_000913 ve NC_007761&#39;den elde edildi. PUC18 vektörünün DNA sekansı, NCBI sunucusu...

Burada, sinomi DNA sekanslarına restriksiyon enzim sahalarının yerleştirilmesi ve fonksiyonel plazmid geri kazanımına dayanan bir protokol olan plazmit geri kazanım ve restriksiyon enzim yeri ekleme (CAPRRESI) ile kinera montajını sunuyoruz. Bu protokol protein kodlayan genlerin eritilmesi için hızlı ve düşük maliyetli bir yöntemdir.

CAPRRESI: Plazmid Geri Kazanım ve Kısıtlama Enzim Yerinin Eklenmesi ile Chimera Meclisi

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

Bu video, sinonim DNA'ya spesifik restriksiyon enzimi bölgeleri yerleştirilip ardından DNA dizilerinin kesilip takas edilmesi yoluyla iki kimerik genin oluşturulduğu, Plazmit Geri Kazanımı ve Restriksiyon Enzimi Bölgesi Yerleştirilmesi ile Kimera Montajı veya CAPRRESI olarak adlandırılan bir prosedürü göstermektedir. CAPRRESI yönteminde, ilgilenilen vahşi tip genler önce aynı vektörün çoklu klonlama bölgelerine yerleştirilir. Ardından, her gen için aynı amino asit dizisine sahip kırılma bölgeleri ve Ampisilin direnç geni için kırılma bölgesi seçilir.Her bir kırılma bölgesi için restriksiyon bölgeleri içeren sinonim dizileri belirlemek amacıyla Perl betikleri kullanılır. Özel olarak tasarlanmış oligolar kullanılarak, istenen restriksiyon enzim bölgelerini içeren sinonim DNA'ya sahip dört tamamlayıcı parça üretmek için PCR uygulanır. Elde edilen PCR ürünleri saflaştırılır, digeste edilir ve ardından kimera bir dizi oluşturmak için liglanır.Bu tekniğin temel avantajı, gen füzyonlarını kolaylaştırmasıdır. Bu yöntem, protein enzimimizin işlevleri nelerdir gibi moleküler biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre, ilgilenilen genler vektörlerin çok

caprresi-chimera-assembly-plasmid-recovery-restriction-enzyme-site

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Önceden hazırlanmış alıcı suşlar olarak adlandırılan iniş takımı suşları, içine faiz yabancı DNA entegre hızlı ve verimli bir yöntem tarif edilmiştir. Metodu ΦC31 integraz konjugasyonu ve ifadesi ile, belirli bir lamine suşun iniş pedi odağına içine bir DNA kasetinin site-specific entegrasyon sağlar.

Siteye özgü Bakteriyel Kromozom Mühendislik: ΦC31 integraz Aracılı Kaset Borsası (IMCE)

Paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi için kullanılan bir...

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

Gen hedefleme metodolojileri, nakavt, knock-in ve etiketli alellere sahip transgenik fareler oluşturmak için kullanılabilir.  Burada, E. coli'de, özel gen hedefleme vektörlerini hızlı bir şekilde oluşturmak için kullanılabilecek 'alt klonlama artı ekleme' olarak adlandırdığımız gelişmiş bir yeniden birleştirme yöntemini açıklıyoruz.

Alt klonlama Artı Ekleme (SPI) - Gen Hedefleme Vektörler Rapid İnşaat için Yeni Bir Yöntem Recombineering

Özel plazmitlerin sentezi emek ve zaman alıcıdır. Bu protokol, özel DNA klonlama prosedürünün işini ve süresini azaltmak için Gibson montaj klonlamasının kullanımını açıklar. Açıklanan protokol ayrıca, geleneksel kes ve yapıştır DNA klonlamasına benzer maliyetle memeli ekspresyonu için güvenilir etiketli protein yapıları üretir.

Plazmid vektörler oluşturulması Gibson tertibatı kullanılarak insan uzama faktör-1α bir promotörün regülasyonu altında FLAG-etiketli Proteinlerinin İfade

Siyanobakterilere çoklu genomik değişikliklerin sokulması, endüstriyel ve temel araştırma amaçları için suşların geliştirilmesinde önemli bir araçtır. Model siyanobakteri türü Synechocystis sp. PCC6803'da işaretlenmemiş mutantlar ve Synechococcus sp. PCC7002'da işaretli mutantlar üretmek için bir sistem tarif ediyoruz.

Model siyanobakteri Türlerinde İşaretli ve belirtisiz Mutants Üretimi

Yapısal olarak ilişkili proteinler sık sık farklı Biyolojik işlevleri uygulamak. Eşdeğer chimeric proteinleri oluşturmak için bu proteinler bölgelerinde alışverişi için onların fonksiyonel sapma sorumludur kritik protein bölgeleri tanımlamak için yenilikçi bir yaklaşım oluşturmaktadır.

Fonksiyonel Protein bölgeleri Chimeric Protein inşaat aracılığıyla tanımlaması

Burada tanımlanan floksed kaset allelic değişim mutagenezi, FLAEM kullanarak Chlamydia trachomatis hedefli, markerless gen delemesi için bir yöntemdir.

Klamidya trachomatis Floxed Kaset Allelic Exchange Mutagene tarafından Markerless Gen Deletion

Bu protokolün amacı, Golden Gate klonlamaya dayalı modüler klonlama sistemini kullanarak çok genli yapıların montajı için ayrıntılı, adım adım bir kılavuz sağlamaktır. Ayrıca, deneyimlerimize göre en iyi montajı sağlamak için kritik adımlar hakkında önerilerde bulunmaktadır.

Modüler Altın Kapı Klonlama Kullanılarak Çok Genli Yapıların Hızlı Montajı

CRISPR-Cas sistemleri ve anti-CRISPR proteinleri, Saccharomyces cerevisiae'deki Boole kapılarının şemasına entegre edildi. Yeni küçük mantık devreleri iyi performans gösterdi ve hem dCas9 / dCas12a tabanlı transkripsiyon faktörlerinin hem de anti-CRISPR proteinlerinin özelliklerinin anlaşılmasını derinleştirdi.

CRISPR-Cas Sistemlerine ve Anti-CRISPR Proteinlerine Dayalı Gen Dijital Devreleri

AviTag-spesifik Konum Kısıtlı Aydınlatma Takviyeli Biyotinilasyon (ALIBi), ribozom popülasyonlarının etiketlenmesi ve afinite-affinite-arındırıcı olarak arındırılması amacıyla geliştirilen, sonraki dizileme ve proteomik analiz için geliştirilen yeni bir optogenetik olarak aktive edilmiş yöntemdir.

Rekombinant Peptit Etiketine Özgü Konum Kısıtlı Aydınlatma Güçlendirilmiş Biyotinilasyona Dayalı Subhücresel Ribozom Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

İn vivo montaj, DNA parçalarını homolog rekombinasyon yoluyla birleştirmek için bakterilerdeki içsel DNA onarım enzimlerine dayanan, ligasyondan bağımsız bir klonlama yöntemidir. Bu protokol hem zaman hem de maliyet etkindir, çünkü az sayıda reaktif gereklidir ve klonlama verimliliği %99'a kadar çıkabilir.

Yüksek Verimli Plazmid Yapımı için In Vivo Montaj Kullanımı

Öğrenin CAPRRESI yöntemiyle plazmid geri kazanım ve kısıtlama enzim yerinin eklenmesi kullanarak kimera gen montajı. Bu hızlı ve düşük maliyetli teknik, protein kodlayan genleri birleştirmek için moleküler biyolojide gen işlevi araştırmalarına yardımcı olur.

CAPRRESI: Plazmid Geri Kazanım ve Kısıtlama Enzim Yerinin Eklenmesi ile Chimera Meclisi

Daha fazla video keşfet