Teknikler İndüklemek ve Ölçmek Hücresel Yaşlılık etmek

Bu tekniklerin genel amacı, hücresel yaşlanmanın indüksiyonunu, izlenmesini ve ölçülmesini sağlamak için bir araç kutusu sağlamaktır. Bu yöntemler, hücresel yaşlanmanın tanımlanması ve ölçülmesi ve hücresel ve organizma yaşlanmasını düzenleyen biyolojik faktörler hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin temel avantajı, farklı modellerde, dokularda ve hücre tiplerinde hücresel yaşlanmayı izlemek için çeşitli yöntemleri kapsamasıdır.

İlgilenilen erken geçiş proliferatif hücrelerini analiz için uygun bir kapta seyrek bir yoğunlukta kaplayarak başlayın. Ve hücreleri gece boyunca bir doku kültürü inkübatöründe kültürleyin. Hücreler% 50-60 birleştiğinde, büyüme ortamını aspire edin ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.

İkinci yıkamadan sonra, hücreleri ince bir PBS tabakası ile kaplayın. Ve hücreleri tek bir 10 dereceli gama ışınlaması dozuna maruz bırakın. PBS'yi büyüme ortamı ile değiştirin.

Ve hücreleri inkübatöre geri koyun. Işık mikroskobu altında morfolojik değişiklikler için günlük izleme ile ortamın her 48 ila 72 saatte bir değiştirilmesi. Işınlamadan yedi ila 10 gün sonra, tüm reaktifleri 37 santigrat derece su banyosunda ticari yaşlanma ile ilişkili bir beta-galaktosidaz test kitinden çözün.

Tüm reaktifler oda sıcaklığına ulaştığında, sabitleyici ve boyama solüsyonlarını üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Ve her bir kuyuyu oda sıcaklığında PBS ile nazikçe yıkayın. Yaşlanma hücreleri iyi yapışmadığından ve yıkama sırasında kolayca çıkarılabileceğinden hücreleri dikkatlice durulamaya özen gösterin.

Her bir oyuktaki hücreleri, oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca oyuk başına bir mililitre fiksatif çözelti ile sabitleyin. Ardından kuyu başına PBS ile iki adet iki mililitre yıkama yapılır. Daha sonra, her bir oyuğa bir mililitre beta-galaktosidaz boyama çözeltisi ekleyin ve plakayı, karbondioksit içermeyen 37 santigrat derecelik bir inkübatörde 24 ila 48 saatlik bir kültür için alüminyum folyo ile kaplayın.

Hücreleri 24 saatte kontrol edin. Hücreler yeterince boyandığında, beta-gal çözeltisini taze PBS ile değiştirin ve kültürleri 10x veya daha yüksek bir objektifte bağlı bir kamera ile bir ışık mikroskobu üzerinde inceleyin. Yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz hücreleri mavi görünecektir.

Ardından, kuyu başına en az beş örtüşmeyen görüntü elde edin. Ve oyuk başına yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz hücrelerinin yüzdesini hesaplamak için yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz pozitif hücrelerin toplam sayısını ve görüntü başına toplam hücre sayısını manuel olarak sayın. Gama ışınlamasından 10 gün sonra, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.

Son yıkamadan sonra, PBS'yi altı santimetrelik tabak başına antibiyotiklerle takviye edilmiş 2,5 mililitre serum içermeyen ortamla değiştirin ve hücreleri gece boyunca doku kültürü inkübatörüne geri koyun. Ertesi sabah, ortamı buz üzerinde konik bir tüpe aktarın. Ve hücreleri taze PBS ile iki kez yıkayın.

Ardından, hücreleri tripsinez edin ve sayın. Daha sonra, hücre kültürü plakasından hasat edilen süpernatanı santrifüjleyin. Daha sonra 0.45 mikrometrelik bir şırınga süzgecinden süzün ve ortamı ELISA tarafından analiz edilene kadar 80 santigrat derecede 500 mikrolitrelik alikotlarda dondurun.

Artmış yaşlanma ile ilişkili beta-gal boyama, replikatif ve DNA hasarına bağlı yaşlanma ile ortaya çıkar. Proliferatif fibroblastların iğ benzeri görünümüne kıyasla yaşlanan hücrelerin genişlemiş düz şekline dikkat edin. Bu deneyde, çoğalan genç veya replikatif yaşlanan hücreler, yazılı protokolde tarif edildiği gibi sabitlendi.

Ve DNA çift iplikçik kırılmaları ve DAPI için bir biyo işaretleyiciye karşı bir anti-kor ile boyanmıştır. Yaşlanan hücrelerde gözlenen DNA çift sarmallı kırılma fosisi sayısında belirgin bir artış ile. Yaşlanma ile ilişkili sekretuar fenotip faktörlerinin RT-qPCR analizi, MRNA düzeyinde düşük pasajlı insan diploid fibroblastlarında gama ışınlamasına bağlı yaşlanma sonrası en azından bazı faktörlerin yukarı regüle olduğunu ortaya koymaktadır.

Bu, gama ışınlanmış hücre kültürü süpernatantlarının ELISA tarafından daha da doğrulanır. Bir kez ustalaştıktan sonra, DNA hasarı indüksiyonu ve SA beta-gal boyaması yaklaşık 30 dakikalık uygulamalı sürede tamamlanabilir. SASP protein seviyelerinin ölçülmesi için koşul ortamı yaklaşık 30 dakika içinde hazırlanabilir.

Bu prosedürü denerken, yaşlanan belirteç nicelemine geçmeden önce hücre kültürlerinde morfolojik değişikliklere uğramalarını izlemeyi unutmamak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknikler yaşlanma ve kanser alanlarındaki araştırmacıların çeşitli dokularda, hücre kültürlerinde ve model organizmalarda yaşlanmayı keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, hücresel yaşlanmayı nasıl indükleyeceğinizi, izleyeceğinizi ve ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.