Name: Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Öğrenin, lazer ile lokalize edilen DNA çapraz bağlarının tek molekül analizini kullanarak hücresel hasar yanıtlarını incelemeyi. Bu yöntem, DNA onarımı alanında hasar dağılımını doğrudan görüntülemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma (Z01 AG000746-08) ve Fanconi Anemisi Araştırma Fonu Yaşlanma üzerine NIH, Ulusal Enstitüsü İntramural Araştırma Programı tarafından kısmen desteklenmiştir.

Dig-TMP hazırlanması 1. <ol><li> 50 mg (0.18 mmol) 8-trımetılpsoralen&#39;dır 4&#39;-klorometil-4,5&#39; , ve bir kuru 25 mL&#39;lik yuvarlak 590 mg (2.7 mmol) 4,7,10-trioksa-1,13-tridecanedi-amin karıştırın nitrojen altında bir şişeye -Dip. 12 saat için 10 ml toluen ve geri akış ekleyin. Indirgenmiş basınç altında, bir döner buharlaştırıcı içerisinde çözücüden çıkarın. <ol><li> Silika jel üzerinde flaş kolon kromatografisiyle artığı arıtın. (: 1: 0.5, 9), kloroform, metanol ve% 28 amonyak çözeltisi ile sütun elute. düşük basınç altında bir döner buharlaştırıcı çözücü buharlaşır ve geri saf 4 &#39;- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5&#39;, 8-trımetılpsoralen&#39;dır yapışkan sarı bir soluk sıvı. </li><li> 4, 5.5 mg (0.012 mmol) karıştırın &#39;- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5&#39;, digoksigenin NHS ester 5 mg (0.008 mmol) içindeki bir 8-trımetılpsoralen&#39;dır azot altında kuru bir yuvarlak dipli şişeye. 0.5 ml susuz dimetil formamid ekleme (DMF) bird trimetilamin 3.4 uL, 18 saat boyunca 50 ° C&#39;de karıştırın. </li><li> indirgenmiş basınç altında, bir döner buharlaştırıcı içerisinde çözücüden çıkarın. </li><li> diklorometan minimum miktarda tortu çözülür. yatay bir durağan faz olarak silis jeli ile hazırlayıcı ince tabaka levhasının alt kısmı boyunca 2 uL noktalar çözelti uygulanır. metanol: kloroform içinde hazırlayıcı TLC çalıştırın% 28 amonyum hidroksit (8: 1: 0.1). </li><li> dikey kenarlarda hariç plaka Maske ve kısa dalga boylu UV 254 nm lambası ile ürünün bandını belirlemek. Bir spatula ile plakadan kazıyın ve ürün kloroform kullanılarak saf ürün izole: metanol:% 28 amonyum hidroksit (8: 1: 0.1) karışımı ile gerçekleştirilmektedir. </li><li> indirgenmiş basınç altında, bir döner buharlaştırıcı içinde çözücüleri çıkarın. % 50 1 mL EtOH içinde kalan pelet çözülür: H2O, tüm solvent (~ 3 saat) buharlaştırılır kadar bir santrifüjlü buharlaştıncı içerisinde 1.5 ml tüpler (~ 20 kısımlar) ve kuru 50 uL&#39;lik bölümler halinde dağıtmak. </li><li>Bir santrifüjlü buharlaştıncı içerisinde yeniden H2O ve kuru:% 50 EtOH, 200 uL, her bir kısım yeniden çözündürülür. % 50 EtOH 200 uL yeniden her kısım çözülür: H2O, uzun süreli depolama için -20 ° C &#39;de santrifüj buharlaştırıcı ve mağaza peletler kuru. </li></ol></li><li> H2 O, 1 hazırlayın: H2O içinde çözülmüş Dig-TMP 100 seyreltme ve 250 nm &#39;de OD ölçümü kullanmak için,% 50 EtOH 50 uL pelet çözülür. Dig-TMP ekstinksiyon katsayısı 25.000&#39;dir. -20 ° C&#39;de muhafaza edildiğinde çözeltisi yaklaşık bir ay boyunca stabildir. Her kullanımdan önce, 250 nm &#39;de OD ölçümü ile konsantrasyonunu kontrol edin. <ol><li> Stok konsantrasyonu hesaplanır: Abs x 100 x 10 (uM olarak) 6 / 25,000 = Konsantrasyon. Tipik olarak, stok çözeltisi, yaklaşık 3 mM&#39;dir. Ortama ilave EtOH hacmini en aza indirmek için, bu aralık içinde olması önem taşımaktadır. </li></ol></li></ol> 2. Lazer Lokalize Dig-TMP ICLs <ol><li> peBir SRS azot lazeri (337 nm) ile bir eş odaklı mikroskop ile rform lazer lokalizasyonu 365 nm&#39;lik bir çizgi yayan ve 0.7 nW bir güç ile, 10 Hz, 3 ns darbeleri ateşleme bir boya hücresi içinden pompalanır. </li><li> 35 mm cam tarafında dikey bir işaret koyun bir işaret kalemi ile hücre kültür çanağı tabanı. Bir elmas kalem ile kültür yüzey üzerinde cam merkezinde bir çapraz kaşı bu çanak tarafındaki siyah şerit çapraz bir kol üstünde olduğundan emin olun. Bu ve hücreler aynı odak düzleminde olacak şekilde enine cam büyüme yüzeyi üzerine işaretlenir. </li><li> % 70 EtOH durulama ile işaretlendikten sonra plaka sterilize edin. Hücreleri kaplama önce kuru. </li><li> ortada plakası hücreleri (örneğin, HeLa veya U2OS gibi standart laboratuar suşları) bir ya da iki gün önce kültür kaplarına oldu. Hücre aktif olarak bölünen ve deney günü% 50-70 konfluent olmalıdır. eşit etiket DNA 1 uM 5-kloro-2-deoksiüridin (CldU) ile 24 saat inkübe edin. </li><li> Eklemek% 50 EtOH Dig-TMP: 20 uM nihai konsantrasyona kadar hücre kültürü ortamına H2O. 37 ° C&#39;ye kadar ortam getirin. Inkübatörde hücre ve yer üzerinde orta değiştirme (37 ° C,% 5 CO2) 30 dakika Dig-TMP dengeye gelmesine izin vermek için. </li><li> Hücreler kuluçka iken, lazer aktif olduğu görüş alanının x / y koordinatlarını belirlemek. Lazer, yatay ve diyagonal bir hat boyunca yansıtılmış cam slayt etch yazılım tarafından yönlendirildiği üreticinin kalibrasyon prosedürünü izleyin. iki satır lazer hedef grev hangi alanın sınırlarını tanımlar. </li><li> Mikroskop sahnede kontrol CO2 ve nem ile 37 ° C &#39;de, çevre odasında plaka koyun ve çapraz kesiştiği 60X yağa amacı ile odaklanır. </li><li> yazılım şekil aracıyla araştırmacı tarafından kurulmuş bir ROI, 365 nm lazer ışını doğrudan, 3 ve bir şerit oluşturmak üzere# 181; 0.6 um mx. ROI anahat haç kesiştiği hemen yakınında bulunan hücrelerin çekirdeklerinde imleç tarafından yerleştirilir. çekirdek boyunca lazer yarıda hedef z odak düzlemi ayarlayın. 350-370 nm aralığında bir lazer kullanın. 405 nm lazer çapraz bağ 19 neden olamaz. NOT: diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntülemede nükleolazma ayırt edilebilir nükleol dışında nükleoplazmik alanlarda yatırım getirisini bulun. </li><li> Bir hücreyi (hücre karartmak ve ardından kaybolur) yoketmek için yeterli bir seviyeye güç ayarını artırarak lazer odak ve aktivitesini kontrol edin. Bu mikroskopta ve sonra lamel içinden ve hücrelere lazer için engelsiz bir ışık yolu için önemli bir tanı olduğunu. <ol><li> psoralen ve ICL uyarılan DDR (bu her lazer / mikrofon için ampirik olarak tespit edilmelidir aktive etmek için yeterli güç ayarını düşürünroscope kombinasyon). (Γ-H2AX oluşumu ile izlenmiştir) psoralen yokluğunda DDR aktif olmayan bir lazer yoğunluğu ayarını (burada% 1.7) kullanın. NOT: Bu önemli bir belirlenmesidir ve lazer kaynağı veya ışık yolu bir bileşen değiştirilirse ayarlarının yapılmasını gerektirebilir. GFP birikimi lazer psoralen çizgili tür hızlı bir şekilde (saniye olarak) ortaya çıkar, her ikisi de XPC veya OPT_FAN1 gibi tamir etiketli proteinlerin izleyin, ancak tek başına lazer maruz ROI için değil. Birkaç dakika diğerleri için gerekli olabilecek iken DDR Bazı proteinler, saniyeler içinde görünür. Ilgi her protein için zaman ders saptamaları yapmak gereklidir. Biz de lazere maruz kalmamış hücrelerden yanıt proteinlerin hiçbir çizgiler olduğunu unutmayın. </li></ol></li><li> Bir alandaki tüm hücreler haç kesiştiği yakın kalarak hareket ettiremeyecek yeni bir alana plaka hedeflenmiş sonra. </li><li> deneylerde unsurlar için tasarlanmışarası lezyon mesafelerin dağıtım kesişme 20-25 alanları (4-5 hücre / görüş alanı), lazere hücreler maruz ine. lokalize ICLs yakın çoğaltma kalıpları analiz etmek için lazer atışı sonrasında 10 uM 5-İyodo-2-deoksiüridin (DUK) ile hücrelerin inkübe edin. NOT: DUK ile inkübasyon süresi biraz keyfi olduğu. Bu, 20 dakika kadar kısa ve en fazla 60, min (aşağıya bakınız) olarak kullanılmıştır. Daha uzun bakliyat (birkaç saat) genellikle böylece görüntüye tek çatal ilerlemesini fırsat kaybediyor, kaynaştırma çoklu çoğaltma yolları ile sonuçlanır. Bazı deneylerde, ces çoğaltma yolları darbe etiketleme ve ardından Dig-TMP maruz bırakılmadan önce etiket DNA muntazam üzere 24 saat boyunca CldU ile etiketlenmiştir. </li></ol> 3. Hücreleri hasat ve DNA Liflerin germe <ol><li> Sahneden plaka çıkarın orta kaldırmak ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkanır. PBS çözüm çıkarın. Ticari bir tripsin 10 mcL damla yerleştirin/ Cam yüzeyinin ortasında çapraz kesişme EDTA çözeltisi. </li><li> Oda sıcaklığında (RT) 3-4 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra pipet ucuna müstakil hücreler tripsin solüsyonu çizin. tripsin nötralize etmeye gerek yoktur. </li><li> bir silanize cam mikroskop lamı bir ucunda hücreler tripsin / EDTA damla yerleştirin. Hücreleri, ve kurumaya havuzun çevresini sağlayan,% 0.5 SDS çözeltisi 10 uL eklenmesiyle DNA&#39;yı serbest bırakmak ve pipet ucu ile hafifçe karıştırılarak oda sıcaklığında 3-4 dakika inkübe edilir. </li><li> slayt eğin 20 ° ve sıvı aşağı ucuna çalışmasına izin verir. DNA, lifler akan sıvının hidrodinamik kuvvetler tarafından gerilir / uzatılır. Slaytlar kuru hava (yaklaşık 10 dakika) izin 3 düzeltmek: 10 dakika için 1 metanol / asetik asit. Tekrar düzeltme çözümü ve kuru hava slaytları çıkarın. Bu noktada, -20 ° C&#39;de% 70 EtOH içinde süresiz olarak saklanabilir. % 70 EtOH çıkarıldıktan NE önce kurumaya bırakınxt adım. </li><li> PBS içinde slaytlar yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca 2.5 M HCl içinde denatüre. Bu işlem, DNA antikorlara dahil halojenlenmiş nükleobaz erişilebilir hale depurinates. </li><li> 0.4 M Tris-HCI, pH 7.4 içinde kayar nötralize. PBS içinde iki kere yıkayın /% 0.5 Tween-20 (PBST) her biri 5 dakika için. </li><li> Blok PBS içinde% 5 sığır serum albümini (BSA) ve% 10 keçi serumu ile kayar. slayt üzerine eşit bir şekilde bloke çözeltisi yayılır ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona bir parafilm yavaşça slaytlar örtün. </li><li> 1 pipetleyin 100 uL: sıçan anti-bromodeoksiüridin çözümü engelleme 200 seyreltme Her bir slayt, birincil antikor (özellikle CldU tespit eder). Oda sıcaklığında 1 saat boyunca nemlendirilmiş bir odada sürgü üzerinde eşit olarak seyreltme yayılmış ve inkübasyona bir parafilm yavaşça slaytlar örtün. parafilm çıkarın ve 5 dakika her biri için slaytlar PBST üç kez yıkayın. </li><li> Her bir slayt çözüm engelleme: (1: 100) keçi anti-fare Alexa Fluor 647 seyreltilmiş pipetleyin 100 uL. KapakBir parafilm nazikçe kayar ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir. 5 dakika her biri için slaytlar PBST üç kez yıkayın. </li><li> 200: seyreltilmiş (1:40) fare anti-bromodeoksiüridin pipetleyin 100 uL primer antikor ile ve tavşan anti-DIG antikoru (1 (. LDU ve CldU Bu çift özgüllük sıçan inkübasyondan önce anti BrdU ile CldU bloke gerektiren tespit eder) ) her bir slayta çözüm engelleme. bir parafilm yavaşça slaytlar kapatılır ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca nemlendirilmiş bir odada kuluçkaya. 5 dakika her biri için slaytlar PBST üç kez yıkayın. </li><li> Her bir slayt çözüm engelleme keçi anti-tavşan prob (örneğin, Qdot 655) (: 1: 100), keçi anti-fare Alexa Fluor 488 andC (5.000 1) ile seyreltildi pipetleyin 100 uL. nazikçe parafilm slaytlar örtün ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir. 5 dakika her biri için slaytlar PBST üç kez yıkayın. </li><li> bir kağıt havlu üzerine aşırı PBST boşaltın. Her bir slayt üzerine antifade montaj orta 50 uL ekleyin ve bir lamel ile kaplayın. Görüntü veya mağaza için-20 ° C de bir fazla 48 saat. </li></ol> Floresan mikroskobu ile 4. Fiber Görüntüleme <ol><li> FITC, Cy5 ve Q Dot 655 algılama ile ekli bir tam motorlu filtre çarkı ile bir inverted mikroskop ile 63X objektif ile görüntü alımı gerçekleştirin. Uyarma filtresi 425 nm ve emisyon filtresi emisyon tepe 20 ortalanan 20 nm ile 655 nm arasındadır. </li></ol>

<ol><li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intrinsic+Fragility+of+DNA+%28Nobel+Lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).</li>
<li>Sirbu, B. M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response%3A+three+levels+of+DNA+repair+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage response: three levels of DNA repair regulation.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272(2013).</li>
<li>Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+protein+dynamics+and+DNA+repair+following+generation+of+DNA+double-strand+breaks+at+defined+genomic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).</li>
<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).</li>
<li>Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+DNA+repair+proteins+following+laser+microbeam+induced+DNA+damage+-+when+is+a+DSB+not+a+DSB%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB?</a> Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+DNA+double-strand+breaks%3A+production%2C+fidelity+of+repair%2C+and+induction+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+dose-rate+effects%2C+endogenous+DNA+damage%2C+and+signaling+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).</li>
<li>Aguilera, A., Garcia-Muse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+of+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Causes of genome instability.</a> Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).</li>
<li>Swenberg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+versus+exogenous+DNA+adducts%3A+their+role+in+carcinogenesis%2C+epidemiology%2C+and+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment.</a> Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).</li>
<li>Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structures+of+psoralen+cross-linked+DNAs%3A+drug-dependent+formation+of+holliday+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions.</a> J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).</li>
<li>Lai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+DNA+interstrand+cross-links+and+monoadducts+formed+in+human+cells+induced+by+psoralens+and+UVA+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation.</a> Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).</li>
<li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).</li>
<li>Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+laser-localized+DNA+interstrand+cross-links+in+G1+phase+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells.</a> J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).</li>
<li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+oxidatively+induced+clustered+DNA+lesions+in+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues.</a> Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).</li>
<li>Meyer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).</li>
<li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> J Vis. Exp. (56), e3255(2011).</li>
<li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-+molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li>
<li>Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+large-scale+synthesis+of+psoralen+furan-side+monoadducts+and+diadducts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+translocase+FANCM%2FMHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Analysis+of+Laser+Localized+Interstrand+Crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks.</a> Front Genet. 7, 84(2016).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+making+it+safe+to+play+with+knives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).</li>
<li>Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+monoclonal+antibody+recognizing+ultraviolet+light-induced+%286-4%29+photoproducts%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts.</a> Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).</li>
<li>Poirier, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisera+specific+for+carcinogen-DNA+adducts+and+carcinogen-modified+DNA%3A+applications+for+detection+of+xenobiotics+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples.</a> Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).</li>
<li>Henderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+G-quadruplex+DNA+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Lazer lokalizasyon teknolojisi parlak alan mikroskopisi de görebilir çekirdekleri yapışan hücrelerin kullanımını gerektirmektedir. Böyle polilisin veya kolajen veya daha fazla kompleks karışımlar olarak hücre yapıştırma preparatları ile cam yüzeyine, örneğin primer lenfositler, ya da AD293 olarak gevşek bir şekilde yapışık kültürlenmiş hücreler gibi yapışmayan hücreler, takmak için çalışılmıştır. bu tedaviler yüzeye hücreleri bağlamak olsa bile, genellikle çok zor çekirdekleri içine odaklanmak için yapım yuvarlak kalmak...

DNA, ek olarak, bu oksidatif metabolizma tarafından üretilen endojen radikal türleri tarafından saldırıya vb radyasyon, ultraviyole ışık, çevresel toksinler, yanma ürünleri gibi eksojen maddeler sürekli saldırı altındadır. Bunların hepsi, kimyasal veya fiziksel olarak DNA 1 bütünlüğünü bozmak için potansiyele sahiptir. genomunda pertübasyonlar lezyon onarımında yer alan proteinleri ve mikroRNA binlerce değilse, yüzlerce, DNA hasarına (DDR), bir işe ve post-translasyonel modifikasyonlar kaskadını aktive edebilirler, hücre döngüsü, apoptoz, yaşlanma ve inflamatuar yolların düzenlenmesi 2. DDR hakkındaki bilgilerin çoğu DSBs ile çalışmalardan gelmektedir. Bunun nedeni canlı hücreler 3&#39;te genomik DNA&#39;da, sekans spesifik sonları dahil, sonları tanıştırmak için teknolojilerin kullanılabilirliği büyük ölçüde olduğunu. Buna ek olarak, propensitsonları y immünofloresansla görüntülenebilir DDR proteinlerin odakları indükleme, kinetik ve yanıt proteinlerinin gereksinimlerini tanımlanması için yararlı olmuştur. DDR eğitimi için anahtar teknolojilerden biri canlı hücreler 4 çekirdeklerinde bir &quot;İlgi Bölgesi&quot; içinde DSBs bir şerit yönlendirmek için (YG) bir lazer ışını kullanılır Bonner ve arkadaşları tarafından tanıtıldı. Aslında, onlar DDR proteinler Immünofloresan tarafından tespit edilebilir ki uzun bir odak oluşturdu. Bu lazer maruz bırakılmış hücreler içinde fosforile histon H2AX güçlü şerit (γ-H2AX) kendi gösterilmesiyle izah edildi. O zamandan beri, lazer yaklaşım DSBs tarafından uyarılan DDR sayısız çalışmalarda kullanılmıştır. Güçlü ve popüler ve dramatik immünfloresans görüntülerin kaynağı olsa da, lezyon kimlik kaygısı olmadan, gözlemlenebilir sonuçlar üretmek üzere en deneylerinde lazer yoğunluğu ayarlanır unutulmamalıdıryoğunluk ya da aralık. Gerçekten de, tahminler yapmak zor olabilir. Böylece büyük ölçüde lazerler 5 ile DNA içine lezyonların çokluğu rağmen göz ardı edilir. Bu literatürde 6&#39;da birçok çelişkiler katkıda bulunur. DSBs aksine, DNA&#39;nın çoğu kimyasal modifikasyonlar, DDR proteinlerin ayrı kümelerle oluşumunu teşvik etmemektedir. Bu lezyon frekanslarının mevcut anlayış ışığında önemlidir. Kültürde insan hücreleri S fazında 7, 8, 9 sırasında büyük ölçüde oluşan hücre döngüsü başına 50 kadar DSBs, tabi olduğu tahmin edilmiştir. Daha az çoğalmayan hücrelerden oluşur. Bu hücre / gün 1, 10 başına binlerce olan nükleobaz kayıp veya değişiklik olaylarının sayısı ile tezat teşkil etmektedir. Böylece, en biliyorNispeten nadir bulunur ve bütünüyle çok daha yaygındır sarmal bozan lezyonlar, neden oldukları hakkında çok az olan olaylar neden olduğu DDR. Genomik DNA modifikasyonları kovalent hücresel yanıtı hakkında sorulara cevap bulmak amacıyla, biz doğal DDR indüksiyon aktivitesine sahip bir helezon bozan DNA adükt ile çalışmak istediğini. Dahası, deneysel tasarım kolaylaştırmak ve yorumlama kimin giriş zamana göre kontrol edilen ve görselleştirme edilebilir niteliktedir edilebilecek bir yapıda ilgi için. Buna göre, psoralen dayalı bir strateji geliştirdi. siteleri: AT psoralenler de 5&#39; TA lehine fotoaktif DNA araya karakterize edilir. nitrojen hardalları ve mitomisin C (MMC) uzun dalga UV (UVB) ışığa maruz sürece, DNA reaktif değildir gibi diğer çapraz bağlama maddeleri aksine. birleştirilmiş moleküller sarmal bozan içi çapraz bağlantılar üretebilme karşıt şeritler üzerindeki timin bazların (ICLs ile reaksiyona) 11. Deneylerde kullanılan trimetil psoralen ile en ürünleri oluşmadığı nispeten az monoadüktler içeren gruptan (% 10&#39;dan az) oluşturulur ICLs, 12 ve bir iplik üzerindeki bitişik bazlar arasında şerit-arası çapraz bağları olan. bunlar sis-platin ve MMC gibi replikasyon ve transkripsiyon, psoralen ve diğer çapraz bağlama maddeleri, güçlü blok için, yaygın olarak kemoterapi kullanılır. Bu nedenle, psoralen bir helis bozan yapı ile DDR aktivasyonunu takip ve aynı zamanda klinik öneme sahip bir bileşiğin hücresel tepki ilişkin bilgi temin çalışmalar sağladı. Bu trimetil psoralen digoksijenin (DIG) ile bağlantılı olduğu bir reaktif sentezlenmiş, bir bitki sterol memeli hücrelerinde bulunan ve sık sık bir immunotag olarak kullanılmaz. fotoaktivasyon şartı canlı hücrelerde çekirdek tanımlanan ROI içinde psoralen ICLs lazer ışığına (365 nm) ile konumlandırılmasına olanak vermektedir. Bunlar imm tarafından görüntülenebilirKazı etiketine karşı unofluorescence. DNA onarımı ve DDR proteinleri ICLs 13, 14 lokal lazer çizgili ortaya çıktı. DSBs üretilmesi için kullanılan yüksek lazer yoğunlukları ile aktive DDR izole edilmiş ya da kümelenmiş hasar 15, 16 nedeniyle olabilir. Sonuç olarak, bu deneyden elde edilen sonuçlar ile ilgisi doğal lezyonlar, bu çok daha düşük bir konsantrasyonda meydana için, kesin değildir. DNA psoralen adükt sıklığı ve aralığı ile ilgili benzer soruları için, DNA elyaf teknolojisi 17 ve immunoquantum noktaların yararlandı. Kuantum nokta floresan boyalar daha parlak ve ışığa maruz kalma ile ağartılmış değildir. Bu nedenle sık sık, tek molekül görüntüleme 18 için kullanılan bir uygulama olan floresan boyalar yeterince parlak. Bireysel DNA lifler g üzerinde gerilebilirkız slaytlar ve hasat hücre önce inkubasyon sırasında dahil nükleosid analogları karşı immünofloresansla görüntülenebilir. Biz Dig-psoralen ile hücreleri tedavi ve lazer mikro ışınımına yatırım getirisi teşhir etti. Elyaf immunoquantum noktalarla görüntülenebildi hücrelerin ve tek tek Dig-psoralen adüktleri hazırlanmıştır. nispeten kısa sürelerde (20-60 dakika), nükleozid analogları ile hücrelerin maruz lazer lokalize ICLs yakın çoğaltma yolları görüntü ile birlikte.

<table><tbody><tr><td>Digoxigenin NHS esteri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11333054001</td><td></td></tr><tr><td>Kloro-psoralen</td><td>Berry ve Ortakları</td><td>PS 5000</td><td></td></tr><tr><td>diaminoglikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>369519</td><td>4,7,10-Trioksa-1,13-tridekanediamin</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Akros Organikler</td><td>423550040</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4524</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5002</td><td></td></tr><tr><td>TLC plakaları</td><td>Analtech, Inc.</td><td>P02511</td><td></td></tr><tr><td>Flass cam kolon 24/40, 100 mL</td><td>Chemglass Yaşam Bilimleri</td><td>CG-1196-02</td><td></td></tr><tr><td>Nikon T2000_E2 eğirme diski konfokal mikroskop, otomatik kademe ve çevre kontrol odası ve plaka tutucu ile donatılmıştır</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Volocity Yazılımı</td></tr><tr><td>Micropoint Galvo&nbsp;</td>Azot darbeli lazer ile <td>Andor Teknolojileri</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>boya hücresi</td><td>Andor Teknolojileri</td><td>MP-2250-2-365</td><td></td></tr><tr><td>365 boya</td><td>Andor Teknolojileri</td><td>MP-27-365-DYE</td><td></td></tr><tr><td>IdU&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17125</td><td></td></tr><tr><td>35 mm cam botomm plakalar 1.5 lamel , 10 mm cam çapı, kaplamasız</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop slaytları</td><td>Yeni Gelen Tedarik</td><td>Parçası # 5070</td><td>Yeni Silan</td></tr><tr><td>Slaytları Fare anti BrdU antikoru (IdU)</td> <td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>40'ta 1</td></tr><tr><td>Sıçan anti BrdU Antikoru (CldU)</td> <td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>200'de 1 & nbsp;</td></tr><tr><td>Tavşan anti Dig antikoru</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>710019</td><td>200'de 1</td></tr><tr><td>Q-dot 655 keçi anti Tavşan IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q-11421MP</td><td>5.000'de 1</td></tr><tr><td>AF647- keçi anti Sıçan IgG</td><td>Jackson İmmünoresearch</td><td>112-605-167</td><td>100'ü 1 arada</td></tr><tr><td>AF488-keçi anti fare IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-545-166</td><td>100'ü 1 arada</td></tr><tr><td>Zeiss epifloresan mikroskop A200</td><td>Zeiss</td><td></td><td>&nbsp; Axiovision yazılımı</td></tr><tr><td>Q-dot 655 filtre</td><td>Chroma</td><td>39107</td><td></td></tr> ile</tbody></table>

lazer lokalize psoralen adüktlerinin tek molekül analizi

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

DNA hasarı yanıt (DDR) yaygın olarak canlı hücreler lazer mikro ışın demeti radyasyonu ile indüklenen çift iplik kırılmaları (DSB&#39;ler) çalışmalarında karakterize edilmiştir. DDR kol içi çapraz bağlantılar DNA (ICLs) de dahil olmak üzere kovalent DNA modifikasyonları bozucu sarmalı için, hem de tanımlanmamıştır. Biz canlı hücrelerin çekirdeklerinde, immunotagged psoralenler laser fotoaktivasyon tarafından lokalize ICLs tarafından uyarılan DDR, inceledik. yaklaşımlı dağıtım ve çoğaltma çatal karşılaşmalar hakkında temel sorulara cevap bulmak amacıyla, biz iki diğer teknolojilerle lazer yerelleştirme birleştirdi. DNA, elyaf genellikle kısa darbeler sırasında eklenen nükleosit analoglarının immünofloresansla replikasyon çatalları ilerleyişini görüntülemek için kullanılır. Immunoquantum noktalar yaygın tek bir molekül görüntüleme için kullanılmıştır. yeni bir yaklaşım ise, lazer lokalize ICLs taşıyan hücreler DNA lifler mikroskop lamı üzerine yayılır. Etiketlenmiş ICLs immunoquantum noktalar ve inci ile görüntülenirE arası lezyon mesafeleri tespit edilmiştir. ICLs ile Çoğaltma çatal çarpışmalar görülebilir ve farklı karşılaşma desenler belirlendi ve miktarı belirlenir.

Lazer lokalize Dig-TMP (Şekil 1A) ICLs psoralen ile bağlantılı Dig-etiketine karşı immünofloresansla görüntülenebilir. Lazer, herhangi bir konturun bir alanda vurmaya yönelik olmasına rağmen, şeritler hücrelerde &quot;doğal&quot; biçimleri değildir ve yasal sinyalleri kolayca Primer ya da sekonder antikor ile spesifik olmayan bağlanma için eserler ayırt edilebilir. Mükemmel özgüllük daha az antikorlar kullanılırken bu özellik yararlıdır. Dig-TMP ICLs bir şerit DDR, y-H2A...

Lazerler sıklıkla DNA hasarına hücre tepkisinin çalışmada kullanılır. Bununla birlikte, normal koşullar altında, aralık, sıklık, ve çarpışmalar çoğaltma çatal nadiren karakterize lezyonlar üretir. Burada, lazer lokalize kol içi çapraz bağlar ile bu parametrelerin belirlenmesini sağlayan bir yaklaşım açıklar.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Bu prosedürün genel amacı, DNA zincirler arası çapraz bağlara karşı hücresel yanıtları incelemek amacıyla, genomik DNA'daki lazerle lokalize edilmiş zincirler arası çapraz bağların dağılımının tek molekül analizini gerçekleştirmektir. Bu yöntem, yaygın olarak kullanılan deneysel bir araç olan lazer teknolojisi ile oluşturulan DNA lezyonlarının dağılımına ilişkin, DNA onarımı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, lazerle aktive edilen bileşik tarafından genomik DNA'ya yerleştirilen DNA lezyonlarının doğrudan görüntülenmesine olanak sağlamasıdır.Bu daha önce mümkün değildi. Prosedürü laboratuvarımızdan Julia Gichimu ve Hima Gali gösterecek. Hedefleme lazeri her kullanıldığında, lazerin uygun XYZ koordinatlarına vurduğunu doğrulamak ve lazerin vurabileceği, kamera tarafından yakalanan alanın sınırlarını belirlemek için bir ayna slayt kalibrasyonu yapmak önemlidir.Slaytta daha önce aşındırılmış bir alan bulun. Pozlama süresini ve lazer gücünü ayarlayın. Ardından, ayna slayt üzerindeki yakın bir hedef dışı alana geçmek için odağı ayarlayın.Kalibrasyon prosedürünü başlatın. Yazılım, ayna lamını yatay ve diyagonal çizgiler boyunca aşındırmak için lazeri ateşleyecektir. Bu çizgiler, lazerin hedef hücreye vurabileceği alanın sınırlarını belirler.Alan içerisinde birkaç ilgi bölgesi (ROI) belirleyin ve lazeri ateşleyerek seçili alanları hedeflediğini ve böylece uygun XYZ koordinatlarına vurduğunu doğrulayın. Mikroskop hedefleme lazer sisteminin kurulumu sırasında biyolojik bir kalibrasyon da gerçekleştirilmelidir. İlk adım; trimetilpsoralen'i (TMP) fotoaktive etmek, zincirler arası çapraz bağlar oluşturmak ve kinetikleri önceden karakterize edilmiş olan GFP etiketli bir onarım faktörünün katılımını tetiklemek için gerekli olan minimum lazer gücünün belirlenmesidir.Bu laboratuvarda, GFP fan one eksprese eden bir plazmid ile stabil olarak transfekte edilmiş bir U2OS hücre hattı kullanılmaktadır. Burada gösterildiği gibi, hücreler 6 µM TMP ve %1,2 lazer görüntüsüne 10 dakika boyunca maruz bırakıldığında, görüntü dizisinin bir video olarak izlenmesi GFP fan one'ın hedeflenen ROI'ye (ilgi alanı) toplandığını doğrulamaktadır. İkinci adım, bu güç ayarının bileşik yokluğunda toplamayı tetiklemediğini doğrulamaktır.Burada gösterildiği gibi, hücreler 10 dakika boyunca yalnızca %1,2 lazerle maruz bırakıldığında ve görüntü bir video olarak izlendiğinde, hedeflenen ROI'ye GFP fan oneyle ilgili herhangi bir göç gözlemlenmemektedir. Üçüncü olarak, bir hücreyi dışarı püskürtebilecek minimum güç ayarının belirlenmesi önemlidir. Bu güç ayarında bir hücreyi dışarı püskürtme yeteneği, hedefleme lazerinin kullanıldığı her gün rutin bir biyolojik kalibrasyon olarak test edilmelidir.Nükleollerden kaçınarak ROI'yi çekirdek içine ayarlayın. Odağı düzenleyin. Lazer gücünü %12'ye ayarlayın ve ateşleyin.Son olarak, doğru hedefleme sağlamak için odak düzleminin hücrenin ortasına ayarlanması gereklidir. Bunu göstermek amacıyla üç hücre, üç farklı odak düzleminde hedeflenmiştir. Hücre ortası.Çok yüksek. Ve çok düşük. Hedeflemeden üç dakika sonra, görüntülenen odak düzlemi boyunca GFP fan one şeridinin dağılımını incelemek için üç mikronu kapsayan bir görüntü yığını oluşturulur.Sadece hücrenin orta kısmına hedeflenen hücre, tüm Z düzlemlerinde tek bir şerit şeklinde GFP yelpazesi gösterir. Lazer lokalizasyonunu gerçekleştirmeden önce, hücreleri büyütmek için 35 milimetrelik cam tabanlı hücre kültürü kapları hazırlayın. Bir markör kalemle, her kabın yan tarafına dikey bir işaret koyun.Kültür yüzeyindeki camın merkezine, tabağın yan tarafındaki siyah şeridin haçın bir kolunun üst kısmına denk geleceği şekilde, elmas uçlu bir kalemle bir haç çizin. Haç, kendisi ve hücreler aynı odak düzleminde olacak şekilde camın büyüme yüzeyine işaretlenir. Hücreleri, sterilize edilmiş ve haç ile işaretlenmiş kültür kaplarına ekleyin ve DNA'yı tekdüze olarak etiketlemek için bir mikromolar beş kloro doksideüridin içeren ortamda 24 saat inkübe edin.Deney günü, digoksigenin bağlantılı TMP veya %50 etanol içinde dig TMP'yi, hücre kültürü ortamına 20 micromolar nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin. Ortamı 37 degrees Celsius'ye getirin. Kültür kaplarındaki ortamı, dig TMP içeren ortamla değiştirin ve dig TMP'nin dengelenmesi için 37 degrees Celsius ve %5CO2'de 30 dakika boyunca inkübe edin.Hücreler inkübe olurken, daha önce gösterildiği gibi ayna lam kalibrasyonunu ve bir hücrenin %12'lik blow out işlemini gerçekleştirin. Plakayı, mikroskop tablası üzerindeki 37 °C sıcaklıkta, kontrollü CO2 ve neme sahip çevresel hazneye yerleştirin. 60X yağ daldırma objektifi ile artı işaretinin kesişim noktasına odaklayın.Hedeflenecek ilk alanı seçin ve artı işaretinin kesişim noktasının hemen yakınında bulunan münferit hücrelerde ROI'leri belirlemek için şekil aracını kullanın. Nukleollerin dışındaki nükleoplazmik alanları seçin. Lazerin çekirdeklerin ortasına odaklanması için Z odak düzlemini ayarlayın.Ardından, güç ayarını, zincirler arası çapraz bağ ile indüklenen DNA hasarı yanıtındaki psoralen'i aktive etmek için gereken minimum seviyeye ayarlayın. Burada %1,2 kullanılır. Lazeri ateşleyin.Bir alandaki tüm hücreler hedeflendikten sonra, haç kesişimine yakın kalarak plağı yeni bir alana taşıyın. Toplam 80 ila 100 hücreyi hedeflemek için az önce gösterilen prosedürü 12 ila 18 alanda tekrarlayın. Hücreleri toplamak için kültür kabını sahneden çıkarın.Besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri PBS çözeltisi ile yıkayın. PBS'yi uzaklaştırın ve cam yüzeyin ortasındaki çarpı işaretinin kesişim noktasına 10 µL ticari tripsin EDTA çözeltisi damlatın. Oda sıcaklığında üç ila dört dakika inkübe edin ve ardından ayrılmış hücreleri içeren tripsin çözeltisini bir pipet ucuyla çekin.Hücrelerin bulunduğu tripsin EDTA damlasını silanize cam mikroskop lamının bir ucuna yerleştirin. Hücreleri liz etmek ve DNA'yı serbest bırakmak için 10 µL %5 SDS çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında üç ila dört dakika inkübe edin; bu sırada pipet ucuyla nazikçe karıştırarak havuzun kenarlarının kurumasına izin verin. Lamı 20 derece eğerek sıvının uca doğru akmasını sağlayın.Akan sıvının hidrodinamik kuvvetleri DNA fiberlerini uzatacak ve gerecektir. Slaytın 10 dakika boyunca havada kurumasına izin verin. Slaytı, üç birim metanol ve bir birim asetik asitten oluşan bir çözeltiye daldırın ve 10 dakika boyunca fiksasyon yapın.Ardından lamı tespit çözeltisinden çıkarın ve tekrar havada kurutun. Bu aşamada lam, 20 °C'de %70 etanol içerisinde süresiz olarak saklanabilir. Floresan mikroskobu ile DNA lifleri üzerindeki dig sinyallerinin tespiti için lamı hazırlamak üzere, gerilmiş DNA içeren lamı %70 etanol çözeltisinden çıkarın ve havada kurumaya bırakın.Ardından DNA liflerini hidroklorik asit ile denatüre edin ve nötralizasyon için pH 8'de tris hidroklorür içeren bir kaba aktarın. Daha sonra örnekleri PBS ile yıkayın. Son olarak, daha önce yayınlanmış bir prosedürü takip ederek uygun antikorlarla boyayın.Dioxigenin etiketli trimetilpsoralen yapısı gösterilmektedir. Zincirler arası DNA çapraz bağları veya ICL'ler, dig TMP'ye karşı immünofloresan ile görüntülebilir. Bu örnekte, kırmızıyla görüntülenen lazerle lokalize edilmiş ICL'leri içeren ROI'lerde, DNA hasar yanıtının iyi bilinen bir belirteci olan ve yeşil renkle görselleştirilen gamma H2AX birikimi olan hücreler gösterilmektedir.DAPI ile boyanmış çekirdek mavidir. Aydınlık alan, elmas kalemle yapılmış işaretin kısmen üzerindeki bir hücreyi göstermektedir. ROI'lerin nukleollerin dışına yerleştirildiğine dikkat ediniz.Adduktların sıklığını ve aralıklarını belirlemek için, ICL'lerin verilmesinden önce hücreler 24 saat boyunca beş kloro deoksiridin ile inkübe edildi. Hücreler hasat edilip DNA fiberleri yayıldıktan sonra, dig sinyalleri kırmızı renkte görselleştirilen bir amino kuantum noktası ile, beş kloro deoksiridin ise yeşil renkte görselleştirilen amino floresans ile tespit edildi. Fiberler üzerindeki dig sinyallerinin analizi, inter-ICL mesafelerinin 10 KB'den az ile 160 KB'den fazla arasında değiştiğini ortaya koydu. Kümelenmiş adduktlara dair herhangi bir kanıt bulunmadı.Bu kılavuzlar takip edilerek, bu yaklaşımın uygun dalga boyundaki lazerlerle lokalize edilebilen oksidatif lezyonlar gibi diğer DNA adüktlerine genişletilmesi mümkün olmalıdır.

single-molecule-analysis-of-laser-localized-psoralen-adducts

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu video, tek bir hücreden protein salgılarını tespit etmek için lokalize yüzey plazmon rezonans görüntülemeyi gösterir. Mikroakışkan bir kurulum ve peptit bağlı bir plazmonik nanoyapı çipi kullanarak, rezonans açısında yansıyan ışık yoğunluğundaki değişiklikler, tek bir hücreden salgılanan proteinlerle etkileşimleri ortaya çıkarır.

Tek Bir Hücreden Protein Salgılarını Tespit Etmek için Lokalize Yüzey Plazmon Rezonans Görüntüleme

Biz HF yerinde değişiklik 2 O 2 / H2O çözeltisi (% 0.01% -0.5) ya da metanol solüsyonları H dolu mikroakışkan odaları örnekleri ışınlanması ile hidrofilik veya hidrofobik duruma Si (001) yüzeyi ile tedavi edilmiş bir süreci rapor göreceli düşük nabız akıcılığa darbeli UV lazer kullanarak.

Sıvı Ortamda Darbeli UV Lazer Radyasyonla Silikon Yüzey Islanabilirliği Seçici Alan Değişikliği

Elektron spektroskopik görüntüleme, nükleik asidi proteinden nanometre çözünürlükte görüntüleyebilir ve ayırt edebilir. Transmisyon elektron mikroskobu örneklerinde etiketli proteinleri özel olarak etiketleyebilen miniSOG sistemi ile birleştirilebilir. Örnek olarak çift iplikli kopma onarım odaklarını kullanarak bu teknolojilerin kullanımını gösteriyoruz.

Elektron Spektroskopik Görüntüleme Kombinasyonunun miniSOG Etiketli DNA Onarım Proteinler Görselleştirme (ESI)

Bu protokol lazer microirradiation DNA hasar, nispeten basit kırılmalara ve DNA hasar sinyal ve onarım faktör montaj hasar sitelerde içinde vivo çalışmaya karmaşık hasarı gibi farklı türde ikna etmek için nasıl kullanılacağını açıklamak için hedeftir .

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA hasar inducing ve DNA onarım proteinler seçili alt nükleer alanlarda yanıt izlemek confocal floresan mikroskopi ve lazer mikro-ışınlama teklif araçları. Bu teknik, hasar tespiti, sinyal ve işe alım ile ilgili bilgilerimizi önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu el yazması tek ve Çift Kişilik strand sonu onarım incelemek için bu teknolojilerin gösterir.

Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

DNA hasar onarım Kinetik eğitim lezyonlar tanımlanmış alt nükleer bölgeler itibariyle ikna etmek için bir sistem gerektirir. Biz bir yöntem bir 405 nm lazer ile donatılmış lazer tarama confocal mikroskop kullanarak yerelleştirilmiş çift iplikçikli kesmeleri oluşturmak ve tamir faktörler bu lezyonlar, dinamikleri ölçmek için otomatik yordamlar sağlar açıklar.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

Burada, karmaşık protein örnek tek molekül düzeyinde her protein türler için etiketleme homojenliği değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Burada 8-OXO-7, 8-dihydro-2'-deoknguanozin (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1, n6-dAdo) ve 1,n2-lezyonların hassas ve doğru ölçülmesini yöntemleri açıklanmaktadır etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dguo) DNA 'da. Yöntemler, ortam ince partikül maddenin (PM2,5) dokularda (akciğer, karaciğer ve böbrek) maruz kalan A/J fareler üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi için uygulanmıştır.

Kütle spektrometresi ile üç DNA lezyonlarının ölçülmesi ve ortam Ince partikül madde maruz fareler dokularda düzeylerinin değerlendirilmesi

Bu protokol, sıralı radikal dozimetri ve flaş oksidasyon proteini ayak izi gerçekleştirmek için bir plazma ışık kaynağı kullanmak için bir yöntem sunar. Bu yöntem, protein çalışmalarının hızlı fotokimyasal oksidasyonunun tekrarlanabilirliğini basitleştirmek ve iyileştirmek için tehlikeli UV lazerin yerini alır.

Proteinlerin Daha Yüksek Sıralı Yapısal Analizini Gerçekleştirmek için Lazersiz Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi

Bu protokol, lazer mikro ışınlama ile DNA onarım proteini alımını ölçmek gibi aşağı akış mikroskopi çalışmaları için S faz hücrelerini verimli bir şekilde tanımlamak için invaziv olmayan bir yöntemi açıklar.

S Aşamasında DNA İşe Alımını İncelemek için Lazer Mikro Işınlama

Burada, nöromelanin granüllerinin lazer mikrodiseksiyonu yoluyla insan post-mortem substantia nigra pars compacta dokusundan izole edilmesi için sağlam bir protokol sunulmuştur. Bu revize edilmiş ve optimize edilmiş protokol, numune toplama için gereken süreyi büyük ölçüde en aza indirir, gerekli numune miktarını azaltır ve LC-MS / MS analizi ile proteinlerin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini geliştirir.

Nöromelanin Granüllerinin Proteomik Profilinin LC-MS/MS Analizi için Lazer Mikrodiseksiyon Tabanlı Protokol

Öğrenin, lazer ile lokalize edilen DNA çapraz bağlarının tek molekül analizini kullanarak hücresel hasar yanıtlarını incelemeyi. Bu yöntem, DNA onarımı alanında hasar dağılımını doğrudan görüntülemenizi sağlar.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

Daha fazla video keşfet