Yeniden Birleştirme ve Gen Hedefleme
Modern biyolojide en yaygın kullanılan araçlardan biri, DNA parçaları arasında bir araya getirilmelerine izin veren uyumlu uçlar oluşturan kısıtlama e…
Homolog rekombinasyon veya yeniden birleştirme ile klonlama, araştırmacıların yüksek verimli genetik mühendisliği yapma yeteneklerini büyük ölçüde geliştirmiştir. Klasik moleküler klonlama, "rekombinasyon" için uyumlu uçlar oluşturmak için aynı kısıtlama enzimlerine sahip vektörlerin ve eklerin sindirilmesini gerektirir, ancak özellikle bir bölgeyi genomik DNA'nın bir uzantısı gibi daha uzun bir diziden izole etmeye çalışırken, her zaman ilgilenilen bölgenin etrafını benzersiz bir şekilde kesecek kısıtlama enzimleri yoktur, ve bölge içinde veya dizinin başka bir yerinde değil. Bu kısıtlama bölgelerine olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, yeniden birleştirme, genetik mühendisliği yapıları yapmak için çok daha verimli ve uygun maliyetli bir yol sağlar.
Bu videoda, genetik rekombinasyonun ilkelerini tanıtacağız, bir gen hedefleme vektörünün yeniden birleştirilmesi için genel bir protokol sağlayacağız ve bu teknolojilerin çeşitli uygulamalarını tartışacağız.
Öncelikle rekombinasyonun ne olduğunu ve nasıl uygulanabileceğini tartışalım.
Genetik rekombinasyon, DNA molekülleri arasında bilgi alışverişini gerektirir. "Homolog rekombinasyonda", benzer veya aynı DNA dizilerinin nispeten büyük uzantıları değiş tokuş edilir. Hücreler bu işlemi çift iplikçik kopmalarını onarmak için kullanır ve eşeyli üreyen ökaryotlar da genetik çeşitliliği artırmak için mayoz bölünme sırasında bunu homolog kromozomlar arasında gerçekleştirir.
Homolog rekombinasyon, hücrelerdeki spesifik endojen lokusların modifikasyonu da dahil olmak üzere "gen hedefleme" olarak adlandırılan bir dizi deneysel amaç için kullanılmıştır. Aynı zamanda, bir organizmanın genomunu hedeflemek için büyük DNA uzantılarında değişiklikler yapmak için özellikle yararlı olan "yeniden birleştirme" adı verilen bir süreç olan genetik yapıların mühendisliğine de uygulanır. Bunu yapmak için, araştırmacılar "genomik kütüphanelerden" veya her biri uzun genomik DNA parçaları içeren vektör kümelerinden yararlanabilirler. Genellikle bakteri klonlarında yayılan farklı kapasitelere sahip çeşitli kütüphane türleri oluşturulmuştur ve ticari veya kar amacı gütmeyen depolardan sipariş edilebilir. En yaygın kullanılan genomik kütüphane türlerinden biri, 150-350 kilobaz arasında bir ek boyutu taşıyabilen bakteriyel yapay kromozom veya BAC olarak adlandırılır.
Bir yapıyı yeniden birleştirmek için, bilim adamlarının homolog rekombinasyonun meydana geldiği bir organizmaya ihtiyaçları vardır. Saccharomyces cerevisiae mayası doğal olarak "rekombinasyon yetkindir" ve bir vektör ile kesici uç arasında homolog rekombinasyonu kolayca gerçekleştirebilir. Yaygın olarak uygulanan başka bir sistem, E. coli bakterisinde yeniden oluşturulan bakteriyofaj lambdadan elde edilen "Kırmızı" proteinleri kullanır. Vektörler, daha önce kurulmuş Kırmızı eksprese eden bakteri suşlarında yeniden birleştirilebilir veya Kırmızı sistem bileşenlerini kodlayan bir plazmid, yeniden birleştiren substratlarla bakterilere birlikte dönüştürülebilir.
Şimdi, yeniden birleştirerek bir gen hedefleme vektörü oluşturmak için bir protokolü inceleyelim.
Bu protokolün amacı, belirli bir gende hedeflenen değişikliklerle genetik olarak değiştirilmiş bir fare oluşturmaktır. Kısaca, ilgilenilen gende istenen modifikasyonlar bir BAC'de yapılır; Modifiye edilmiş dizi, bir hedefleme vektörüne "alınır" ve bu vektör, gen hedefleme için embriyonik kök hücrelere dönüştürülür. Kök hücreler daha sonra genetiği değiştirilmiş hayvanı üretmek için kullanılabilir. Bu son prosedürle ilgili talimatlar için lütfen JoVE Bilim Eğitimi videosuna bakın "Model Organizmaların Genetik Mühendisliği"
Başlamak için, ilgilenilen genomik diziyi içeren bir BAC klonu tanımlanır ve sipariş edilir. Daha sonra, 30-50 baz çifti homolog bölgelerini içeren homoloji kolları veya oligonükleotidler tasarlanır. Bu oligonükleotidler, ilgilenilen geni değiştirmek için kullanılan DNA "kasetlerini" oluşturmak için PCR reaksiyonlarında primer olarak kullanılır. Bu kasetler tipik olarak, örneğin, halka açık birçok plazmitten kolayca amplifiye edilebilen, seçim belirteçleri olarak işlev görebilen antibiyotik direnç genleri içerir. BAC bakteri klonu daha sonra, örneğin elektroporasyon yoluyla, Kırmızı sistem bileşenlerini kodlayan bir plazmit ile dönüştürülür ve ardından homoloji kolu içeren kasetler gelir. Bakteriler daha sonra rekombinasyonu indüklemek için uygun sıcaklıkta inkübe edilir.
Modifiye edilmiş diziyi BAC'den kurtarmak için, bir "geri alma" vektörü, modifikasyon bölgesi etrafında birkaç kilobaz kaplayan homoloji kolları içeren primerler kullanılarak doğrusallaştırılır ve amplifiye edilir. Bu vektör omurgası, BAC bakteri klonuna dönüştürülür ve yeniden birleştirme tekrar indüklenir. Vektör, BAC'den uygun diziyi "alarak" "boşluk onarılacaktır". Bu, değiştirilmiş ilgilenilen diziyi içeren bir gen hedefleme vektörünün yanı sıra, değiştirilmiş diziyi çevreleyen genomik DNA'ya homolog olan bölgeleri içerir. Bu vektör daha sonra saflaştırılabilir, doğrusallaştırılabilir ve endojen homolog rekombinasyon mekanizmasının modifiye edilmiş diziyi karşılık gelen lokusa hedefleyeceği ve böylece konakçı genomunu değiştireceği embriyonik kök hücrelere sokulabilir.
Şimdi rekombinasyon tabanlı mühendislik tekniklerinin bazı uygulamalarına bakalım.
İlk olarak, araştırmacılar, örneğin protein komplekslerini incelemek için bakteri genomunu hızlı ve kolay bir şekilde tasarlamak için yeniden birleştirmeyi kullanabilirler. Burada, sıralı bir peptit afinite etiketini kodlayan bir kasetin yanı sıra bir kanamisin direnci seçim markörü, ilgilenilen genin 3 ¢ ucuna yeniden birleştirilmek üzere tasarlanmıştır. Bu vektör daha sonra Kırmızı "rekombinasyon yetkin" E. coli içine sokuldu ve başarılı rekombinantlar seçici ortam kullanılarak izole edildi. Etiketli protein kompleksleri, etiketlere güçlü bir şekilde bağlanan proteinler kullanılarak biyokimyasal olarak saflaştırıldı ve ilgilenilen proteinin etkileşim ortaklarını belirlemek için kütle spektrometresi ile analiz edildi.
Yeniden birleştirme ve gen hedefleme, toksoplazmoz hastalığına neden olan zorunlu hücre içi parazit Toxoplasma gondii gibi parazitik organizmaların genomunu değiştirmek için de kullanılabilir. Bu çalışmada, bir hedefleme vektörü, ilgilenilen geni çevreleyen genomik dizilerin bir seçim markörü etrafına yerleştirildiği mayada yeniden birleştirildi. Vektör daha sonra doğrusallaştırıldı ve parazitlere elektropore edildi. Parazitin homolog rekombinasyon mekanizmasının genomik diziyi tasarlanmış diziyle değiştirdiği ve böylece ilgilenilen genin silindiği başarılı rekombinantları izole etmek için seçici ortamda sınırlayıcı seyreltme kaplaması kullanıldı. Hedeflenen bölgenin PCR'si pozitif rekombinasyon olaylarını doğruladı.
Son olarak, boşluk onarımı ve kaset yerleştirmenin aynı anda gerçekleştiği ve yeniden birleştirme işlemini daha basit ve daha esnek hale getiren, alt klonlama artı yerleştirme veya SPI olarak bilinen bir prosedür tasarlanmıştır. Bu işlemin başarısı için kritik olan, rekombinasyon verimliliğini artırmak için 180 bp'ye kadar geleneksel yeniden birleştirmeden daha uzun olan çoklu homoloji kollarının uygun tasarımıdır. Homoloji kolları PCR ile alt klonlama plazmidine ve yerleştirme kasetlerine dahil edildikten sonra, birlikte Kırmızı eksprese eden bir BAC klonuna dönüştürüldü ve yeniden birleştirme indüklendi. Başarılı bir şekilde yeniden birleştirilen yapılar daha sonra PCR veya kısıtlama özeti analizi ile tanımlandı.
Az önce JoVE'nin yeniden birleştirme ile ilgili videosunu izlediniz. Bu videoda, rekombinasyonun ilkelerini ve bunların genetik mühendisliğinde nasıl kullanılabileceğini, yeniden birleştirme projesi için bir protokolü ve son olarak bu tekniklerin çeşitli uygulamalarını tartıştık. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Homolog rekombinasyon veya yeniden birleştirme ile klonlama, araştırmacıların yüksek verimli genetik mühendisliği yapma yeteneklerini büyük ölçüde geliştirmiştir. Klasik moleküler klonlama, "rekombinasyon" için uyumlu uçlar oluşturmak için aynı kısıtlama enzimlerine sahip vektörlerin ve eklerin sindirilmesini gerektirir, ancak özellikle bir bölgeyi genomik DNA'nın bir uzantısı gibi daha uzun bir diziden izole etmeye çalışırken, her zaman ilgilenilen bölgenin etrafını benzersiz bir şekilde kesecek kısıtlama enzimleri yoktur, ve bölge içinde veya dizinin başka bir yerinde değil. Bu kısıtlama bölgelerine olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, yeniden birleştirme, genetik mühendisliği yapıları yapmak için çok daha verimli ve uygun maliyetli bir yol sağlar.
Bu videoda, genetik rekombinasyonun ilkelerini tanıtacağız, bir gen hedefleme vektörünün yeniden birleştirilmesi için genel bir protokol sağlayacağız ve bu teknolojilerin çeşitli uygulamalarını tartışacağız.
Öncelikle rekombinasyonun ne olduğunu ve nasıl uygulanabileceğini tartışalım.
Genetik rekombinasyon, DNA molekülleri arasında bilgi alışverişini gerektirir. "Homolog rekombinasyonda", benzer veya aynı DNA dizilerinin nispeten büyük uzantıları değiş tokuş edilir. Hücreler bu işlemi çift iplikçik kopmalarını onarmak için kullanır ve eşeyli üreyen ökaryotlar da genetik çeşitliliği artırmak için mayoz bölünme sırasında bunu homolog kromozomlar arasında gerçekleştirir.
Homolog rekombinasyon, hücrelerdeki spesifik endojen lokusların modifikasyonu da dahil olmak üzere "gen hedefleme" olarak adlandırılan bir dizi deneysel amaç için kullanılmıştır. Aynı zamanda, bir organizmanın genomunu hedeflemek için büyük DNA uzantılarında değişiklikler yapmak için özellikle yararlı olan "yeniden birleştirme" adı verilen bir süreç olan genetik yapıların mühendisliğine de uygulanır. Bunu yapmak için, araştırmacılar "genomik kütüphanelerden" veya her biri uzun genomik DNA parçaları içeren vektör kümelerinden yararlanabilirler. Genellikle bakteri klonlarında yayılan farklı kapasitelere sahip çeşitli kütüphane türleri oluşturulmuştur ve ticari veya kar amacı gütmeyen depolardan sipariş edilebilir. En yaygın kullanılan genomik kütüphane türlerinden biri, 150-350 kilobaz arasında bir ek boyutu taşıyabilen bakteriyel yapay kromozom veya BAC olarak adlandırılır.
Bir yapıyı yeniden birleştirmek için, bilim adamlarının homolog rekombinasyonun meydana geldiği bir organizmaya ihtiyaçları vardır. Saccharomyces cerevisiae mayası doğal olarak "rekombinasyon yetkindir" ve bir vektör ile kesici uç arasında homolog rekombinasyonu kolayca gerçekleştirebilir. Yaygın olarak uygulanan başka bir sistem, E. coli bakterisinde yeniden oluşturulan bakteriyofaj lambdadan elde edilen "Kırmızı" proteinleri kullanır. Vektörler, daha önce kurulmuş Kırmızı eksprese eden bakteri suşlarında yeniden birleştirilebilir veya Kırmızı sistem bileşenlerini kodlayan bir plazmid, yeniden birleştiren substratlarla bakterilere birlikte dönüştürülebilir.
Şimdi, yeniden birleştirerek bir gen hedefleme vektörü oluşturmak için bir protokolü inceleyelim.
Bu protokolün amacı, belirli bir gende hedeflenen değişikliklerle genetik olarak değiştirilmiş bir fare oluşturmaktır. Kısaca, ilgilenilen gende istenen modifikasyonlar bir BAC'de yapılır; Modifiye edilmiş dizi, bir hedefleme vektörüne "alınır" ve bu vektör, gen hedefleme için embriyonik kök hücrelere dönüştürülür. Kök hücreler daha sonra genetiği değiştirilmiş hayvanı üretmek için kullanılabilir. Bu son prosedürle ilgili talimatlar için lütfen JoVE Bilim Eğitimi videosuna bakın "Model Organizmaların Genetik Mühendisliği"
Başlamak için, ilgilenilen genomik diziyi içeren bir BAC klonu tanımlanır ve sipariş edilir. Daha sonra, 30-50 baz çifti homolog bölgelerini içeren homoloji kolları veya oligonükleotidler tasarlanır. Bu oligonükleotidler, ilgilenilen geni değiştirmek için kullanılan DNA "kasetlerini" oluşturmak için PCR reaksiyonlarında primer olarak kullanılır. Bu kasetler tipik olarak, örneğin, halka açık birçok plazmitten kolayca amplifiye edilebilen, seçim belirteçleri olarak işlev görebilen antibiyotik direnç genleri içerir. BAC bakteri klonu daha sonra, örneğin elektroporasyon yoluyla, Kırmızı sistem bileşenlerini kodlayan bir plazmit ile dönüştürülür ve ardından homoloji kolu içeren kasetler gelir. Bakteriler daha sonra rekombinasyonu indüklemek için uygun sıcaklıkta inkübe edilir.
Modifiye edilmiş diziyi BAC'den kurtarmak için, bir "geri alma" vektörü, modifikasyon bölgesi etrafında birkaç kilobaz kaplayan homoloji kolları içeren primerler kullanılarak doğrusallaştırılır ve amplifiye edilir. Bu vektör omurgası, BAC bakteri klonuna dönüştürülür ve yeniden birleştirme tekrar indüklenir. Vektör, BAC'den uygun diziyi "alarak" "boşluk onarılacaktır". Bu, değiştirilmiş ilgilenilen diziyi içeren bir gen hedefleme vektörünün yanı sıra, değiştirilmiş diziyi çevreleyen genomik DNA'ya homolog olan bölgeleri içerir. Bu vektör daha sonra saflaştırılabilir, doğrusallaştırılabilir ve endojen homolog rekombinasyon mekanizmasının modifiye edilmiş diziyi karşılık gelen lokusa hedefleyeceği ve böylece konakçı genomunu değiştireceği embriyonik kök hücrelere sokulabilir.
Şimdi rekombinasyon tabanlı mühendislik tekniklerinin bazı uygulamalarına bakalım.
İlk olarak, araştırmacılar, örneğin protein komplekslerini incelemek için bakteri genomunu hızlı ve kolay bir şekilde tasarlamak için yeniden birleştirmeyi kullanabilirler. Burada, sıralı bir peptit afinite etiketini kodlayan bir kasetin yanı sıra bir kanamisin direnci seçim markörü, ilgilenilen genin 3 ¢ ucuna yeniden birleştirilmek üzere tasarlanmıştır. Bu vektör daha sonra Kırmızı "rekombinasyon yetkin" E. coli içine sokuldu ve başarılı rekombinantlar seçici ortam kullanılarak izole edildi. Etiketli protein kompleksleri, etiketlere güçlü bir şekilde bağlanan proteinler kullanılarak biyokimyasal olarak saflaştırıldı ve ilgilenilen proteinin etkileşim ortaklarını belirlemek için kütle spektrometresi ile analiz edildi.
Yeniden birleştirme ve gen hedefleme, toksoplazmoz hastalığına neden olan zorunlu hücre içi parazit Toxoplasma gondii gibi parazitik organizmaların genomunu değiştirmek için de kullanılabilir. Bu çalışmada, bir hedefleme vektörü, ilgilenilen geni çevreleyen genomik dizilerin bir seçim markörü etrafına yerleştirildiği mayada yeniden birleştirildi. Vektör daha sonra doğrusallaştırıldı ve parazitlere elektropore edildi. Parazitin homolog rekombinasyon mekanizmasının genomik diziyi tasarlanmış diziyle değiştirdiği ve böylece ilgilenilen genin silindiği başarılı rekombinantları izole etmek için seçici ortamda sınırlayıcı seyreltme kaplaması kullanıldı. Hedeflenen bölgenin PCR'si pozitif rekombinasyon olaylarını doğruladı.
Son olarak, boşluk onarımı ve kaset yerleştirmenin aynı anda gerçekleştiği ve yeniden birleştirme işlemini daha basit ve daha esnek hale getiren, alt klonlama artı yerleştirme veya SPI olarak bilinen bir prosedür tasarlanmıştır. Bu işlemin başarısı için kritik olan, rekombinasyon verimliliğini artırmak için 180 bp'ye kadar geleneksel yeniden birleştirmeden daha uzun olan çoklu homoloji kollarının uygun tasarımıdır. Homoloji kolları PCR ile alt klonlama plazmidine ve yerleştirme kasetlerine dahil edildikten sonra, birlikte Kırmızı eksprese eden bir BAC klonuna dönüştürüldü ve yeniden birleştirme indüklendi. Başarılı bir şekilde yeniden birleştirilen yapılar daha sonra PCR veya kısıtlama özeti analizi ile tanımlandı.
Az önce JoVE'nin yeniden birleştirme ile ilgili videosunu izlediniz. Bu videoda, rekombinasyonun ilkelerini ve bunların genetik mühendisliğinde nasıl kullanılabileceğini, yeniden birleştirme projesi için bir protokolü ve son olarak bu tekniklerin çeşitli uygulamalarını tartıştık. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is homologous recombination and how does it differ from classical molecular cloning?
Homologous recombination is the exchange of DNA between molecules based on stretches of similar or identical sequences. Unlike classical molecular cloning, which requires specific restriction enzyme sites to generate compatible ends, homologous recombination avoids this limitation. This makes recombineering a more efficient and cost-effective approach for engineering and recombinant dna technology, especially when restriction sites are unavailable around the region of interest.
Q2: What are the key components needed to perform a recombineering experiment?
Recombineering requires a recombination-competent organism, such as yeast Saccharomyces cerevisiae or E. coli expressing Red proteins from bacteriophage lambda. Researchers also need genomic libraries containing long DNA fragments, with bacterial artificial chromosomes (BACs) being commonly used because they carry insert sizes between 150-350 kilobases. These components enable efficient homologous recombination between vectors and inserts.
Q3: How are homology arms designed and used in the recombineering protocol?
Homology arms are oligonucleotides containing 30-50 basepair homologous regions designed to flank the target sequence. These serve as primers in PCR reactions to generate DNA cassettes that modify the gene of interest. In advanced procedures like subcloning plus insertion (SPI), homology arms can be up to 180 bp long to increase recombination efficiency, making the process more flexible and reliable.
Q4: What is the purpose of a retrieval vector in creating a gene-targeting construct?
A retrieval vector is linearized and amplified using primers containing homology arms that span several kilobases around the modification site. When transformed into the BAC clone, the vector undergoes gap-repair by retrieving the modified sequence from the BAC. This produces a gene-targeting vector containing the modified sequence plus regions homologous to genomic DNA, which can then be introduced into embryonic stem cells for targeted genome modification.
Q5: How can recombineering be applied to study protein interactions in bacteria?
Researchers design cassettes encoding sequential peptide affinity tags and selection markers like kanamycin resistance, then recombineer them into the 3' end of target genes in Red-competent E. coli. Successful recombinants are isolated using selective media. The tagged protein complexes are then biochemically purified using proteins that bind to the tags and analyzed by mass spectrometry to identify interaction partners.
Q6: What advantages does recombineering offer for modifying parasite genomes?
Recombineering enables precise genome modification in parasitic organisms like Toxoplasma gondii. A targeting vector with genomic sequences flanking the gene of interest is recombineered in yeast, then linearized and electroporated into parasites. The parasite's homologous recombination machinery replaces the genomic sequence with the engineered version, effectively deleting or modifying target genes. PCR confirms successful recombination events.
Q7: Why is proper homology arm design critical for the success of subcloning plus insertion (SPI)?
In SPI, gap repair and cassette insertion occur simultaneously, requiring precise homology arm design to ensure efficient recombination. Homology arms in SPI are longer, up to 180 bp compared to conventional recombineering, increasing recombination efficiency and success rates. After PCR incorporation into subcloning plasmids and insertion cassettes, they are transformed into Red-expressing BAC clones and verified by detection and quantification nucleic acids or restriction digest analysis.