Memeli Hücrelerinin Bakteri Mücadelesinden Sonra Stres Granül Oluşumunun İmmünofloresan Analizi

Hücrelere bakterilerle ve birkaç farklı stresle meydan okuduktan sonra, memeli hücrelerinde stres granülü oluşumunun nitel ve nicel analizi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, konakçı-bakteriyel etkileşimlerin geniş bir aralığında hücresel stres granül tepkisini araştırmak için uygulanabilir.

Bu deneyin genel amacı, bakteriyel bir enfeksiyonun, konakçı hücrelerin ekzojen strese yanıt vermek için stres granülleri oluşturma yeteneği üzerindeki etkilerini değerlendirmektir. Bu yöntem, hücresel mikrobiyoloji alanında, belirli bir patojenin tüm stres granül yolunu değiştirip değiştiremeyeceğini veya bozup bozamayacağını değerlendirmek için değerli bir araçtır. Bu tekniğin temel avantajı, gerilim granüllerinin ücretsiz görüntü analiz programları kullanılarak titiz ve otomatik bir şekilde kalitatif ve kantitatif olarak analiz edilebilmesidir.

Bu yöntem, stres granül oluşumu ve bileşiminin dinamikleri ve bu parametrelerin belirli bir patojenden nasıl etkilendiği hakkında bilgi sağlar. Teşekkür ederim. Mücadeleye başlamadan önce, kırmızı bir S.flexneri M90T bakteri kolonisini, taze çizgili bir triptik soya agarından %1 Kongo kırmızı agar plakasından, sekiz mililitre triptik soya suyu içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aşılayın.

Kapağı sıktıktan sonra, koloniyi gece boyunca 222 RPM ve 30 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin. Ertesi gün, virülans gen ekspresyonunun geç üstel faz indüksiyonunu başlatmak ve bakteriyel enfekte edilebilirliği arttırmak için 37 santigrat derece ve 222 RPM'de yaklaşık iki saat boyunca sekiz mililitre taze triptik soya suyu içinde 150 mikrolitre bakterinin alt kültürü. Alt kültürün optik yoğunluğu 0.6 ile 0.9 arasında olduğunda, bir mililitre bakteriyi santrifüjleme ile toplanmaları için 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Ve peleti enfeksiyon ortamında bir optik yoğunlukta yeniden süspanse edin. Daha sonra, bir HeLa hücresi lamel kültürünün her bir oyuğundan süpernatanları aspire edin. Ve HeLa hücrelerini kuyucuk başına 500 mikrolitre taze oda sıcaklığında HeLa hücre ortamı ile dikkatlice yıkayın.

Yıkamayı oyuk başına 500 mikrolitre enfeksiyon ortamı ile değiştirin ve bakterileri hücrelere döndürmek için 24 oyuklu plakayı santrifüjleyin. Çökelmiş bakteri kokültürlerini, konak hücre enfeksiyonunu kolaylaştırmak için 30 dakika boyunca 37 santigrat derece doku kültürü inkübatörüne aktarın. İnkübasyonun sonunda, yıkama başına bir mililitre taze 37 santigrat derece HeLa kültür ortamında üç durulama ile eksojen bakterileri hücrelerden çıkarın.

Daha sonra enfekte olmuş hücreleri gentamisin içeren bir mililitre taze kültür ortamı ile örtün ve plakayı hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. İnkübasyonun sonunda, ortamı, ilgilenilen stres etkeni ile desteklenmiş 500 mikrolitre uygun kültür ortamı ile değiştirin ve hücreleri doku kültürü inkübatörüne geri koyun. Bir saat sonra, süpernatanı tamamen aspire edin ve numuneleri 30 dakika boyunca PBS'de 0,5 mililitre oda sıcaklığında% 4 paraformaldehitte sabitleyin.

Ardından, sabitleyiciyi uygun atık kabına atın ve lamelleri bir mililitre tris tamponlu tuzlu su ile iki dakika boyunca hafifçe çalkalayarak yıkayın. Yıkama işleminin sonunda, TBS'yi tamamen aspire edin ve TBS'de 500 mikrolitre% 0.3 Triton X-100 ile her bir oyuktaki hücreleri geçirgen hale getirin. 10 dakika sonra, geçirgenleştirici çözeltiyi bir mililitre TBS ile değiştirin, plakayı hafifçe döndürün ve TBS'yi oda sıcaklığında bir saat boyunca bir mililitre engelleme çözeltisi ile değiştirin.

Hücreleri ilgilenilen bir birincil antikor kokteyli ile etiketlemek için, lamel başına 50 mikrolitre birincil antikor karışımını, tezgah üstüne sıkıca bantlanmış bir plastik Parafilm parçası üzerine yerleştirin. Ardından ilk lamel almak için cımbız kullanın. Ve fazla sıvıyı çıkarmak için lamel kenarını bir kağıt mendil üzerine sürün.

Lameli dikkatlice damlanın üzerine yerleştirin ve lamelleri uygun etiketleme koşulları altında inkübe edin. Birincil antikor etiketleme inkübasyonunun sonunda, her bir lameli oyuk, oyuk başına bir mililitre TBS içeren yeni bir 24 oyuklu plakanın ayrı bir oyuğuna aktarın ve hücreleri oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcı üzerinde üç kez beş dakika boyunca yıkayın. Son yıkamadan sonra, her bir lamel üzerindeki hücreleri, az önce gösterildiği gibi uygun ikincil antikor kokteyl karışımı ile etiketleyin.

Ve lamelleri karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İkincil antikor etiketleme inkübasyonunun sonunda, hücreleri bir mililitre PBS'de üç kez yeni bir 24 oyuklu plakada, az önce gösterildiği gibi hafifçe çalkalanarak, ancak ışıktan korunarak yıkayın. Son yıkamadan sonra, tuzu çıkarmak için her bir lamel kısa bir süre deiyonize suya batırın, lamel kenarlarını bir mendil üzerine sürün ve lamelleri kabarcıklar olmadan cam mikroskop lamı başına beş mikrolitre floresan montaj ortamına dikkatlice monte edin.

Ardından lameli oje ile kapatın. Ve slaytları görüntülemeye kadar uygun şekilde saklayın. Hücreleri floresan konfokal mikroskopi ile görüntülemek için, görüntü elde etmek için uygun objektifi ve uygun floresan kanallarını seçerek başlayın.

Ardından, uygun görüntüleme yazılımını kullanarak hücrelerin görüntü yığınlarını elde edin. Tüm görüntüler yakalandığında, görüntü yığınlarını daraltmak ve yığınları TIFF dosyaları olarak kaydetmek için uygun görüntüleme analiz yazılımını kullanın. Ardından, görüntü analizi platformuna bir denetim ve deneysel bir TIFF görüntüsü yükleyin ve Sıra penceresinde kanal parametrelerini açmak için Arama Tablosu'nu seçin.

Tüm kanalları devre dışı bırakmak için kanal sekmesi onay kutularının tümüne tıklayın. Ardından kanal sıfıra tıklayın ve tercih edilen rengi seçmek için kanal sıfır renk çubuğuna tıklayın, tüm yapıları görselleştirmek için kanalın yoğunluğunu gerektiği kadar artırın. Deneysel analiz için uygun renk kanallarının her birini seçip ayarladıktan sonra, tuval sekmesini seçin ve yakınlaştırma sekmesini, görüntüleme alanı başına yaklaşık 10 hücreyi görselleştirecek şekilde ayarlayın.

Çokgen aracını kullanarak, ilgilendiğiniz hücreye tıklayın ve hücre sınırını belirlemek için çizgiyi hücrenin etrafına uzatın. Bu ilgi bölgesini adlandırmak için, ilgi alanı penceresinde, ilgilenilen hücreye sağ tıklayın ve değiştirmek için ilgilenilen bölgenin adına çift tıklayın. İlgilenilen tüm hücreleri aynı şekilde seçip adlandırdıktan sonra, algılama ve izleme sekmesinde Nokta Dedektörü uygulamasını açın.

Ön İşleme sekmesini açın ve analiz edilecek kanalı seçin. Dedektör sekmesinde, Koyu arka plan üzerindeki parlak noktaları algıla'yı seçin ve uygun ölçeği ve hassasiyeti seçin. İlgi Bölgesi sekmesi altında, diziden önerilen ilgi alanını seçin.

Filtreleme sekmesi altında, NoFiltreleme'yi seçin. Çıkış sekmesinde uygun çıktıyı seçin. İlgi alanları olarak görüntülenen önceki noktaları kaldır'ı seçin ve dosyayı kaydetmek için seçili dosya yok'u tıklatın.

Ardından, Görüntüle sekmesi altında, ilgilendiğiniz uygun seçenekleri seçin ve Algılamayı Başlat'a tıklayın. Görüntüleme analiz yazılımı içinde, nokta dedektörü, belirlenen ilgili alanların her birindeki gerilim granüllerini tanımlamak için kullanılabilir. Daha sonra, tanımlanan tüm gerilim granüllerini görüntülemek için bir ikili görüntü oluşturulabilir.

Gerilim granülü analizi, analiz edilen her bir gerilim granülü pazarına göre dikkatli bir şekilde uyarlanmalıdır. Örneğin, algılanan ilgi alanının boyut gereksiniminin değiştirilmesi veya algılama parametrelerinin hassasiyetinin değiştirilmesi farklı sonuçlara yol açar. Daha yüksek piksel boyutu ölçeklerinde, daha küçük gerilim granülleri sayılmayacak ve gerilim granüllerinin sayısı azalacaktır.

Hassasiyet artarken, stres granüllerinin sayısında bir artışa neden olur. Örneğin, bu deneyde, 100 duyarlılığa sahip iki ölçek, gerilim granül markörü G3BP1'den en iyi sonucu verdi. 55 duyarlılığa sahip iki ölçek, EIF3B stres granül markörü için en iyi sonucu verdi.

Yüzey alanı daha sonra gerilim granüllerinin boyutundan hesaplanabilir. Frekans dağılımı grafikleri, farklı hücre popülasyonları arasındaki stres granüllerinin boyutundaki kaymaları vurgulamak için kullanışlıdır. Ek olarak, floresansın yoğunluğu, analiz edilen stres granüllerinin kalitesi hakkında bilgi sağlayabilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, tüm hücre zorluğu yaklaşık altı ila yedi saat içinde yapılabilir ve analiz iki ila üç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, verilerdeki değişkenliği en aza indirmek için kontrolü ve deneysel örnekleri her zaman aynı anda ve aynı koşullar altında işlemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, analiz, gerilim granül lokalizasyonu hakkında ek bilgiler elde etmek için üç boyutlu bir hacme de genişletilebilir.

Bu yarı otomatik prosedür, enfekte olmamış ve enfekte olmuş hücrelerdeki stres granüllerinin titiz ve tarafsız bir analizine izin verir. Stres granül yolunun daha önce bilinmeyen alt versiyonlarını ortaya çıkarabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin bakterilerle nasıl enfekte edileceğini, stres granül oluşumunun nasıl indükleneceğini ve stres granüllerini kalitatif ve kantitatif bir şekilde analiz etmek için yarı otomatik bir yaklaşımın nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Shigella flexneri ve stres granülü ile klotrimazol gibi strese neden olan ajanların tehlikeli olabileceğini ve eldiven giymek, BL2 laboratuvarında çalışmak ve tüm reaktifleri uygun şekilde atmak gibi önlemlerin gerekli olduğunu unutmayın.