WinCF Modeli - Bir Mukus bir Ucuz ve Çekilebilir Microcosm Akciğer İnfeksiyonları Mikrobiyoloji Eğitim için bronşiole Takıldı

Bu prosedürün genel amacı, akciğer ortamını taklit etmek ve patojenleri, hastalık oluşturdukları ortama daha benzer bir şekilde büyütmektir. Bu yöntem, kistik fibrozisli bir akciğerde çeşitli bakteriyel patojenlerin nasıl etkileşime girdiği gibi, hava yolu mikrobiyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, deneysel koşulların kolayca manipüle edilmesine olanak tanımasıdır.

Mikrobiyal yanıtları, gerçek bir akciğer bronşunda gerçekleşeceği şekle benzer şekilde gözlemlemek için. Prosedürü, laboratuvarımızdan Will Comstock gerçekleştirecektir. Yapay balgam ortamı hazırlamak için 16 mililitre önceden hazırlanmış mukus stok çözeltisini, iki mililitre potasyum klorür stok çözeltisini, iki mililitre sodyum klorür stok çözeltisini, 200 mikrolitre yumurta sarısı emülsiyonunu, 5,6 mililitre DNA stok çözeltisini, 120 mikrolitre ferritin stok çözeltisini, 5,78 mililitre esansiyel amino asit çözeltisini, 5,78 mililitre esansiyel olmayan amino asit çözeltisini ve 2,44 mililitre steril suyu birleştirin.

Steril yapay balgam ortamının dikkatli bir şekilde hazırlanması son derece önemlidir. Çünkü herhangi bir kontaminasyon, ilerleyen aşamalarda inkübe edilen kapiler tüplerdeki bakteriyel aktiviteyi değiştirebilir. Karıştırmak için nazikçe çalkaladıktan sonra, ortamdan beş mililitreyi sekiz adet steril 15 mililitrelik santrifüj tüpüne pipetleyin.

Besiyeri, istenen kimyasal koşulları sağlamak için artık modifiye edilebilir. Örneğin, burada gösterilen besiyerlerinin pH değerleri değiştirilmiş ve farklı asitliklerini yansıtmak için boyalar eklenmiştir. Ardından, steril bir biyolojik güvenlik kabini altında, sekiz adet steril 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpünün her birine 900 mikrolitre besiyeri ekleyin.

Daha önce alınmış balgam örneklerini, pürüzsüz bir kıvam elde edinceye kadar üç mililitrelik bir şırınga ile tekrar tekrar çekip püskürterek homojenize edin. Homojenize edilen balgamdan her bir mikrosantrifüj tüpüne 100 microliter ekleyin. Ardından, yeterince karışması için tüpleri vorteksleyin.

Sekiz adet daha steril 15 mililitre santrifüj tüpünü, önceden hazırlanmış ortam mikro santrifüj tüplerine göre etiketleyin. Bunlar inkübasyon tüpleri olacaktır. Bir kağıt havluyu sterilize etmek için %70 etanol çözeltisi kullanın ve kurumasını bekleyin.

Havlu, her biri yaklaşık dört kare inç büyüklüğünde parçalara bölün. Ardından, her bir inkübasyon tüpünün tabanına birer parça buruşturarak yerleştirin. Her inkübasyon tüpünün tabanında bir kağıt yığını varken, tüp içinde nemli bir ortam oluşturmak için her bir yığını 1 milliliter steril su kullanarak hafifçe nemlendirin.

Her bir besiyeri tüpü için, tüpün bir ucunu besiyerinde tutup yatay olarak eğerek üç adet cam kılcal tüpü besiyeri ile doldurun. Kılcal etkiyle besiyerinin tüpün içine girmesini sağlayın. Doldurma işlemini, eldivenli bir parmağınızı tüpün açık ucuna hafifçe bastırarak durdurun ve ardından tüpün diğer ucunu bir kılcal macun sızdırmazlık bloğuna bastırarak mühürleyin.

Üçlü kapiler tüp setlerinin her birini, macunla mühürlenmiş tarafı aşağı gelecek şekilde 15 mililitrelik inkübasyon tüplerine yerleştirin. Ardından tüplerin kapaklarını kapatın ve etiketlendiğinden emin olun. Bu üç kapiler tüp, her bir kontrol koşulunun replikasyonu içindir.

Tüm inkübasyon tüpleri kendilerine ayrılan kapiler tüplerle doldurulduğunda, rafları 37 °C'ye yerleştirin; tüpler, oluşan gazın açık uçtan kaçmaması için yatay olarak inkübe edilmelidir. Tüpleri 48 saat boyunca inkübe edin.

Tüpleri yatay tutmaya dikkat ederek inkübatörden çıkarın. Kapiler tüpleri, her üçlü seti diğer setlerden ayrı tutarak inkübasyon tüplerinden dikkatlice çıkarın. Kapiler tüpleri, tüplerin içeriği görünür olacak ve alttan aydınlatılacak şekilde yan yana dizerek bir ışıklı kutu üzerine yerleştirin.

Farklı kimyasal koşulları ayırmak için her üç tüpte bir boşluk bırakın. Ardından, tüm tüplerin görüş alanında görünmesi ve ışık kutusundan gelen ışığın, tüp boyalarının rengi için yeterli kontrast ve görselleştirme sağlaması amacıyla kamerayı doğrudan tüplerin üzerine odaklayın. Tüplerin içeriğini sonraki analizler için çıkarmak üzere, ışık kutusundan her seferinde üçlü kapiler setini kaldırın. Mührü kırmak için kapiler tüpün tıkalı ucuna 25 gauge 0.5 inç küt uçlu bir iğne yerleştirin.

Ardından, besiyerinin kılcal tüpün üst kısmından 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne damlamasını sağlamak için kılcal tüpü ters çevirin. Eğer besiyeri damlamıyorsa, 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, pipet ucunu kılcal tüpün sonuna yerleştirip pipet pistonuna bastırarak besiyerini tüpten dışarı itin. Burada gösterildiği gibi, besiyerine balgam örneği eklenmediğinde, 48 saatlik inkübasyon sonrası pH spektrumu boyunca gözlemlenen tek değişiklik, hafif buharlaşmadan kaynaklanan besiyeri hacmindeki küçük bir azalma olmuştur.

İnoküle edilen kılcal tüplerde hacim değişiklikleri, gaz kabarcıklarının oluşumu, renk değişimleri ve opak çökeltilerin meydana geldiği gözlemlenmiştir. Bu sonuçlar, eklenen balgam içerisindeki bakterilerin ve diğer mikropların, yapay ortam içerisinde büyüyebildiğini ve değişime uğradığını göstermektedir. İnkübasyonun ardından, kılcal tüplerde büyüyen mikropların davranışları hakkında ek soruları yanıtlamak için metabolomik ve DNA sekanslama gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

winCF sistemi, CF, KOAH, astım ve diğerleri dahil olmak üzere birçok hastalık için önem arz eden akciğer mikrobiyomunun aktivitesini incelemek için geliştirilmiş yeni bir yöntemdir.