Pamuk Yeşilkurt bir densovirüs Host Fitness Host doku Dağılımı, İletim-modunu ve Etkisi incelenmesi için Protokoller

Bu protokolün genel amacı, bir Densovirüs olan HaDV2'nin konakçısı Cotton Bollworm üzerindeki etkisini incelemektir. Bu yöntem, şu anda yolda duran virüslerin konakçıları üzerindeki etkisi gibi virüs ana bilgisayar etkileşimi alanındaki önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Larvaların virüs pozitif ve negatif suşları oluşturmak için kullandıkları bu tekniğin temel avantajı, aynı genetik arka planı sağlayan aynı par-ne-ko-konakçılardan türetilmesidir.

Deneye başlamak için, iyi bir havalandırma sağlamak ve bir yumurta pozisyonu substratı olarak hizmet etmek için pamuklu gazlı bezle kaplanmış çift başına plastik bir kafes kullanarak yeni kapatılmış güvelerin sekiz tek çift çiftleşmesi. Virüssüz bir koloni elde etme olasılığını artırmak için en az 30 çift tek çift çiftleşme kullanın. Yetişkin güveleri% 10 şeker ve% 2 vitamin çözeltisine batırılmış pamuk topu ile besleyin ve çözeltiyi günlük olarak doldurun.

Bugünün çiftleşme sonrası, dişi yetişkinler yumurtalarını pamuklu gazlı bez üzerine bıraktıkça, gazlı bezi günlük olarak değiştirmeye başlar. Gazlı bez içeren yumurtaları, yumurtalar çatlayana kadar yetişkin güvelerle aynı büyüme odasında toplayın ve muhafaza edin. Yeni yumurtadan çıkmış larvaları hemen her kuyucuk için bir ayrı olacak şekilde yeni 24 oyuklu plakalara aktarın.

İlk yumurtlama tarihinden beş gün sonra, ebeveyn güveleri toplayın ve sıvı nitrojen içinde saklayın. Belirli primerlerle PCR kullanan ebeveynlerin HaDV2'sini kontrol edin ve HaDV2 içermeyen bireyleri HaDV2 içermeyen enfekte olmayan suş olarak tutun. Yetişkin güveleri tek tek toplayın ve hemen sıvı azot içinde saklayın.

Sterilize edilmiş bir harç ve havaneli kullanarak toplanan tek tek güveleri sıvı nitrojen içinde tamamen öğütün. Yaklaşık 10 mikrogram döküntüyü 1,5 mililitrelik temiz bir tüpe aktarın. Ardından kalan kalıntıları yeni bir tüpe aktarın ve hemen 80 santigrat derecede saklayın.

Üretici tarafından sağlanan protokolleri izleyerek 10 mikrogram enkazdan DNA'yı çıkarın. Güve DNA'sı izole edildikten sonra, protokolü kullanarak HaDV2'yi kontrol edin. Sonuçlara göre, kalan kalıntıları iki gruba ayırın: HaDV2 pozitif ve HaDV2 negatif.

Kalan larva kalıntılarını tamamen çözmek için her bireye bir mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS ekleyin. Santrifüjü dört santigrat derece önceden soğutun, ardından homojenatı döndürün. Buz üzerinde, sıvı süpernatanı 0.22 mikron membran filtre ile filtreleyin.

Filtrelenmiş sıvıların tüpü başına 200 mikrolitre toplayın ve hemen 80 santigrat derecede saklayın. HaDV2 içeren sıvıyı seyrelterek HaDV2 ile enfekte olmuş farklı konsantrasyondaki filtrelenmiş sıvılar ile oral enfeksiyon etkinliğini belirlemek. Bir davlumbazda, katı yapay diyetin yüzeyindeki her konsantrasyon için filtrelenmiş sıvılar içeren 200 mikrolitre HaDV2'yi eşit şekilde yayın.

Daha sonra, yumurtadan yeni çıkmış 100 larvayı bir petri kabında yapay diyet içeren HaDV2'ye aktarmaya başlayın. Larvaları gazlı bezden bir beyaz kağıda aktarmak için yumurtadan yeni çıkmış larvalar da dahil olmak üzere pamuklu gazlı bezi nazikçe vurun. Kağıdı nazikçe vurun, böylece larvalar ipek döndürür ve kağıdı balonu çıkarır.

İpeğe dokunmak için sterilize edilmiş forseps kullanın ve larvaları bir petri kabına taşıyın. 48 saat sonra, yapay diyetteki oyuk başına bir larvayı 24 oyuklu plakalara aktarın. HaDV2 ile aşılanmış larvaları, yetişkin aşamasına kadar aynı konsantrasyonları kullanarak tekrar edin.

Protokolü kullanarak yetişkinlerin HaDV2 enfeksiyon durumunu kontrol edin. HaDV2'nin mikrolitresi başına 10 ila sekizinci kopya sayısı ile aşılanan yetişkinler% 100 enfeksiyon verdi ve HaDV2 pozitif suşu olarak tutuldu. Kontaminasyonu önlemek için, forsepsleri ve makasları üç kez% 75 etanol içinde sterilize edin ve ardından bir alkol lambasının alevinde ısıtın.

Analitik bir terazi kullanarak, dokuları depolamak için kullanılacak boş tüpleri tartın. Daha sonra, enfekte olmuş suştan larvaları ve yetişkin güveleri yaklaşık beş dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. Donmuş larvaları, başın ve son karın segmentinin yakınındaki intersegmental zarlara yerleştirilmiş iki böcek pimi kullanarak sistoepiment üzerine sabitleyin.

Sonra arka karın bölgesinde, larvaların prolegini kesin, böylece hemolenf dışarı akar. Hemolenfin esmerleşmesini ve pıhtılaşmasını önlemek için yaklaşık 10 saniye içinde yaklaşık 10 mikrolitre larva hemolenfi pipetlemek için bir pipet kullanın. Bir makasla, kütikülde son intersegmental zardan başa kadar uzanan bir kesi yapın.

İki forseps kullanarak, ön bağırsak, orta bağırsak, arka bağırsak, yağ gövdesi ve malpighian tübüllerini inceleyin. Diseksiyon sırasında kalan dokuların hemolenf ile kontaminasyonunu önlemek için, diseke edilen dokuları PBS tamponunda yıkayın. Üç kişiden alınan doku örneklerini tek bir kopya olarak karıştırın.

Her dokuyu hemen sıvı nitrojen içindeki tüplere aktarın. PBS tamponu içeren temiz bir petri kabında, dişi ve erkek yetişkinlerin dokularını inceleyin ve her dokuyu hemen sıvı nitrojen içindeki tüplere aktarın. Tüpleri ve yukarıdaki dokuları ayrı ayrı tartın ve dokuların kütlesini hesaplayın.

Bu dokulardan DNA'yı çıkarın ve her dokunun viral titresini ölçmek için kPCR gerçekleştirin. Enfekte olmayan suştan elde edilen en az 100 pupa veya yeni çıkan yetişkin güveleri pamuklu gazlı bez kaplı 5 litrelik tel örgü kafese yerleştirin. İki gün sonra, çiftleşmiş yetişkin dişiler pamuklu gazlı bez üzerine yumurta bırakmaya başlayacaktır.

Yumurtaları içeren pamuklu gazlı bezi toplayın ve bakımını yapın. Enfekte olmayan suşun yenidoğan larvalarını, enfekte suşu oluşturmak için HaDV2 içeren yapay diyete aktararak yenidoğan larva aşılamasına devam edin. Benzer şekilde, enfekte olmayan suş olan kontrol gruplarını oluşturmak için yenidoğan larvalarını HaDV2 içermeyen filtrelenmiş sıvı ile kaplı yapay diyete aktarın.

Her tedaviye en az 240 larva ekleyin. 48 saat sonra, oyuk başına bir larvayı 24 oyuklu plakalara aktarın. Her bir kuyucuktaki her larvayı sırayla numaralandırın ve instar aşamasını ve hayatta kalma durumunu günlük olarak kaydedin.

Yaklaşık beş gün sonra, yapay diyet bozulduğunda, bu bireyleri aynı anda taze yapay diyet içeren 24 oyuklu yeni bir plakaya aktarın. Larvaları analitik bir terazi kullanarak yedinci günden 11. güne kadar tartın. Tartıldıktan sonra, larvaları ayrı ayrı 24 oyuklu plakaya geri koyun.

Beşinci instara döküldükten sonra, yumurtadan çıktıktan yaklaşık on gün sonra, larvaları cam tüplere aktarın. Bireyleri her gün aynı saatte cam tüpe aktarın. Beşinci instar larvaları, kafa kapsülünün genişliği ile de tanımlanabilir.

Daha sonra, her larvayı orijinal referans numarasıyla boya veya işaretleyiciler kullanarak cam tüp üzerine kodlayın. Larva durumunu günlük olarak kaydedin. Cam tüpteki her birey için pupa ve eklosiyon tarihini kaydedin ve üç günlük pupa kütlesini kaydedin.

Eklosyondan sonra, bir dişi ve bir erkeği %10 sükroz ve %2 vitamin solüsyonu içeren tek bir kafese koyun. Sükroz çözeltisini her gün yenileyin. Her güve için ölüm tarihini kaydedin.

Yumurtalar bırakıldığında, pamuklu gazlı bezi günlük olarak değiştirin. Hemen yumurta sayısını sayın. Son olarak, yumurtadan yeni çıkan yavruları yumurtadan çıkarken sayın.

Deneyde kullanılan örneklerin kalitesinden emin olmak için üçlüler çalıştırıldı. HaDV2 içermeyen erkek ve dişi ebeveynlerden gelen döller, enfekte olmayan suş olarak yetiştirildi. Aynı DNA şablonunu kullanarak ebeveynlerde ve yavrularda aktin genini başarıyla çoğalttık, bu da DNA şablonlarının iyi kalitede olduğunu gösteriyor.

Rastgele seçilen sekiz döl ayrıca HaDV2, HaNPV ve Wolbachia'dan da arındırılmıştı. Başlangıç materyalinin kalitesinin logu ile elde edilen CT değerleri arasındaki ilişkiyi tanımlayan standart bir eğri, CT değerleri ile HaDV2'nin ilk gen kopya numarasının logu arasında güçlü bir doğrusal korelasyon gösterir. HaDV2 kopya sayısı, her dokunun mikrogramı başına hesaplandı ve spesifik doku için toplam HaDV2 titresinin yüzdesi, HaDV2'nin esas olarak yağ gövdesinde dağıldığını ortaya koydu.

Bu prosedürü denerken, hassas larvaları lastik prosedürü sırasında yumurtadan çıktıktan sonraki ilk beş gün boyunca ele almayı unutmamak önemlidir.