Yeni Nesil Electroporasyonun tarafından İlköğretim İnsan Th17 Hücreleri Küçük RNA Transfeksiyon

Bu prosedürün genel amacı, yeni nesil elektroporasyon kullanarak primer insan T hücrelerini küçük RNA reaktifleri ile verimli bir şekilde transfekte etmektir. Bu yöntem, spesifik gen ürünlerinin T hücresi farklılaşmasını ve bağışıklık fonksiyonunu nasıl düzenlediği gibi T hücresi biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, primer insan T hücrelerini sRNA'lar ve diğer sentetik küçük RNA reaktifleri ile transfekte etmek için oldukça verimli ve güvenilir bir yöntem olmasıdır.

Bu yöntem, insan Th17 hücrelerinin biyolojisi hakkında bilgi sağlayabilir, ancak insan veya farelerden alınan diğer lenfositler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Sıfırıncı günde, altılı kuyucuklu doku kültürü plakalarını, kuyucuk başına 1,5 mililitre kalsiyum ve magnezyum içeren PBS içinde antihuman CD3 ve antihuman CD28 ile 37 derece Celsius'ta en az iki saat boyunca kaplayın. Kordon kanı mononükleer hücreleri (CBMC'ler) izole edilip yıkandıktan sonra, ticari bir insan CD4 pozitif T hücresi kiti kullanarak negatif seçilim yoluyla CD4 pozitif T hücresi izolasyonu gerçekleştirin.

İzolasyon tamponu ekleyin ve mononükleer hücreleri yeniden süspanse edin. Hücreleri yeni bir beş mililitrelik tüpe aktarın, ardından her tüpe 100 µL fetal bovine serum (FBS) ve 100 µL antikor karışımı ekleyin; iyi karışması için her tüpü orbital çalkalayıcıda dört °C'de 20 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından hücreleri yıkamak için üç ila dört mililitre izolasyon tamponu ekleyin.

Hücreleri çöktürmek için 4 °C'de, sekiz dakika boyunca 300 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin. Manyetik boncukları yeni bir tüpe aktarın ve boncukları yıkamak için eşit hacimde izolasyon tamponu ekleyin.

Boncukları iyice karıştırmak için bir mililitrelik bir mikropipet kullanın ve ardından tüpü en az bir dakika boyunca mıknatısta bekletin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve manyetik boncukları, yıkama öncesinde başlangıçta aktarılanla aynı hacimde yeniden süspanse edin. Her tüpe 500 mikrolitre izolasyon tamponu ekleyerek hücreleri yeniden süspanse edin, ardından 500 mikrolitre ön yıkanmış manyetik boncuk ekleyin.

İyi karışması için hücreleri manyetik boncuklarla birlikte oda sıcaklığında, orbital bir çalkalayıcı üzerinde 15 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, bir mililitrelik bir mikropipet kullanarak hücreleri en az 10 kez iyice pipetleyin, ardından üç ila dört mililitre izolasyon tamponu ekleyin ve her tüpü iki dakika boyunca mıknatısa yerleştirin. Süpernatantta bulunan negatif seçilimli CD4 pozitif T hücrelerini dikkatlice yeni bir tüpe aktarın.

CD4 pozitif T hücre izolasyonu tamamlandıktan sonra hücreleri buz üzerinde tutun ve bir hemositometre ile hücre sayımı yapın. Antikor kaplı plakaları PBS ile iki kez yıkayın, ardından her bir kuyucuğa Th17 polarizasyon ortamının 2X karışımından 1,5 milliliters ekleyin. Son olarak, hücreleri çöktürmek için insan CD4 pozitif T hücrelerini santrifüjleyin.

Süpernatantı dikkatlice aspire edip atın, ardından hücreleri serumsuz temel besiyerinde yeniden süspande edin ve kuyuk başına final hacim üç mililitre olacak ve polarize edici sitokinler bir X final konsantrasyonda bulunacak şekilde hücreleri plaklara ekleyin; ardından plakları iki gün boyunca %5 karbondioksit içeren 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. İkinci günde, 48 kuyucuklu doku kültürü plaklarını, kalsiyum ve magnezyum içeren PBS içinde antihuman CD3 ve antihuman CD28'in kuyuk başına 250 µL'si ile 37 °C'de en az iki saat boyunca kaplayın. Transfeksiyon için küçük RNA'ları hazırlamak amacıyla, her bir transfeksiyon için siRNA'nın 5 µM'lık stok solüsyonundan bir mikrolitreyi 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne paylaştırın.

Tüm tüpleri buz üzerinde tutun. Ardından, antikor kaplı plakaları iki kez PBS ile yıkayın, daha sonra her kuyucuğa 500 µL 1X Th17 polarizasyon besiyeri ekleyin. Kültür plakaları ve transfeksiyon reaktifleri hazırlandıktan sonra, hücreleri 1 mL'lik bir mikropipet ile, tüm hücrelerin kuyucukların tabanından ayrıldığından emin olacak şekilde nazikçe pipetleyerek yeniden süspanse edin.

Hücreleri konik bir tüpte toplayın ve tüpleri 4 °C'de beş dakika boyunca 500 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve ardından yıkamak için hücreleri en az 1 mL PBS içinde yeniden süspande edin. Canlı Th17 hücrelerini, canlılığı değerlendirmek için trypan blue dışlama yöntemini kullanarak bir hemositometre ile sayın ve ardından hücreleri bir mikro santrifüj tüpünde peletleyin.

Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve hücreleri kit içerisinde sağlanan yeniden süspansiyon tamponu ile yeniden süspanse edin. Hücreleri oda sıcaklığında tutun. Her bir mikrosantrifüj tüpündeki bir mikrolitre küçük RNA'ya dokuz mikrolitre hücre ekleyin.

Transfeksiyon için hücreleri ve küçük RNA'ları karıştırmak üzere bir kez pipetleyin, ardından hücreleri sağlanan pipet elektrot ucuna yükleyin. Optimal transfeksiyonu sağlamak için, transfeksiyondan önce pipet elektrot ucuna hava kabarcıkları girmesini önleyin. Elektroporasyon pipetinde kabarcık oluşmasını önleyecek kadar karışım olduğundan emin olmak için 9,5 µL hücre süspansiyonu ekliyoruz.

Verilen küveti üç mililitre oda sıcaklığındaki elektrolitik tampon ile doldurun. Küveti neon pipet istasyonunun içine yerleştirin ve ardından pipeti küvetin içindeki konumuna getirin. Her 10 mikrolitrelik hücre ve küçük RNA karışımını hemen elektropore edin.

Elektroporasyon tamamlandıktan sonra, hücre karışımını doğrudan bir kültür plağının hazırlanmış kuyucuklarındaki 500 mikrolitre bir katlı Th17 polarizasyon ortamına ekleyin. Son olarak, plakları iki gün daha %5 karbondioksit içeren 37 derece Celsius sıcaklığındaki bir inkübatöre yerleştirin. Hücre ölümünü önlemek için dikkatli ancak hızlı çalışın.

Elektroporasyon yapılacak çok sayıda örnek varsa, hücreler gruplar halinde toplanabilir ve transfekte edilebilir. Bu kontur grafiği, Th17 polarizasyon koşulları altında kültüre edilen T hücrelerinin, T hücreleri polarizasyon dışı koşullar altında kültüre edildiğinde eksprese edilmeyen kemokin reseptörü CCR6 ve transkripsiyon faktörü ROR gamma T'yi eksprese ettiğini göstermektedir. Th17 polarizasyon koşulları altında kültüre edilen T hücreleri, yeniden stimülasyon üzerine IL-17A üretirken, ThN koşulları altındakiler üretmemiştir.

Küçük RNA'lar ile transfeksiyondan sonra Th17 diferansiyasyonu hala gerçekleşmektedir, ancak bazı deneylerde IL-17A üretim sıklığında bir azalma gözlemlenmiştir. Bu durum, her deneyde karşılaştırma yapmak için kimyasal olarak eşleşmiş bir küçük RNA kontrolüne sahip olmanın önemini göstermektedir. Küçük RNA'lar ile transfeksiyondan sonra canlılık korunur ve genellikle %70'in üzerindedir. İkinci günde, CD45'i kodlayan PTPRC genini hedefleyen bir siRNA havuzu ile insan Th17 hücrelerinin transfeksiyona tabi tutulması, kimyasal olarak eşleşmiş kontrol siRNA'ya kıyasla CD45 ekspresyonunu güçlü bir şekilde azaltmıştır.

Burada görülen CD45 ekspresyonundaki tek modlu popülasyon kayması, %100'e yakın transfeksiyon verimliliğine işaret etmektedir. RNAi ile ROR gamma T ekspresyonunun azaltılmasının fonksiyonel bir etkisi olmuştur; çünkü bu hücreler, kontrol siRNA ile transfekte edilen hücrelere kıyasla daha düşük IL-17A üretimi göstermiştir. Bu videoyu izledikten sonra, yeni nesil elektroporasyon kullanarak in vitro polarize edilmiş insan Th17 hücrelerine küçük RNA'ların nasıl transfekte edileceği konusunda iyi bir bilgiye sahip olmalısınız.