Memeli Hücrelerinin Bakteri Mücadelesinden Sonra Stres Granül Oluşumunun İmmünofloresan Analizi

Bu deneyin genel amacı, bakteriyel bir enfeksiyonun, konak hücrelerin ekzojen strese yanıt olarak stres granülleri oluşturma yeteneği üzerindeki etkilerini değerlendirmektir. Bu yöntem, belirli bir patojenin tüm stres granülü yolağını değiştirip değiştiremeyeceğini veya sabote edip edemeyeceğini değerlendirmek için hücresel mikrobiyoloji alanında değerli bir araçtır. Bu tekniğin temel avantajı, stres granüllerinin ücretsiz görüntü analiz programları kullanılarak titiz ve otomatik bir şekilde kalitatif ve kantitatif olarak analiz edilebilmesidir.

Bu yöntemler, stres granülü oluşumunun ve bileşiminin dinamikleri ile bu parametrelerin belirli bir patojen tarafından nasıl etkilendiğine dair bilgi sağlamaktadır. Teşekkürler. Deneye başlamadan önce, taze ekilmiş tryptic soy agar %1 Congo red agar plakasındaki bir kırmızı S.flexneri M90T bakteri kolonisini, sekiz mililitre tryptic soy broth içeren 15 mililitrelik konik tüpe inoküle edin.

Kapağı sıktıktan sonra, koloniyi 222 RPMda çalkalayarak 30 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, virülans gen ifadesinin geç eksponansiyel faz indüksiyonunu başlatmak ve bakteriyel enfeksiyözlüğü artırmak için bakterilerin 150 µL'sini, sekiz mL taze triptik soya bulyonunda 37 °C'de ve 222 RPMda yaklaşık iki saat boyunca subkültüre edin. Subkültürün optik yoğunluğu 0,6 ile 0,9 arasındayken, santrifüjle toplamak üzere bir mL bakteriyi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.

Ardından, pelletleri bir optik yoğunluğa ulaşana kadar enfeksiyon ortamında yeniden süspanse edin. Sonra, HeLa hücresi lam kültüründeki her bir kuyucuğun süpernatantlarını aspire edin. Ve HeLa hücrelerini, kuyucuk başına 500 µL taze oda sıcaklığındaki HeLa hücresi ortamı ile dikkatlice yıkayın.

Yıkama solüsyonunu kuyucuk başına 500 µL enfeksiyon ortamı ile değiştirin ve bakterileri hücrelerin üzerine çöktürmek için 24 kuyucuklu plakayı santrifüjleyin. Konak hücre enfeksiyonunu kolaylaştırmak için çökmüş bakteriyel kokültürleri 30 dakika boyunca 37 °C'ye ayarlanmış bir doku kültürü inkübatörüne aktarın. İnkübasyonun sonunda, her yıkama için 1 mL taze 37 °C HeLa kültür ortamı kullanarak hücrelerdeki ekzojen bakterileri üç kez durulayarak uzaklaştırın.

Ardından, enfekte hücrelerin üzerini gentamicin içeren bir mililitre taze kültür medyumu ile kapatın ve plakayı hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin. İnkübasyon sonunda, medyumu ilgili stresör ile desteklenmiş 500 mikrolitre uygun kültür medyumu ile değiştirin ve hücreleri doku kültürü inkübatörüne geri koyun. Bir saat sonra, süpernatantı tamamen aspire edin ve örnekleri oda sıcaklığındaki PBS içinde %4 paraformaldehit içeren 0,5 mililitre çözeltide 30 dakika boyunca sabitleyin.

Ardından, fiksatifi uygun atık konteynırına dökün ve lamel camlarını bir mililitre tris-tamponlu salin ile iki dakika boyunca hafifçe çalkalayarak yıkayın. Yıkama işleminin sonunda, TBS'yi tamamen aspire edin ve her kuyuctaki hücreleri, TBS içinde 500 mikrolitre %0,3 Triton X-100 ile permeabilize edin. 10 dakika sonra, permeabilizasyon solüsyonunu bir mililitre TBS ile değiştirin, plakayı hafifçe çalkalayın ve TBS'yi bir mililitre bloklama solüsyonu ile değiştirip oda sıcaklığında bir saat bekletin.

Hücreleri ilgilenilen bir primer antikor kokteyli ile markalamak için, tezgah üzerine sıkıca bantlanmış bir parça plastik Parafilm üzerine her bir lam için 50 µL primer antikor karışımı damlatın. Ardından, ilk lamı almak için cımbız kullanın. Fazla sıvıyı uzaklaştırmak için lamın kenarını bir parça kağıt mendile hafifçe değdirin.

Lameli damlanın üzerine dikkatlice yerleştirin ve lamelleri uygun markalama koşullarında inkübe edin. Birincil antikor markalama inkübasyonunun sonunda, her bir lameli, kuyuk başına bir mililitre TBS içeren yeni bir 24 kuyucuklu plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın ve hücreleri oda sıcaklığında, bir plaka çalkalayıcıda beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, her bir lamel üzerindeki hücreleri, az önce gösterildiği gibi uygun sekonder antikor kokteyl karışımı ile markalayın.

Ardından lamelleyi karanlıkta, oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Sekonder antikorla markalama inkübasyonunun sonunda, hücreleri yeni bir 24 kuyucuklu plakada, az önce gösterildiği gibi hafifçe çalkalayarak ancak ışıktan koruyarak bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, tuzu uzaklaştırmak için her bir lamelleyi kısa süreliğine deiyonize suya batırın, lamellerin kenarlarını bir peçete ile kurulayın ve lamelleri, cam mikroskop lamı başına beş mikrolitre floresan montaj medyumu kullanarak hava kabarcığı oluşmadan dikkatlice yerleştirin.

Ardından lamel nail polish ile mühürleyin. Görüntüleme işlemine kadar lamları uygun şekilde saklayın. Hücreleri floresan konfokal mikroskopi ile görüntülemek için, öncelikle görüntü elde etme işlemi için uygun objektifi ve uygun floresan kanallarını seçerek başlayın.

Ardından, uygun görüntüleme yazılımını kullanarak hücrelerin görüntü yığınlarını elde edin. Tüm görüntüler yakalandığında, görüntü yığınlarını birleştirmek için uygun görüntü analiz yazılımını kullanın ve yığınları TIFF dosyaları olarak kaydedin. Daha sonra, kontrol ve deney TIFF görüntülerini görüntü analiz platformuna yükleyin ve Sequence penceresindeki kanal parametrelerini açmak için Lookup Table seçeneğini belirleyin.

Tüm kanalları devre dışı bırakmak için kanal sekmesi onay kutularının tamamına tıklayın. Ardından kanal sıfıra tıklayın ve tüm yapıları görselleştirmek için kanalın yoğunluğunu gerektiği şekilde artırarak, tercih edilen rengi seçmek için kanal sıfır renk çubuğuna tıklayın. Deneysel analiz için uygun renk kanallarının her birini seçip ayarladıktan sonra, tuval sekmesini seçin ve görüş alanı başına yaklaşık 10 hücreyi görselleştirmek için yakınlaştırma sekmesini ayarlayın.

Poligon aracını kullanarak ilgili hücrenin üzerine tıklayın ve hücre sınırını belirlemek için çizgiyi hücrenin etrafına doğru uzatın. Bu ilgi bölgesini adlandırmak için, ilgi bölgesi penceresinde, ilgili hücrenin üzerine sağ tıklayın ve ilgi bölgesinin adını değiştirmek için isme çift tıklayın. Aynı yöntemle tüm ilgili hücreleri seçip adlandırdıktan sonra, tespit ve takip sekmesi içindeki Spot Detector uygulamasını açın.

Ön İşleme (Pre Processing) sekmesini açın ve analiz edilecek kanalı seçin. Dedektör (Detector) sekmesi içerisinde, Koyu arka plan üzerindeki parlak noktaları tespit et (Detect bright spots over dark background) seçeneğini belirleyin ve uygun ölçeği ve hassasiyeti seçin. İlgi Alanı (Region of Interest) sekmesi altında, dizideki önerilen ilgi alanını seçin.

Filtering sekmesi altında NoFiltering seçeneğini belirleyin. Output sekmesinde uygun çıktıyı seçin. Remove previous spots rendered as regions of interest seçeneğini işaretleyin ve dosyayı kaydetmek için klasör seçmek üzere no file selected düğmesine tıklayın.

Ardından Ekran (Display) sekmesi altında, ilgili uygun seçenekleri belirleyin ve Algılamayı Başlat (Start Detection) düğmesine tıklayın. Görüntüleme analiz yazılımı içerisinde, belirlenen her bir ilgi bölgesindeki stres granüllerini tanımlamak için nokta dedektörü kullanılabilir. Daha sonra, tanımlanan tüm stres granüllerini görüntülemek için ikili bir görüntü oluşturulabilir.

Stres granülü analizi, analiz edilen her stres granülü örneğine göre dikkatle uyarlanmalıdır. Örneğin, tespit edilen ilgi alanının boyut gereksiniminin değiştirilmesi veya tespit parametrelerinin hassasiyetinin değiştirilmesi farklı sonuçlara yol açar. Daha yüksek piksel boyutu ölçeklerinde, daha küçük stres granülleri sayılmayacak ve stres granülü sayıları azalacaktır.

Hassasiyetin artırılması, stres granüllerinin sayısında bir artışla sonuçlanır. Örneğin, bu deneyde, 100 hassasiyetteki iki ölçeği, stres granül belirteci G3BP1 için en iyi sonucu vermiştir. Buna karşılık, 55 hassasiyetteki iki ölçek, EIF3B stres granül belirteci için en iyi sonucu vermiştir.

Yüzey alanı daha sonra stres granüllerinin boyutundan hesaplanabilir. Frekans dağılım grafikleri, farklı hücre popülasyonları arasındaki stres granülü boyutlarındaki değişimleri vurgulamak için kullanışlıdır. Ek olarak, floresan yoğunluğu, analiz edilen stres granüllerinin kalitesi hakkında bilgi sağlayabilir.

Yöntem ustalıkla uygulandığında, tüm hücre çalışması yaklaşık altı ila yedi saatte tamamlanabilir ve analizler ek olarak iki ila üç saat içinde bitirilebilir. Bu prosedür uygulanırken, verilerdeki değişkenliği en aza indirmek için kontrol ve deney örneklerinin her zaman aynı anda ve aynı koşullar altında işlendiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, stres granülü lokalizasyonuna dair ek bilgiler elde etmek için analiz üç boyutlu bir hacme de genişletilebilir.

Bu yarı otomatik prosedür, enfekte edilmemiş ve enfekte edilmiş hücrelerdeki stres granüllerinin titiz ve tarafsız bir şekilde analiz edilmesine olanak tanır. Bu yöntem, stres granül yolağındaki daha önce bilinmeyen sapmaları ortaya çıkarabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin bakterilerle nasıl enfekte edileceği, stres granül oluşumunun nasıl indükleneceği ve stres granüllerini kalitatif ve kantitatif olarak analiz etmek için yarı otomatik bir yaklaşımın nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Ayrıca, Shigella flexneri ve klotrimazol gibi stres granülü indükleyen ajanların tehlikeli olabileceğini; eldiven giymek, BL2 düzeyindeki bir laboratuvarda çalışmak ve tüm reaktifleri uygun şekilde imha etmek gibi önlemlerin gerekli olduğunu unutmayın.