Name: Yeni Nesil Electroporasyonun tarafından İlköğretim İnsan Th17 Hücreleri Küçük RNA Transfeksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Öğrenin, yeni nesil elektroporasyon ile insan Th17 hücrelerine küçük RNA transfeksiyonu yapmayı. Bu yöntem, T hücre farklılaşması ve bağışıklık fonksiyonu araştırmalarında yüksek verimlilik sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), Lösemi ve Lenfoma Derneği akademisyen ödülü (K.M.A.) ve Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS) Tıp Bilimcisi Eğitim Programı (Grant #T32GM007618) (M.M.) tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol, insan araştırma etiği için UCSF yönergelerine uyar. T Hücre Kültürü, CD4 + T hücrelerinin elde edilmesi, ve, Th17 polarizasyon hazırlanması 1. <ol><li> Gün 0, CD3, anti-insan (2 ug / ml) ve anti-insan CD28 oyuk başına 1.5 mL ile kat 6 oyuklu doku kültür plakaları (4 ug / ml), en az 2 saat boyunca, kalsiyum ve magnezyum ile PBS içinde 37 ° C. <ol><li> Alternatif olarak, kaplama, gece boyunca 4 ° C&#39;de plakalar. parafilm plakaları sarın. </li></ol></li><li> üreticinin talimatlarına göre yoğunluk gradyan santrifüjü ile kordon kan mononükleer hücreleri (CBMCs) hazırlayın. DİKKAT: dikkatle çalışın ve kan yoluyla bulaşan patojenlere maruz kalma riskini önlemek için insan kanı tutarken aşınmış uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) sağlamak. </li><li> Tek çekirdekli hücreler izole edilmiş ve yıkanmış sonra, negatif sele insan CD4 + T hücresi izolasyon yerinection ticari bir insan CD4 + T hücre kiti kullanılarak. Not: mononükleer hücre izole edildikten sonra, kırmızı kan hücresi kontaminasyon olması durumunda, isteğe bağlı bir kırmızı kan hücre parçalama, CD4 + T hücresi izolasyon adımları önce gerçekleştirilebilir. yalıtım tamponu (PBS içinde% 2 FBS) 1 mL mononükleer hücrelerin tekrar. 1x yokedici çözeltisi 5 mL ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra pelet hücreleri 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de izole tamponu ve santrifüj 5 ml. <ol><li> Yeni 5 mL&#39;lik bir tüp içerisinde izolasyon tamponunda 500 uL başına 50 x 10 6 yoğunluğunda tek çekirdekli hücreleri tekrar. </li><li> FBS, 100 uL ve sonra iyice karışana kadar bir orbital çalkalayıcı üzerinde 20 dakika boyunca 4 ° C &#39;de, her tüp inkübe tüp başına Antikor Mix 100 uL ekleyin. </li><li> İnkübasyondan sonra, Hücreleri yıkamak için izolasyon tamponunda 3-4 ml. pelet hücreleri 4 ° C&#39;de 8 dakika boyunca 300 x g&#39;de hücreleri santrifüjleyin. Dikkatle supe aspirernatant. </li><li> Bu dönüş sırasında, manyetik boncuk önceden yıkayın. (1 kullanılmıştır: hücreler ile 1), yeni bir tüp içine manyetik boncuk istenilen miktarda aktarın ve boncuk yıkamak için izolasyon tampon maddesinin eşit hacmi ekleyin. 1 ml mikropipet kullanılarak İyice karıştırın ve daha sonra en az 1 dakika için mıknatıs tüp yerleştirin. Dikkatle süpernatant aspire. ilk yıkama öncesinde transfer aynı hacimde manyetik boncukları süspanse. </li><li> izolasyon tamponunda 500 ul her bir tüp içinde hücrelerin tekrar ve önceden yıkanmış manyetik boncuk 500 uL ekleyin. </li><li> iyice karıştırmak için oda sıcaklığında (25 ° C, 18 ° C) bir orbital çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca manyetik boncuklarla inkübe hücreleri. </li><li> İnkübasyondan sonra, iyice 1 ml mikropipet en az 10 kez kullanarak hücreleri pipetleyin. Daha sonra yalıtım tamponu 3-4 ml ilave edilir ve 2 dakika süre ile mıknatıs her tüp yerleştirin. </li><li> Dikkatle içindedir olumsuz seçilen CD4 + T hücreleri transferiyeni bir tüpe yüzer. </li></ol></li><li> CD4 + T hücre izolasyonu tamamlandıktan sonra, hemositometre ile hücrelerin sayısı ve buz üzerinde hücreleri tutun. </li><li> PBS ile antikor kaplı plakalar iki kez yıkayın. Daha sonra her bir oyuğa, Th17-polarize edici ortam 1.5 mL 2x karışımı ekleyin: Anti-insan IFN-y (20 ug / ml), anti-insan IL-4 (20 ng / ml), insan TGF (10 ng / ml), insan IL-1β (40 ng / ml) insan IL-23 (40 ng / ml) insan IL-6 (50ng / ml) her 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiş serumsuz bir baz ortam (seyreltilmiş 100 U / mL penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum piruvat ve 100 uM 2-merkaptoetanol). Not: Transfeksiyon ve RNA interferans serum ihtiva eden ortam içinde çalışır. Bu protokol ile serumsuz ortam kullanılarak amacı daha, IL-17A üretimini sağlamaktır. </li><li> Santrifüj 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de insan CD4 + T hücreleri, topak hücrelere. Dikkatle supernat aspirekarınca. Daha sonra nihai hacim oyuk başına 3 ml ve polarize sitokinler 1x nihai konsantrasyonda şimdi de o kadar başına 1.5 mL içinde 3 x 10 6 bir yoğunlukta hücreler serumsuz baz ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve plaka. <ol><li> % 5 CO2, iki gün boyunca 37 ° C inkübatör tabak yerleştirin. </li></ol></li></ol> 2. Elektroporasyon in vitro Polarize İnsan Th17 Hücreleri <ol><li> 2. günde CD3, anti-insan (2 ug / ml) ve anti-insan CD28 oyuk başına 250 uL ile kat 48 oyuklu doku kültür plakaları (4 ug / ml), en az 2 saat boyunca, kalsiyum ve magnezyum ile PBS içinde 37 ° C. <ol><li> Alternatif olarak, kaplama, gece boyunca 4 ° C&#39;de plakalar. parafilm plakaları sarın. </li></ol></li><li> Transfeksiyon için küçük RNA&#39;lar hazırlayın. Her transfeksiyon için, bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içine bir siRNA 5 uM stok çözeltisi alikosu 1 uL. Uygun kimyasal eşlemeli küçük RNA Contr dahilol. buz üzerinde tüm tüpleri tutun. </li><li> PBS ile antikor kaplı plakalar iki kez yıkayın. İnsan TGF (5 ng / ml) insan IL-anti-insan IFN-y (10 ug / ml), anti-insan IL-4 (10 ng / ml): O 500 uL 1X her bir oyuğa ortamı Th17-polarize ekleyin 1β (20 ng / ml) insan IL-23 (20 ng / ml) insan IL-6 (25 ng / ml) her 2 mM L-glutamin, 100 U ile takviye edilmiş serumsuz bir baz ortamında (seyreltildi / mL penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum piruvat ve 100 uM 2-merkaptoetanol). </li><li> kültür plakaları ve transfeksiyon reaktifleri hazırlandıktan sonra, 1 ml mikropipet, pipetle hücreler yavaşça ama tüm hücreler kuyularının tabanından ayrılmış sağlamaktan yeniden süspanse edin. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de konik bir tüp ve santrifüj içine hücreleri havuzda toplayın. NOT: Burada sunulan dört günlük protokolü daha uzun kültür dönemleri için hücreler bu aynı protokolü kullanan her 3 günde yaklaşık transfekte edilmelidir. Adım 2Farklı küçük RNA ile tedavi edilen hücreler toplanmış olmamalıdır çünkü .4 ancak modifiye edilmelidir. test edilen durumların hepsi toplanmış, sayılmış ve ayrıca transfekte edilmesi gerekir. </li><li> Dikkatle süpernatanı havalandırın, ve daha sonra yıkama PBS en az 1 mL hücreleri tekrar süspansiyon. Ve daha sonra bir mikro santrifüj tüpüne hücreleri aktarmak (canlılığını değerlendirmek için Tripan Mavi dışlama kullanarak hemositometre ile örneğin) canlı Th17 hücre sayımı. </li><li> pelet hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle süpernatanı havalandırın, ve daha sonra mL başına 2.5-4 x 10 7 hücre yoğunluğunda transfeksiyon sistemi 10 uL kit temin yeniden süspansiyon tamponu kullanılarak tekrar süspansiyon hücreleri. Oda sıcaklığında hücreleri tutun. NOT: Bir kural olarak, 30 dakika içinde transfekte edilebilir olarak sadece kadar çok hücreler hazırlamak deneyin. Çoklu toplu karşılaştırılabilir. </li><li> Her microC küçük RNA&#39;nın 1 uL hücre 9 uL ekleyinentrifuge tüpü. Pipet sonra bir kez verilen pipet elektrot ucu yüklemek hücreler transfeksiyon için ve küçük RNA&#39;ların karıştırın. Not: Genellikle, transfeksiyondan önce pipeti elektrot ucu kabarcıklar oluşturmak önlemek için karışımın yeterli olduğundan emin olmak için, hücre süspansiyonunun 9.5 uL ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında Elektrolitik Tampon E İlan 3 mL pipet istasyon içinde küvet sahip küveti doldurun ve sonra küvet içindeki bir konumda içine pipet yerleştirin. </li><li> Hemen aşağıdaki parametreler kullanılarak hücreler ve küçük RNA her biri 10 uL karışımı electroporate: Darbe gerilimi 1,500-1,550 V, nabız 10 ms genişlik ve 3 bakliyat transfeksiyon cihazda toplam. </li><li> elektroporasyon işlemi tamamlandıktan sonra, doğrudan doğruya 1X bir kültür plakasının hazırlanmış kuyu ortamı Th17-polarize 500 uL hücre karışımı ekleyin. % 5 CO2, iki gün boyunca 37 ° C inkübatör içinde bir yer plakalar. NOT: pipetleme pipet elektrot ucu yıkayınyukarı ve aşağı PBS içinde her bir transfeksiyon arasında. </li></ol> 3. Hasat İnsan Th17 Hücreleri <ol><li> hafifçe pipetleme ancak tüm hücreler kuyularının tabanından ayrılmış sağlamak, bir mikropipet ile kültür ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri. işlevsel ve / veya gen ekspresyonu deneyleri için hücreler hazırlayın. Not: Rutin olarak, yeterli miktarda hücrelerin transfekte Th17 hücreleri tek bir kuyudan elde edilir yüzey işaretleyici ve hücre içi sitokin ve transkripsiyon faktör boyama akış sitometri analizi için veya gen ekspresyon analizi için RNA hazırlanması için kullanılır. </li></ol>

<ol><li>Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Effector+CD4+T+Cell+Populations%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*.</a> Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).</li>
<li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 Cells.</a> Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).</li>
<li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-23-IL-17+immune+axis%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing.</a> Nature. 14 (9), 585-600 (2014).</li>
<li>Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+origin+of+human+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Properties and origin of human Th17 cells.</a> Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).</li>
<li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).</li>
<li>Annunziato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+features+of+human+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional features of human Th17 cells.</a> J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Du, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+miR-326+regulates+TH-17+differentiation+and+is+associated+with+the+pathogenesis+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis.</a> Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).</li>
<li>Escobar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-155+Activates+Cytokine+Gene+Expression+in+Th17+Cells+by+Regulating+the+DNA-Binding+Protein+Jarid2+to+Relieve+Polycomb-Mediated+Repression%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression.</a> Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+Hif1a+expression+and+TH17+differentiation+by+the+hypoxia-regulated+microRNA+miR-210%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210.</a> Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+bioanal+chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Steiner, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-%26gamma%3B+Production+in+Helper+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-&gamma; Production in Helper T Cells.</a> Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).</li>
<li>Simpson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+upregulated+in+asthma+airway+T+cells+promotes+TH2+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production.</a> Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).</li>
<li>Pua, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+24+and+27+Suppress+Allergic+Inflammation+and+Target+a+Network+of+Regulators+of+T+Helper+2+Cell-Associated+Cytokine+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production.</a> Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).</li>
<li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Na%C3%AFve+CD4%2B+T+Cell+Isolation+and+In+vitro+Differentiation+into+T+Cell+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Schumann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+knock-in+primary+human+T+cells+using+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokol, insan Th17 hücrelerine küçük RNA verilmesi için geliştirilmiş bir yöntemi temin etmektedir. İnsan Th17 hücreleri burada kullanılmış olsa da, küçük RNA ile elektroporasyon bu yöntem, Th1, Th2 ve Tregs gibi primer insan T yardımcı alt grupları, birlikte kullanılabilir. Hücreler transfeksiyondan önce kültür içinde etkinleştirilmiş olmalıdır böylece saf CD4 + T hücreleri için, iyi sonuçlar vermemiştir. Bu protokol için, ilk olarak daha iyi bir IL-17A üretimi için in vitro kültür sistemi opti...

CD4 + T hücreleri adaptif bağışıklık tepkisinin önemli Orkestraya bulunmaktadır. Naif CD4 + T hücreleri, birkaç farklı efektör T hücrelerinin (örneğin Th 1, Th2 Th17, vs.) halinde gelişme yetisine sahip olan, yerel mikro 1 bağlı olarak karakteristik bir sitokinler ve transkripsiyon faktörleri, kendi seti, her biri. T hücreleri yapmak soy kararları kendine hem koruyucu bağışıklığın ve hoşgörü için önemlidir. Th17 hücreleri hücre-dışı bakteriler ve mantarlar ile mücadele için bilinen T hücrelerinin bir alt kümesi, ancak bunların uygun olmayan tepkiler aynı zamanda, mültipl skleroz ve psoriasisin 2, 3 gibi çok otoimmün ve inflamatuar hastalıkların patogeneziyle edilir. İnsan Th17 hücreleri uygun bir polarizasyon çevre 4 sağlayarak, in vitro olarak naif CD4 + T hücrelerinden üretilebilir. Vario<html> sitokinlerin bize kombinasyonları, IL-1β, IL-23, TGFp, ve IL-6, insan Th17 hücrelerinin gelişimi için kullanılmıştır. İnsan Th17 hücreleri CCR6 yaygın olarak bu hücre popülasyonu tespit etmek için kullanılır ve esas transkripsiyon faktörü (RORC tarafından kodlanan) RORγt 5, 6 ekspresyonu ile tanımlanır bir kemokin reseptörünü eksprese eder. Th17 hücreler birden fazla sitokinleri ifade etme yeteneğine sahiptir, ancak, IL-17A, bu hücreler tarafından üretilen soy tanımlayan efektör sitokindir. Biz, insan Th17 in vitro farklılaşma deneyinde sağlamlığını belirlemek için her üç Th17-ilişkili markörler (CCR6, RORγt IL-17A) ifadesini inceledi. Buna ek olarak, bu, Th17 markerlerin ekspresyonu çok düşük ya da sıfır olması gerektiği için hiçbir sitokinler ya da bloke edici antikorlar, bir negatif kontrol olarak kullanmak için, kültür ortamına ilave edildi olmayan polarizasyon koşulları altında, insan CD4 + T hücrelerinin kültive edilmiştir. ve_content &quot;&gt; normal insan T hücresi gelişimini ve biyolojisi okumak için bir yolu, gelişimi esnasında gen ekspresyonunu değiştirmek için. Kısa müdahale RNA (siRNA) protein kodlayıcı mRNA&#39;ları hedefleyebilir ve spesifik gen ekspresyonunu azaltmak için kullanılabilir sentetik küçük RNA molekülleridir . MikroRNA&#39;lar (miRNA&#39;lar) post-transkripsiyonel gen ekspresyonunu modüle etmek için bilinen bir endojen kodlayıcı olmayan küçük RNA&#39;larıdır. miRNA&#39;lann Th17 hücreleri 7, 8, 9, de dahil olmak üzere, murin ve insan T hücresi biyolojisi hem de önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Bu gen ifadesi ve nihayetinde insan T hücre biyolojisi üzerindeki etkilerini incelemek için insan T hücrelerinde küçük RNA aktivitesini manipüle güvenilir yöntemler olması çok önemlidir. Burada, biz tanıştırmak için geliştirilen bir, kullanımı kolay, tutarlı ve güvenilir protokol açıklar küçük sentetik RNA ve kilitli nükleik asitleri (LNA&#39;lar, kimyasal stabilite artışı olan modifiye edilmiş nükleik asitleri)bağışıklık hücrelerine ve özellikle insan Th17 hücrelerine. Genel olarak, kimyasal, biyolojik veya fiziksel kategoriye 10 girer memeli hücrelerine dahil etmek küçük RNA&#39;ların sokulması çeşitli alternatif yöntemler vardır. lipid bazlı transfeksiyonları ve kalsiyum fosfat transfeksiyonlar dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılan kimyasal metotlar, daha etkili bir şekilde hücreler tarafından alınır kimyasal DNA kompleksleri temel almaktadır. Genel olarak, kimyasal yöntemler, birincil T hücrelerinin transfeksiyonu için etkili değildir. En yaygın biyolojik yöntem doğrudan doğal replikasyon döngüsünün bir parçası olarak bir konakçıya yabancı RNA ekler bir viral vektör (örneğin, retrovirüs veya lentivirüs) kullanmaktır. Viral transdüksiyon tipik olarak bir proviral plazmid moleküler klonlanması için zaman dahil edilen, özellikle tamamlamak için daha uzun sürer. Buna ek olarak, virüs transdüksiyon vektörleri, insan araştırmacılar için zararlı olabilir. Elektroporasyon fiziksel mNükleik asitler, geçici olarak kendi hedef üzerinde hareket edebilir hücre içine girmesine izin verir, yüksek voltaj darbeleri hücreleri tabi tutulması ile membran geçirgenliği indükleme bu yöntemde. Geleneksel elektroporasyon araçlar primer lenfositler transfekte etmek için etkili değildi. Bununla birlikte, optimum nesil elektroporasyon malzeme küçük RNA&#39;dır Transfekte edilecek, özellikle de çok yüksek bir verimle, T hücrelerini transfekte edebilen olduğu kanıtlanmıştır. Terimi, yeni nesil gevşek geleneksel elektroporasyon makineleri ile iki yeni platformları (örneğin, neon, Amaxa) ayırt etmek için kullanılır. Buna ek olarak, bu yöntem tek bir deneyde yaklaşık 120 küçük RNA, kadar, genellikle geçerli sentetik reaktif maddeler kullanılarak orta derecede verimli taramalara kolayca ölçeklendirilebilir. Önemli olarak, başarılı bir şekilde transfeksiyon, T hücresi aktivasyonundan sonra az 16 olarak saat içinde elde edilebilir. Bu yöntemin dezavantajı, ancak stabil genomik incorporati neden olmamasıdırüzerinde ve dolayısıyla geçicidir. Bu nedenle, bu şekilde bir viral vektör içine paketlenmiş ve başarılı bir şekilde küçük bir RNA uzun süreli ekspresyonu gereken durumlarda T-hücrelerinde ifade edilebilir dengeli bir ifade yapısı oluşturmak için ilave çaba değerdir. Farklı amaçlarla 11, 12, 13 için çeşitli sentetik tek veya çift-sarmallı RNA ya da LNA oligonükleotid araçlar sağlamak için, yeni nesil bir transfeksiyon (örneğin, neon) kullandık. Etkin RNA interferans çift sarmallı kısa karışan RNA (siRNA) kullanılarak primer fare ve insan T-hücrelerinde indüklenebilir. Bu protokol, insan Th17 hücrelerinde bu tekniği kullanarak için optimize koşulları açıklar. siRNA&#39;lar ek olarak, ticari olarak temin edilebilen sentetik MiRNA taklit ve inhibitörler MiRNA kazanç ve fonksiyon kaybı incelemek için kullanılabilir. MiRNA taklit siRNA&#39;lar çok benzer iki-şeritli RNA molekülü, ancak designeEndojen olgun miRNA&#39;lann dizisi ile d. MiRNA inhibitörleri doğal miRNA&#39;lara bağlanan ve fonksiyonunu antagonize RNA ve / veya LNA göre tek zincirli oligonükleotidler kimyasal olarak modifiye edilir. Biz bu araçların tümü dahil, kültürlü birincil T lenfositler etkin kullanılan ancak insan Th17 hücreleri ile sınırlı değildir edilebileceğini bulmuşlardır.

<table><tbody><tr><td>anti-insan IL-17A PE</td><td>ebioscience</td><td>12-7179-42&nbsp;</td><td>Klon: eBio64DEC17</td></tr><tr><td>anti-insan IFNg FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-7319-82</td><td>Klon: 4S. B3</td></tr><tr><td>anti-insan CD4 eVolve605</td><td>ebioscience</td><td>83-0047-42</td><td>Klon: SK3</td></tr><tr><td>fare anti-insan CD196 (CCR6) BV421</td><td>BD biyolojik bilimler</td><td>562515</td><td>Klon: 11A9</td></tr><tr><td>anti-insan RORgt AF647</td><td>BD biyolojik bilimler</td><td>563620</td><td>Klon: Q21-559</td></tr><tr><td>anti-insan CD45 eFluor450</td><td>ebioscience</td><td>48-9459-42</td><td>Klon: 2D1</td></tr><tr><td>Foxp3 / Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon Seti</td><td>ebioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Hücre içi transkripsiyon faktörü akış sitometrisi boyama için</td></tr><tr><td>Hu FcR Bağlanma İnhibitörü Saflaştırılmış</td><td>ebioscience</td><td>14-9161-71</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF T Hücre Genişletme Ortamı</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>10981</td> <td>"Serumsuz Baz Ortamı"</td></tr><tr><td>MACS CD28 saf fonksiyonel sınıf, insan</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-375</td><td>Klon: 15E8</td></tr><tr><td>anti-insan CD3 Saflaştırılmış</td><td>UCSF monoklonal antikor çekirdeği</td><td>N/A</td><td>Klon: OKT-3</td></tr><tr><td>LEAF saflaştırılmış anti-insan IL-4</td><td>Biolegend</td><td>500815</td><td>Klon: MP4-25D2</td></tr><tr><td>anti-insan IFNg, fonksiyonel sınıf saflaştırılmış</td><td>ebioscience</td><td>16-7318-85</td><td>Klon: NIB42</td></tr><tr><td>Rekombinant insan IL-23</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-23</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan IL-1 ve beta;</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan TGF-&beta; 1</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan IL-6</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Kontrol Havuzu, Hedeflemeyen #2</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-05</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool İnsan RORC</td><td>Dharmacon</td><td>M-003442-00</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool İnsan PTPRC</td><td>Dharmacon</td><td>M-008067-01</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads El Değmemiş İnsan CD4 T Hücreleri Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11346D</td><td>İnsan CD4+ T hücresi İzolasyon Kiti</td></tr><tr><td>Neon Taşıma Sistemi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>Yeni nesil elektroporasyon cihazı</td></tr><tr><td>Neon Taşıma Sistemi 10 &mu; L Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Yeniden Süspansiyon Tamponu T</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Kitte Sağlanır (MPK1096)</td><td>"Transfeksiyon Yeniden Süspansiyon Tamponu"</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>#07801</td><td>Yoğunluk Gradyanı Orta</td></tr><tr><td>costar 6 kuyucuklu doku kültürü ile tedavi edilmiş plakalar</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>düz tabanlı plakalar</td></tr><tr><td>Costar 48 oyuklu doku kültürü uygulanmış plakalar</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>düz tabanlı plakalar</td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse lizing tamponu, 10x</td><td>BD biosciences</td><td>555899</td><td>Kullanmadan önce damıtılmış su ile 1x çözelti yapılmalıdır</td></tr></tbody></table>

yeni nesil electroporasyonun tarafından İlköğretim İnsan th17 hücreleri küçük rna transfeksiyon

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T hücreleri, çevredeki sitokin ortamına bağlı olarak efektör T yardımcı hücrelerinin birkaç alt kümesine farklılaşabilir. Th17 hücreleri, polarize sitokinler IL-1β, IL-6, IL-23 ve TGFβ varlığında aktive edilerek in vitro olarak naif CD4 + T hücrelerinden üretilebilir. Th17 hücreleri, hücre dışı bakteri ve mantarlara karşı bağışıklığı düzenler, ancak anormal aktiviteleri aynı zamanda çeşitli otoimmün ve enflamatuar hastalıklarla da ilişkilendirilmiştir. Th17 hücreleri, kemokin reseptörü CCR6 ile tanımlanır ve ana transkripsiyon faktörü, RORγt ve karakteristik efektör sitokin IL-17A ile tanımlanır. Th17 hücre farklılaşması için optimize edilmiş kültür koşulları, kontrollü bir ortamda insan T hücresi biyolojisinin mekanik çalışmalarını kolaylaştırır. Ayrıca, RNA girişimi veya mikroRNA (miRNA) taklitçilerinin veya inhibitörlerinin eklenmesi yoluyla belirli genlerin ve gen ekspresyon programlarının önemini incelemek için bir ortam sağlarlar. Bu protokol, yeni nesil bir elektroporasyon cihazı kullanılarak küçük RNA'larla farklılaşan birincil insan Th17 hücrelerinin geçici transfeksiyonu için kullanımı kolay, tekrarlanabilir ve oldukça verimli bir yöntem sağlar.

Başarılı bir şekilde insan Th17 hücrelerini elektroporat güvenilir bir sistem geliştirmek için ilk adım nitro farklılaşmış insan Th17 hücre kültürlerinde sağlam oluşturmak oldu. Th17-polarize koşullar altında kültür T hücreleri kemokin reseptörü CCR6 ve transkripsiyon faktörü RORγt (Şekil 1A, sol) olarak ifade edilmiştir. T hücreleri (sağ Şekil 1A) olmayan polarizasyon (THN) koşullar altında kültüre edildiği zaman Bu işaretleyiciler ola...

Yeni nesil elektroporasyon, gen ekspresyonunu ve hücre davranışını değiştirmek için insan Th17 hücrelerini küçük RNA'larla transfekte etmek için etkili bir yöntemdir.

Yeni Nesil Electroporasyonun tarafından İlköğretim İnsan Th17 Hücreleri Küçük RNA Transfeksiyon

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Bu prosedürün genel amacı, yeni nesil elektroporasyon kullanarak primer insan T hücrelerini küçük RNA reaktifleri ile verimli bir şekilde transfekte etmektir. Bu yöntem, spesifik gen ürünlerinin T hücresi farklılaşmasını ve bağışıklık fonksiyonunu nasıl düzenlediği gibi T hücresi biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, primer insan T hücrelerini sRNA'lar ve diğer sentetik küçük RNA reaktifleri ile transfekte etmek için oldukça verimli ve güvenilir bir yöntem olmasıdır.Bu yöntem, insan Th17 hücrelerinin biyolojisi hakkında bilgi sağlayabilir, ancak insan veya farelerden alınan diğer lenfositler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Sıfırıncı günde, altılı kuyucuklu doku kültürü plakalarını, kuyucuk başına 1,5 mililitre kalsiyum ve magnezyum içeren PBS içinde antihuman CD3 ve antihuman CD28 ile 37 derece Celsius'ta en az iki saat boyunca kaplayın. Kordon kanı mononükleer hücreleri (CBMC'ler) izole edilip yıkandıktan sonra, ticari bir insan CD4 pozitif T hücresi kiti kullanarak negatif seçilim yoluyla CD4 pozitif T hücresi izolasyonu gerçekleştirin.İzolasyon tamponu ekleyin ve mononükleer hücreleri yeniden süspanse edin. Hücreler

small-rna-transfection-primary-human-th17-cells-next-generation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu prosedür, birincil fare kemik iliği hematopoetik hücre kültürleri kurmak ve transfeksiyon Gene Verici MXCell elektroporasyon sistemini kullanarak takip nasıl açıklamaktadır.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

Biz plazmid DNA hücresinin olgunlaşması neden olmaksızın veya siRNA birincil insan monosit türevli dendritik hücreler transfecting etkin bir yolu olarak optimize edilmiş yüksek verimli nucleofection protokol sunuyoruz. Biz daha başarılı bir şekilde hedef gen, mRNA ve protein seviyeleri hem de Rig-I siRNA susturulması için kanıt sağlar.

Hücre olgunlaşması olmadan Dendritik Hücreler Verimli Transfeksiyon için optimize edilmiş Protokolü

Bu protokol, yüksek hücre canlılığı ve farklılaşması ve polarizasyon tam makrofaj kapasitesini muhafaza ederek, yüksek transfeksiyon verimi olan elektroporasyon ile siRNA veya plazmit DNA'sı ile insan THP-1 makrofajlar transfekte etmek için etkin ve güvenilir bir yöntem sunmaktadır.

Nucleofection İnsan THP-1 Makrofagların Yüksek Verimli Transfeksiyonu

Preassembled Cas9 kullanan karmaşık Ribonükleoprotein (RNP) kesin, verimli genom düzenleme için güçlü bir yöntemdir. Burada, biz yararını hücreleri ve organizmalar, geniş aralığında birincil insan hücreleri ve her iki klasik de dahil olmak üzere ve model organizmalar gelişmekte olan vurgulayın.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Uyuyan Güzel (SB) transpozon sistemini kullanarak pigment epitel türevi faktörü (PEDF) kodlayan gen ile elektroporasyon yoluyla primer insan pigment epitel hücrelerini transfekte etmek için bir protokol geliştirdik. Başarılı transfeksiyon, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), immünoblotlama ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile gösterilmiştir.

Uyuyan Güzel Transpozon Sistemi Kullanılarak Primer İnsan Pigment Epitel Hücrelerinin Elektroporasyon Tabanlı Genetik Modifikasyonu

Th17 farklılaşmasının incelenmesinde gen düzenleme için etkili bir alternatif sağlayan, Cas9 transgenik farelerden alınan birincil T hücrelerine kılavuz RNA'nın retroviral transdüksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

İn vitro Th17 farklılaşmasının incelenmesi için retroviral CRISPR/Cas9 aracılı gen hedeflemesi

Bu protokol, insan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücreleri (CAR Treg'ler) oluşturmak ve test etmek için kolaylaştırılmış bir iş akışı sağlar.

İnsan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücrelerinin üretimi

Homoloji aracılı uç birleştirme (HMEJ) DNA onarım yolu yoluyla birincil insan T hücrelerinde büyük, multisistronik yapıların yüksek verimli hedefli knock-in'ini elde etmek için CRISPR / Cas9 teknolojisini kullanmak için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu cGMP'ye uyarlanabilir protokolle tasarlanan T hücreleri, mükemmel hücre genişlemesi, sitotoksisite ve sitokin üretimini korur.

Büyük DNA Şablonlarının Homoloji Aracılı Uç Birleştirme Hedefli Entegrasyonu Yoluyla Birincil İnsan T Hücrelerinin Viral Olmayan Mühendisliği

Bu protokol, birincil insan T hücrelerinde TCRα/β reseptörünün küçültülmüş CRISPR–Cas9 genom düzenlemesini 'DMF-ection' olan dijital mikrofluidik (DMF) elektroporasyon platformu kullanarak tanımlar. Bu yöntem, yüksek canlılıkla paralel, düşük girdili gen düzenlemesini mümkün kılar ve çok hücreli 3D sferoidlere mRNA iletimi için daha da uyarlanabilir.

Düşük Girişli CRISPR Genom Düzenleme ve Süspansiyon T Hücreleri ile 3D Hücre Modellerinde mRNA Transfeksiyonu için Dijital Mikrofluidik Elektroporasyon Platformu

Genom editörlerinin RNA olarak sunulması, birincil memeli hücrelerinin ve hücre hatlarının genomlarını değiştirmek için özellikle güçlü bir yöntemdir. Bu protokolün amacı, genom düzenleyicilerini mRNA olarak birincil memeli hücrelerine ve hücre hatlarına göndermek, ardından düzenleme sonuçlarını nicelendirmek için hedefli Illumina dizileme ve analizi yapmaktır.

Birincil memeli hücrelerinde editör RNA'nın elektroporasyonu yoluyla genom düzenlemesi

Öğrenin, yeni nesil elektroporasyon ile insan Th17 hücrelerine küçük RNA transfeksiyonu yapmayı. Bu yöntem, T hücre farklılaşması ve bağışıklık fonksiyonu araştırmalarında yüksek verimlilik sağlar.

Yeni Nesil Electroporasyonun tarafından İlköğretim İnsan Th17 Hücreleri Küçük RNA Transfeksiyon

Daha fazla video keşfet