Name: Memeli Hücrelerinin Bakteri Mücadelesinden Sonra Stres Granül Oluşumunun İmmünofloresan Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Öğrenin, bakteri enfeksiyonlarının memeli hücrelerinde stres granül oluşumuna etkisini immünofloresan analizle nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu yöntem, hücresel mikrobiyolojide patojen-stres yanıtı etkileşimlerini araştırmak için otomatik ve nicel analiz imkanı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

PS, Bill ve Melinda Gates Büyük Zorluk Hibe OPP1141322&#39;yi alıyor. PV, İsviçreli Ulusal Bilim Vakfı Early Postdoc Hareketlilik bursu ve Roux-Cantarini doktora sonrası bir burs tarafından desteklendi. PJS, bir HHMI hibesi ve ERC-2013-ADG 339579-Şifre Decrypt tarafından desteklenmektedir.

<ol><li>Reineke, L. C., Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversion+of+stress+granules+and+P-bodies+during+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection.</a> Virology. 436 (2), 255-267 (2013).</li>
<li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules+and+cell+signaling%3A+more+than+just+a+passing+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase.</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li>
<li>Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+flexneri+modulates+stress+granule+composition+and+inhibits+stress+granule+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation.</a> Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).</li>
<li>Kolobova, E., Efimov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-dependent+association+of+AKAP350A+and+CCAR1+with+RNA+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules.</a> Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).</li>
<li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%3A+the+Tao+of+RNA+triage%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biochemical+sciences%22%5BJournal%5D)">Stress granules: the Tao of RNA triage.</a> Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).</li>
<li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressful+initiations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Stressful initiations.</a> J Cell Sci. 115, Pt 16 3227-3234 (2002).</li>
<li>Mohr, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+translation+at+the+nexus+of+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Host translation at the nexus of infection and immunity.</a> Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).</li>
<li>Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+formation+mediates+the+inhibition+of+colonic+Hsp70+translation+by+interferon-+and+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor.</a> Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).</li>
<li>Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+pitfalls+in+Shigella+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Progress and pitfalls in Shigella vaccine research.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).</li>
<li>Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Causes+of+Diarrheal+Disease+Mortality+in+Children%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children.</a> PloS One. 8 (9), 72788(2013).</li>
<li>Ashida, H., Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+deploy+multiple+countermeasures+against+host+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses.</a> Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).</li>
<li>Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).</li>
<li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li>
<li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+on+the+inside%3A+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Re.+Micro%22%5BJournal%5D)">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada özetlenen protokol, dış kaynaklı stres varlığında veya yokluğunda, sitoplazmik patojen S. flexneri ile infekte olmayan hücrelerdeki ve hücrelerdeki SG&#39;lerin indüksiyonu, lokalizasyonu ve analizini anlatmaktadır. Protokoller, serbest görüntüleme yazılımını kullanarak belirli fenotiplerde farklılıkları tanımlamak ve istatistiksel olarak ele almak için SG oluşumunun kesin kalitatif ve kantitatif analizine olanak tanır. Enfeksiyon, SG indüksiyon ve görüntüleme parçaları için ...

Konukçu patojen etkileşimlerini hücre seviyesinde görselleştirmek, patojenik stratejiler hakkında fikir edinmek ve anahtar hücresel yolları tanımlamak için güçlü bir yöntemdir. Gerçekten, patojenler önemli hücresel hedefleri veya yapıları saptamak için araçlar olarak kullanılabilirler, çünkü patojenler merkezi hücresel prosesleri kendi hayatta kalmaları veya yayılımı için bir strateji olarak yıkmaya dönüşmüştür. Hücresel bileşenlerin görselleştirilmesi, flüoresanla etiketlenmiş konukçu proteinleri rekombinant şekilde eksprese ederek gerçekleştirilebilir. Bu, gerçek zamanlı analiz yapmayı sağlarken, spesifik olarak etiketlenmiş konukçu proteinler ile hücre hatlarının üretilmesi oldukça zahmetlidir ve istenmeyen yan etkilere neden olabilir. Çoklu konukçu faktörlerin aynı anda analiz edilebileceği ve birinin belirli bir hücre tipi ile sınırlı olmadığından spesifik antikorları kullanan hücresel faktörlerin saptanması daha elverişlidir. Bir dezavantaj, immünofloresans analizi, konukçu hücre fiksatını gerekli kıldığı için yalnızca statik bir görünümü yakalayabilmesidiriyon. Bununla birlikte, immünofloresan görüntülemenin önemli bir avantajı, hem niteliksel hem de niceliksel analiz için kendini kolayca bulabilmesidir. Bu, konak-patojen etkileşimlerine yeni kavrayışlar sağlamak için istatistiksel olarak önemli farklılıklar elde etmek için kullanılabilir. Floresan görüntü analiz programları 3D ve 4D analizini gerçekleştirmek için güçlü analitik araçlardır. Bununla birlikte, yüksek maliyetli yazılım ve bakımı, açık kaynaklı yazılımlara dayalı yöntemleri daha cazip kılmaktadır. Biyolojik analiz yazılımını kullanarak dikkatli bir görüntü analizi, görsel analizi desteklediği ve istatistiksel önemleri belirlerken belirli bir fenotipin doğruluğuna olan güvenini arttırdığı için değerlidir. Daha önce SG&#39;ler, bağımsız SG&#39;lerin elle tanımlanmasını gerektiren ücretsiz ImageJ yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir4. Burada, hücresel SG oluşumunun indüksiyonu ve analizi için bir protokol sağlıyoruz(ICO) (http://icy.bioimageanalysis.org) kullanılarak biyolojik enfeksiyonlara karşı korunma sağlar. Biyo-görüntü analiz yazılımı, SG analizi için oldukça uygun olan yerleşik bir spot detektör programına sahiptir. Belirli Bölgelerdeki (ROI&#39;lar) otomatik algılama işleminin hassas ayarlanmasına izin verir. Bu, bireysel SG&#39;lerin manuel analiz ihtiyacını ortadan kaldırır ve örnekleme yanlılığını kaldırır. Birçok çevresel stres, 0,5 - 5 μm çapında 5 , 6 faz yoğun sitosolik, membranöz olmayan yapılar olan SG oluşumuna neden olur. Bu hücresel tepki, maya, bitkiler ve memelilerde evrimsel olarak korunur ve genel protein translasyonu engellendiğinde oluşur. Translatedly-inactive mRNA&#39;lar için tutulan yerler olarak kabul edilen, hücresel mRNA&#39;ların bir alt grubunun seçici çevirisine izin veren SG&#39;ye durdurulmuş çeviri başlatma komplekslerinin toplanmasını içerir.Stresin giderilmesiyle, SG&#39;ler eritilir ve küresel protein sentezi oranları devam eder. SG&#39;ler, uygulanan strese bağlı olarak tam kompozisyonun değişmesine rağmen, translasyon uzama başlatma faktörleri, RNA metabolizmasına katılan proteinler, RNA-bağlayıcı proteinlerin yanı sıra iskele proteinleri ve konakçı hücre sinyallemesi 2&#39;ye dahil olan faktörlerden oluşur. SG oluşumunu uyaran çevresel faktörler, amino asit açlığı, UV ışınlaması, ısı şoku, ozmotik şok, endoplazmik retikulum stres, hipoksi ve viral enfeksiyonu içerir 2 , 7 , 8 . Bakteriyel, mantar veya protozoon patojenler gibi diğer patojenlerin bu hücresel stres tepkisini nasıl etkilediği hakkında henüz çok az şey bilinmesine rağmen, virüslerin SG oluşumunu nasıl indüklediğini ve yok ettiğini anlamada çok ilerleme kaydedildi 1 , 7 . ShigeLla flexneri, insanlarda gram negatif fakültatif bir sitozolik patojendir ve şiddetli ishal ya da shigellosis&#39;in sebep olduğu ajandır. Shigellosis önemli bir halk sağlığı yüküdür ve 9 , 10 yaşlarındaki 5 yaşın altındaki çocuklarda yılda 28.000 ölüme neden olur. S. flexneri , kolonik epiteli enfekte eder ve konak hücrenin hücre iskelet sistemi bileşenlerini 11 , 12&#39;yi kaçırarak hücre-hücreye yayılır. Epitelin enfeksiyonu S. flexneri&#39;nin sitoplazmada çoğalmasını destekler, ancak enfekte makrofajlar pyroptoz adı verilen inflamatuar bir hücre ölümü süreciyle ölürler. Enfeksiyon, nötrofillerin büyük miktarda alınmasına ve ısı, oksidatif stres ve doku tahribatının eşlik ettiği ciddi inflamasyona neden olur. Böylece, enfekte olmuş hücreler, Golgi bozulması, genotoksik stres ve sitoskeletal yeniden düzenlenme gibi, enfeksiyon tarafından indüklenen iç strese maruz kalırlar.S, enfekte hücreler de inflamasyon süreci nedeniyle çevresel strese maruz kalmaktadır. S. flexneri enfeksiyonunun, hücrelerin bir takım SG markörleri kullanarak çevresel streslere tepki verme kabiliyeti üzerindeki etkisinin karakterizasyonu, enfeksiyonun SG bileşimi 3&#39;teki kalitatif ve kantitatif farklılıklara yol açtığını ortaya koymuştur. Bununla birlikte, diğer bakteriyel patojenler hakkında çok az şey bilinmektedir. Burada, konakçı hücrelerin sitosolik patojen S. flexneri ile infeksiyonu için bir metodoloji, farklı çevresel streslere sahip hücrelerin streslenmesi , SG bileşenlerinin etiketlenmesi ve enfekte bağlamında SG oluşumunun ve kompozisyonunun nitel ve nicel analizleri anlatılmaktadır. Ve enfekte olmayan hücreler. Bu yöntem, diğer bakteriyel patojenler için yaygın olarak uygulanabilir. Buna ek olarak, SG oluşumunun görüntü analizi virüsler veya diğer patojenlerin neden olduğu enfeksiyonlar için kullanılabilir. SG&#39;yi analiz etmek için kullanılabilirEnfeksiyona bağlı oluşum veya enfeksiyonun dış kaynaklı streslere yanıt olarak SG oluşumu üzerindeki etkisi.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Primer Antikorlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>eIF3b (N20), orijin keçi&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16377</td><td>Sağlam ve yaygın olarak kullanılan SG işaretleyicisi. Sitozolik boyama, hücre tanımlamasına izin verir. Seyreltme 1:300</td></tr><tr><td>eIF3b (A20), menşe keçi&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16378</td><td>eIF3b (N20) ile aynı hedef ve elimizdeki hedef eIF3b (N20) ile aynıydı. Seyreltme 1:300</td></tr><tr><td>eIF3A (D51F4), orijin tavşan (MC: monoklonal)</td><td>Hücre Sinyali</td><td>3411</td><td>eIF3b ile multiprotein eIF3 kompleksinin bir parçası. Seyreltme 1:800</td></tr><tr><td>eIF4AI, menşe keçi&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-14211</td><td>Öneren (Ref # 13). Seyreltme 1:200</td></tr><tr><td>eIF4B, orijin tavşan</td><td>Abcam</td><td>ab186856</td><td>Elimizde iyi stres granül işaretleyicisi. Seyreltme 1:300</td></tr><tr><td>eIF4B, orijin tavşan</td><td>Hücre Sinyali</td><td>3592</td><td>Ref # 13 tarafından önerilir. Seyreltme 1:100</td></tr><tr><td>eIF4G, köken tavşan</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11373</td><td>Yaygın olarak kullanılan SG işaretleyici. (Ref # 13): fare hücre hatlarında iyi çalışmayabilir. Seyreltme 1:300</td></tr><tr><td>G3BP1, orijin tavşan (MC: monoklonal)</td> <td>BD Biosciences</td><td>611126</td><td>Yaygın olarak kullanılan SG işaretleyicisi. Seyreltme 1:300</td></tr><tr><td>Tia-1, menşei keçi&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1751</td><td>Yaygın olarak kullanılan SG işaretleyici. SG mevcut olduğunda P cisimlerinde de bulunabilir (Ref # 13). Seyreltme 1: 300</td></tr> <tr><td>< güçlü > Alexa konjuge İkincil Antikorlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>A488 anti-keçi, köken eşek</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11055</td><td>Çapraz emilir. Seyreltme 1:500</td></tr><tr><td>A568 anti-keçi, menşeli eşek</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11057</td><td>Çapraz emilir. Seyreltme 1:500</td></tr><tr><td>A488 anti-fare, köken eşek</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21202</td><td>Seyreltme 1:500</td></tr><tr><td>A568 anti-fare, köken eşek</td><td>Thermo Fisher</td><td>A10037</td><td>Seyreltme 1:500</td></tr><tr><td>A647 anti-fare, köken eşek</td><td>Thermo Fisher</td><td>A31571</td><td>Seyreltme 1:500</td></tr><tr><td>A488 anti-tavşan, köken eşek</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21206</td><td>Seyreltme 1:500</td></tr><tr><td>A568 tavşan karşıtı, köken eşek</td><td>Thermo Fisher</td><td>A10042</td><td>Seyreltme 1:500</td></tr><tr><td><güçlü>Diğer Reaktifler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shigella flexneri</td><td></td><td></td> <td>istek üzerine çeşitli laboratuvarlardan temin edilebilir</td></tr><tr><td>Tripton Kazein Soya (TCS) suyu</td><td>BD Biosciences</td><td>211825</td><td>Shigella için standart büyüme ortamı, uygulama - bakteri üremesi</td></tr><tr><td>TCS agar</td><td>BD Biosciences</td><td>236950</td><td>Shigella için standart büyüme agarı, uygulama - bakteri üremesi</td></tr><tr><td>Kongo kırmızısı</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>27215.01</td><td>Virülans plazmidini kaybetmiş Shigell için distriminasyon aracı, uygulama - bakteri üremesi</td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1274</td><td>Enfeksiyonu artırmak için bakterileri kaplamak için faydalıdır, uygulama - enfeksiyon</td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>Hücre dışı ancak sitozolik olmayan bakterilerin seçici olarak öldürülmesi, uygulama - enfeksiyon</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-056</td><td>PH tamponu, hücreler RT'de inkübe edildiğinde kullanışlıdır, uygulama - hücre kültürü</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>31885</td><td>HeLa hücreleri için standart kültür ortamı, uygulama - hücre kültürü</td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu (FCS)</td><td>Biowest</td><td>S1810-100</td><td>HeLa hücre kültürü ortamı için kullanılan %5 takviye, uygulama - hücre kültürü</td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td>HeLa hücre kültürü ortamı için kullanılan 1:100 seyreltme, uygulama - hücre kültürü</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Reaktif seyreltici, uygulama - hücre kültürü</td></tr><tr><td>Sodyum arsenit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7400</td><td>Güçlü stres granül indükleyici (Not: son derece toksik, özel işlem ve bertaraf gereklidir), uygulama - stres indükleyici</td></tr><tr><td>Clotrimazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6019</td><td>Güçlü stres granül indükleyici (Not: sağlık tehlikesi, özel kullanım ve bertaraf gereklidir), uygulama - stres indükleyici</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA</td><td>Elektron Mikroskobu Scences</td><td>15714</td><td>% 4 PFA, hücrelerin standart fiksasyonu için kullanılır, uygulama - fiksasyon</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>İmmünofloresan boyamadan önce konakçı hücrelerin geçirgenliği için% 0.03'te kullanılır, uygulama - geçirgenlik</td></tr><tr><td>A647-phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A22287</td><td>Seyreltme 1:40'tadır, en iyi ikincil antikor boyama sırasında eklenir, uygulama - boyama</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Hem konakçı çekirdeği hem de bakterileri görselleştirmek için kullanılan nükleid asit boyası, uygulama - boyama</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR701501</td><td>Lamellerin immünofloresan boyaması için yararlı parafin filmi, uygulama - boyama</td></tr><tr><td>Prolong Gold</td><td>Thermo Fisher</td><td>36930</td><td>Çoğu florofor için iyi çalışan sağlam montaj ortamı, uygulama -</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381 montajı</td><td>Çoğu florofor için iyi çalışan ucuz ve sağlam montaj ortamı, uygulama -</td></tr><tr><td>24 oyuklu hücre kültürü plakası</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527</td><td>montajı Standart doku kültürü plakaları, uygulama - hücre kültürü</td></tr><tr><td>12 mm & nbsp cam lameller</td><td>NeuVitro</td><td>1001/12</td><td>İmmünofloresan uygulamaları için hücre kültürü desteği, uygulama - hücre desteği</td></tr><tr><td>forseps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>Çoğu florofor için iyi çalışan ucuz ve sağlam montaj ortamı, uygulama - montaj</td></tr><tr><td><güçlü>Programlar ve Ekipmanlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Yazılımı</td><td></td><td>Sağlam istatistiksel test seçenekleri ile veri analizi ve grafik programı, uygulama - veri analizi</td></tr><tr><td>Leica SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Konfokal mikrosop, uygulama - görüntü satın alma</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Professional görüntü analiz programı, uygulama - veri analizi</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Veri analizi ve grafik programı, uygulama - veri analizi</td></tr></tbody></table>

memeli hücrelerinin bakteri mücadelesinden sonra stres granül oluşumunun İmmünofloresan analizi

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Hücresel bileşenlerin floresan görüntülemesi konakçı-patojen etkileşimlerini araştırmak için etkili bir araçtır. Patojenler, organelle ultrastrüktür, hücre iskeleti ağ organizasyonu ve ayrıca Stres Granülü (SG) oluşumu gibi hücresel işlemleri de içeren enfekte hücrelerin birçok farklı özelliğini etkileyebilir. Patojenlerin konakçı süreçleri nasıl alt üst ettirdiklerinin karakterizasyonu patojenez alanının önemli ve ayrılmaz bir parçasıdır. Değişken fenotipler kolayca görülebiliyor olsa da, patojen yüklemesiyle indüklenen hücresel yapıların nitel ve niceliksel farklılıklarının kesin analizi, deneysel ve kontrol örnekleri arasındaki istatistiksel olarak önemli farklılıkların tanımlanması için gereklidir. SG oluşumu, antiviral yanıtlara yol açan evrimsel olarak korunmuş bir stres tepkisidir ve uzun süredir viral enfeksiyonlar 1 kullanarak araştırılmıştır. SG oluşumu aynı zamanda sinyal kaskatlarını da etkiler ve hala bilinmeyen diğer kavramlara sahip olabilir2 . Bakteriyel patojenler gibi virüs dışındaki patojenlere karşı bu stres tepkisinin karakterizasyonu şu anda ortaya çıkan bir araştırma alanıdır 3 . Şimdilik, SG oluşumunun nicel ve nitel analizi henüz viral sistemlerde rutin olarak kullanılmamaktadır. Burada, çeşitli dışsal streslere yanıt olarak SG oluşumunu etkileyen enfekte olmayan hücrelerde ve bir sitozolik bakteriyel patojen bulaşmış hücrelerde SG oluşumunu indüklemek ve karakterize etmek için basit bir yöntem tarif ediyoruz. SG oluşumunun ve bileşiminin analizi, bir dizi farklı SG işaretleyicisi ve ICY&#39;nin açık kaynak görüntü analiz aracı olan spot detektör eklentisi kullanılarak gerçekleştirilir.

Bu yazıda açıklanan protokolü açıklamak ve göstermek için, cytosolik patojen S. flexneri ile enfekte olmuş veya olmayan HeLa hücrelerindeki klotrimazol kaynaklı SG&#39;lerin görüntüsünü karakterize ettik. Prosedürün ana hatları Şekil 1&#39;de sunulmakta ve Kongo Kırmızı plakaları üzerinde çizgili olan virulent ve avirulent S. flexneri , bakteri hazırlama, enfeksiyon, çevresel stres eklenmesi, numune fiksasyonu ve boyama, numune görüntüleme ...

Hücrelere bakterilerle ve birkaç farklı stresle meydan okuduktan sonra, memeli hücrelerinde stres granülü oluşumunun nitel ve nicel analizi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, konakçı-bakteriyel etkileşimlerin geniş bir aralığında hücresel stres granül tepkisini araştırmak için uygulanabilir.

Memeli Hücrelerinin Bakteri Mücadelesinden Sonra Stres Granül Oluşumunun İmmünofloresan Analizi

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Bu deneyin genel amacı, bakteriyel bir enfeksiyonun, konak hücrelerin ekzojen strese yanıt olarak stres granülleri oluşturma yeteneği üzerindeki etkilerini değerlendirmektir. Bu yöntem, belirli bir patojenin tüm stres granülü yolağını değiştirip değiştiremeyeceğini veya sabote edip edemeyeceğini değerlendirmek için hücresel mikrobiyoloji alanında değerli bir araçtır. Bu tekniğin temel avantajı, stres granüllerinin ücretsiz görüntü analiz programları kullanılarak titiz ve otomatik bir şekilde kalitatif ve kantitatif olarak analiz edilebilmesidir.Bu yöntemler, stres granülü oluşumunun ve bileşiminin dinamikleri ile bu parametrelerin belirli bir patojen tarafından nasıl etkilendiğine dair bilgi sağlamaktadır. Teşekkürler. Deneye başlamadan önce, taze ekilmiş tryptic soy agar %1 Congo red agar plakasındaki bir kırmızı S.flexneri M90T bakteri kolonisini, sekiz mililitre tryptic soy broth içeren 15 mililitrelik konik tüpe inoküle edin.Kapağı sıktıktan sonra, koloniyi 222 RPMda çalkalayarak 30 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, virülans gen ifadesinin geç eksponansiyel faz indüksiyonunu başlatmak ve bakteriyel enfeksiyözlüğü artırmak için bakterilerin 150 µL'sini, sekiz mL taze t

immunofluorescence-analysis-stress-granule-formation-after-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Cayron, J., ve diğerleri. Stres Tedavileri Altında Bakteriyel Büyümenin Çok Ölçekli Analizi. J. Vis. Uzm. (2019).Bu video, stres koşulları altında bakteri hücrelerini görüntülemek için mikroakışkan bir plakanın nasıl hazırlanacağını ve kullanılacağını gösterir. Bir bakteri kültürü ve strese neden olan bir antibiyotik ortamının tanıtılması, ardından hücre yüklemesi ve mikroskobik kurulum sürecini ana hatlarıyla belirtir. Faz kontrast modunda hızlandırılmış görüntüleme daha sonra, inhibe...

Mikroakışkan Odalar Kullanılarak Stres Altında Bakteri Büyümesinin Mikroskobik Analizi

Kaynak: Vonaesch, P. ve ark., Memeli Hücrelerinin Bakteriyel Meydan Okumasından Sonra Stres Gralüleri Oluşumunun İmmünofloresan Analizi. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, epitel hücrelerinin patojenik bakteri Shigella flexneri ile enfekte edilmesini ve bunun sonucunda oluşan konak hücresel yanıtını göstermektedir. Bakteriyel efektör proteinler, konak translasyonunu bozarak stres granülleri adı verilen zarsız organellerin oluşumunu tetikler; bu organeller hücrenin enfeksiyona adaptif yanıtını...

Kanserli epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyonu sırasında stres granülleri oluşumu

Bu video, mRNA'lar, RNA bağlayıcı proteinler (RBP'ler) ve diğer çeşitli proteinlerden oluşan memeli stres granüllerini karakterize etmek ve ölçmek için bir testi göstermektedir.

Memeli Stres Granüllerini Karakterize Etmek ve Ölçmek için Bir İmmünofloresan Testi

Akış sitometrisi ve mikroskopiye dayanan iki yardımcı yöntem mayada bir MAPK yolağının aktivasyonu ile uyarılan gen ekspresyonunun dinamiklerinin tek hücre düzeyinde miktarının, ki olanak sunulmaktadır.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

Hızlı antibiyotik duyarlılık testi için mikroakışkan bir platform geliştirdik. Sıvı, mikroakışkan bir kanalın dibinde hareketsiz hale getirilen bakteriler üzerinde yüksek hızlarda geçirilir. Stres ve antibiyotik varlığında, hassas bakteri suşları hızla ölür. Ancak dirençli bakteriler bu stresli koşullarda hayatta kalabilirler.

Çip üzerinde Stres Kaynaklı Antibiyotik Duyarlılık Testi

Stres granüller (SGS) takılmıştır ribonükleoprotein parçacıklar (RNP) ve çeşitli gerilimlere, hücresel yanıt olarak önemli sitoplazmik RNA ihtiva eden granüller bulunmaktadır. SG-Dinamiği stresten sonra transfekte primer hücrelerde SGS etiketli bileşeninin lokalizasyonu görselleştirerek canlı hücrelerde takip edilebilir.

Canlı İlköğretim Hücrelerde G3BP Stres Granül Dinamiği Görselleştirme

Stres Granülleri (SG), çeşitli streslere maruz kalan hücrelerde oluşan doku dışı yapısal sitoplazmik yapılardır. SG'ler mRNA'lar, RNA-bağlayıcı proteinler, küçük ribozomal altbirimler, translasyona bağlı faktörler ve çeşitli hücre sinyal proteinlerini içerir. Bu protokol, iyi niyetli SG'leri tespit etmek, karakterize etmek ve ölçmek için çeşitli deneysel yaklaşımlar kullanan bir iş akışını tanımlamaktadır.

Sitoplazmik Odakları Memeli Stres Granülleri Olarak Sınıflandırma Yöntemleri

Biz coverslips karşı antikorlar için B-hücre reseptör, ilk aşama için bir model ile kaplı üzerinde yayılmış B hücreleri aynı anda görüntü aktin yapıları, mikrotübüller ve Mikrotubul artı uç proteinler STED mikroskobu kullanılarak bir protokol mevcut bağışıklık synapse oluşumu.

Aktin ve Mikrotubul Cytoskeletons uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) mikroskopi kullanarak B-hücre bağışıklık sinaps, görselleştirme

Bakteriyel enfeksiyon yapisan hücre hücre dışı matriks sertlik etkisi problama için çok iyi biçim polyacrylamide tabanlı tahlil geliştirdik. Bu tahlil akış sitometresi, immunostaining ve çekiş kuvvet mikroskobu, hücreler, hücre dışı matriks ve patojen bakteriler arasında biyomekanik etkileşimlerin nicel ölçümler için izin ile uyumludur.

Hücre dışı matriks sertlik etkisi yapışık hücreleri bakteriyel enfeksiyon türleri çalışmak için çok iyi Format Polyacrylamide tabanlı tahlil

Floresan mikroskopi görüntülerinde belirli hücre bölmelerinde hücresel cisimlerin hızlı araştırılması ve doğru analizi için oluşturulmuş serbestçe kullanılabilir bir iş akışı salıyoruz. Bu kullanıcı dostu iş akışı açık kaynak yazılım Icy üzerinde tasarlanmıştır ve aynı zamanda ImageJ işlevleri kullanır. Boru hattı görüntü analizi nde bilgi olmadan uygun fiyatlı.

Alt Yapı Analizörü: Floresan Mikroskopi Görüntülerinde HücreCisimlerinin Hızlı Araştırılması ve Doğru Analizi için Kullanıcı Dostu İş Akışı

Öğrenin, bakteri enfeksiyonlarının memeli hücrelerinde stres granül oluşumuna etkisini immünofloresan analizle nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu yöntem, hücresel mikrobiyolojide patojen-stres yanıtı etkileşimlerini araştırmak için otomatik ve nicel analiz imkanı sunar.

Memeli Hücrelerinin Bakteri Mücadelesinden Sonra Stres Granül Oluşumunun İmmünofloresan Analizi

Daha fazla video keşfet