Name: S100A12nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Öğrenin, S100A12 proteininin ekspresyonu, saflaştırılması ve H. pylori'ye karşı antimikrobiyal aktivitesinin ölçümü için optimize edilmiş bu yöntemi. Yüksek verimli stabil dimer elde ederek besin metal bağlama kapasitesini inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Gaziler İşleri Kariyer Geliştirme Ödülü 1IK2BX001701, Ulusal Bilimsel Araştırma Vakfı İleri Düzeyde Ulusal Merkezi&#39;nden CTSA ödülü UL1TR000445, Ulusal Bilim Kurumu Ödül Numaraları 1547757 ve 1400969 ve NIH hibe GM05551 tarafından desteklendi. İçeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Transaksiyonel Bilimler Geliştirme Ulusal Merkezi veya Ulusal Sağlık Enstitüleri&#39;nin resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1. S100A12&#39;nin ifadesi <ol><li> Yetkili BL21 DE3 hücrelerini standart bir ısı şok protokolü kullanarak pGEMEX-S100a12 plazmid ile değiştirin 18 . Buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpünde bakteri 50 mcL plazmid 1 ila 5 mcL ekleyin. 20 dakika inkübe edin. </li><li> Isı hücreleri 42 ° C&#39;de 30 saniye boyunca şoklanır. </li><li> Hücreleri 2 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Hücrelere 500 μL SOC ortamı ekleyin. 1 saat boyunca bir orbital çalkalayıcıda 250 dev / dak&#39;da çalkalayarak 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> LB-agar ortamında (100 ug / mL ampisilin ile takviye edilmiş) 150 μL transformasyon reaksiyonu plakası. 12-16 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bir koloni seç. 2 mL LB (100 μg / mL ampisilin takviyeli) aşılayın. </li><li> Orbital çalkalayıcıda (300 dev / dak.) 37 ° C&#39;de 4-6 saat inkübe edin. OD 600 , 1-3 absorbans birimi arasında okunmalıdır. </li><li> 50 mL ZYM-5052 autoindu&#39;ya başlangıç ​​kültürü 500 mcL ekleyinCtion media 26 , 100 μg / mL ampisilin ile takviye edilmiştir. En iyi havalandırma ve maksimum ekspresyon için, 250 mL&#39;lik şaşkın bir Erlenmeyer şişeyi kullanın. 37 ° C&#39;de 24 saat boyunca çalkalayın (300 rpm). </li><li> Bakteri süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri 4 ° C&#39;de santrifüj (4,000 xg, 10 dakika) ile peletleyin. </li><li> Ortamı süzün, numuneyi alın ve -80 ° C&#39;de hücre pastasını saklayın. Numune yıllarca istikrarlıdır. </li></ol> 2. Düşük Basınçlı Kromatografi Kullanılarak S100A12&#39;nin Saflaştırılması <ol><li> 30 mL 20 mM Tris, pH 8.0 içinde süspansiyon hücreleri. </li><li> Hücreleri lize etmek için süspansiyonu son haline getirin. ~ 20 W çıkış, 5 sn açık ve 5 sn kapalı 5 sn kapalı kullanın. </li><li> Çözümü yüksek hızlı santrifüj tüplerine aktarın. Hücre lisatını 4 ° C&#39;de 30 dakika süreyle 20,000 xg santrifüjle açıklayın. </li><li> Yüzey maddeyi boşaltın ve temiz bir 100 mL polipropilen beherine aktarın. Çözeltiyi buz üzerinde bırakarak soğutun. Bir karıştırma ba ekleyinR karıştırın ve yavaş yavaş 11.20 g amonyum sülfat ekleyin. Çözeltinin buz üzerinde bir saat daha karıştırmasına izin verin. Bu,% 60 amonyum sülfat solüsyonu oluşturacak ve E. coli endojen proteinlerinin çoğunu çöktürecektir. S100A12 çözünebilir durumda kalır. </li><li> Çözeltiyi 4 ° C&#39;de, 20.000 xg&#39;de 20 dakika boyunca santrifüjden geçirerek çöktürülmüş proteinin pelet haline getirin. </li><li> Süpernatantı boşaltın ve diyaliz borusuna aktarın (MWCO 3,500 kDa). 4 ° C&#39;de 1 L 20 mM Tris, pH 8.0 karşısında dialize edin. Diyaliz tamponunu iki kez değiştir. Değişiklikler arasında 4 saat izin ver. </li><li> Anyon değişim kromatografisi <ol><li> Düşük basınçlı bir sistemde kromatografi uygulayın. Tipik akış hızı 1 mL / dak&#39;dır. </li><li> 5 mL Sepharose sütununu 10 mL 20 mM Tris, pH 8.0 ile dengeleyin. </li><li> ~ 40 mL S100A12 çözeltisini örnek pompayı kullanarak yükleyin (akışı toplayın). </li><li> Kolonu 10 mL 20 mM Tris, pH 8 ile yıkayın. </li><li> Sütunu% 0-30 gradyan ile geliştirin (BuFfer B, 20 mM Tris, pH 8.0, 1 M NaCI&#39;dir) 19 sütun hacmi (CV, 95 mL) üzerinde. 5 mL&#39;lik fraksiyonları toplayın. </li><li> Her fraksiyonun 10 mcL kısımlarını alın ve Coomassie boyası ile MES SDS PAGE kullanarak analiz edin. 30 dakika süreyle sabit voltaj (20 V / cm) kullanarak jel çalıştırın. </li><li> S100A12 içeren havuz fraksiyonları. S100A12, bir denatüre edici jel üzerinde ~ 10 kDa protein ile çalışır. </li><li> Bir ultrafiltrasyon cihazı (MWCO 10 kDa) kullanarak fraksiyonları 5 mL&#39;ye konsantre edin. ~ 8 dakika boyunca 3000 xg&#39;de santrifüjleyin. En üstteki kesimi alın. </li></ol></li><li> Ebat-eksklüzyon kromatografisi <ol><li> S75 sütununu 1 CV (120 mL) 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl ile dengeleyin. </li><li> &lt;5 mL konsantre S100A12 fraksiyonlarını enjekte edin (iyon değişim kromatografisinden). </li><li> Kolonu, 120 mL üzerinde 1 mL / m&#39;lik bir akış hızında geliştirin. 5 mL&#39;lik fraksiyonları toplayın. </li><li> Her fraksiyonun 10 uL&#39;lik bir alikotu alın ve Coomassie boyası ile SDS PAGE kullanarak analiz edin. Kullanarak protein kimliğini doğrulayınBatı leke veya kütle spektrometresi (10.575.0 Da monomerik alt biriminin hesaplanmış moleküler kütlesi, 10575.4 Da ölçülmüştür). </li></ol></li><li> Havuz fraksiyonları <ol><li> Bir spektrofotometre kullanarak A 280 proteininin absorbansını ölçün. SEC tamponunu boş olarak kullanın. S100A12 homodimeri için hesaplanan sönüm katsayısı 5960 M -1 cm &quot; 1&#39;dir. NOT: Tipik verim 50 mL kültür başına 35-45 mg S100A12&#39;dir. </li><li> Parçacık S100A12 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine (1 mg / tüp) aktarılır, sıvı nitrojende flash dondurulur ve -80 ° C&#39;de saklanır. </li></ol></li></ol> 3. Antimikrobiyal Aktivite Testleri <ol><li> % 5 koyun kanı (kan agar plakaları) ile takviye edilmiş tamponlu soya agar plakalarına H. pylori suşu çizdirin. Oda havasındaki 37 ° C&#39;de% 5 karbon dioksit ile desteklenmiş 2-3 gün büyütün. </li><li> H. pylori&#39;yi 1x kolestrol ile desteklenmiş Brucella suyu içine aşılayın. Üzerinde kültürOda havasında 37 ° C sıcaklıkta gece sallayarak (250 dev / dak.)% 5 karbon dioksit ile takviye edilmiştir. </li><li> H. pylori 1: 10&#39;u% 50 Brucella suyu,% 50 kalprotein tamponu artı 1x kolesterol ve kültür ortamında tek başına veya 100 uM çinko klorür artı 0, 100 veya 1000 μg / mL arıtılmış S100A12 ile takviye haline getirin. Kültür oda sıcaklığında gece boyunca 37 ° C&#39;de çalkalanarak (250 rpm)% 5 karbon dioksit ile takviye edildi. </li><li> Ertesi gün, seri seyreltmeler yapın ve kan agar plakalarına koyun. Bakteri kolonilerinin oda havasında 37 ° C&#39;de 2-3 gün boyunca% 5 karbon dioksit ile takviye edilmesine izin verin. S100A12 ve / veya eksojen çinko varlığında veya yokluğunda bakteri üremesini hesaplamak için koloni oluşum birimlerini numaralandırın. </li></ol>

<ol><li>Schiopu, A., Cotoi, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A8+and+S100A9%3A+DAMPs+at+the+crossroads+between+innate+immunity%2C+traditional+risk+factors%2C+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease.</a> Mediators Inflamm. 2013, 828354(2013).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A9+induced+inflammatory+responses+are+mediated+by+distinct+damage+associated+molecular+patterns+%28DAMP%29+receptors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 10 (2), e0115828(2015).</li>
<li>Chernov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium-binding+proteins+S100A8+and+S100A9+initiate+the+early+inflammatory+program+in+injured+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).</li>
<li>Fanjul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+MRP8+and+MRP14+in+pancreatic+cell+lines%3A+differential+expression+and+localization+in+CFPAC-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells.</a> Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).</li>
<li>Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+S100A8+and+S100A9+proteins%3A+self-assembly+into+multifunctional+native+and+amyloid+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes.</a> Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).</li>
<li>Smith, S. P., Shaw, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+change-in-hand+mechanism+for+S100+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A change-in-hand mechanism for S100 signalling.</a> Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).</li>
<li>Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nrc/journal/v15/n2/full/nrc3893.html">S100 proteins in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).</li>
<li>Leclerc, E., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca2%2B%2FZn2%2B+signaling+S100+proteins+and+RAGE+in+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Schol+Ed%29%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine.</a> Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).</li>
<li>Goyette, J., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-associated+S100+proteins%3A+new+mechanisms+that+regulate+function%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function.</a> Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).</li>
<li>Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+immunity+beyond+iron%3A+a+role+for+manganese+and+zinc%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc.</a> Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).</li>
<li>Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Immunity%3A+S100+Proteins+at+the+Host-Pathogen+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface.</a> J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).</li>
<li>Realegeno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A12+Is+Part+of+the+Antimicrobial+Network+against+Mycobacterium+leprae+in+Human+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages.</a> PLoS Pathog. 12 (6), e1005705(2016).</li>
<li>Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+Calgranulins+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">S100 Calgranulins in inflammatory arthritis.</a> Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).</li>
<li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex%3A+implications+for+host-parasite+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li>
<li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc%3A+new+insights+into+S100A12+oligomerisation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).</li>
<li>Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+structural+states+of+S100A12%3A+A+key+to+its+functional+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity.</a> Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).</li>
<li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li>
<li>Haley, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Antimicrobial+Protein+Calgranulin+C+Participates+in+Control+of+Helicobacter+pylori+Growth+and+Regulation+of+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence.</a> Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).</li>
<li>Cover, T. L., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori in health and disease.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).</li>
<li>Tham, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+genotypes%2C+host+factors%2C+and+gastric+mucosal+histopathology+in+peptic+ulcer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease.</a> Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).</li>
<li>Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori-associated+gastritis+and+primary+B-cell+gastric+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma.</a> Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).</li>
<li>Correa, P., Piazuelo, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gastric+precancerous+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dig+Dis%22%5BJournal%5D)">The gastric precancerous cascade.</a> J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).</li>
<li>de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+cancer%3A+epidemiology+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Gastric cancer: epidemiology and risk factors.</a> Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).</li>
<li>Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+Helicobacter+pylori+infection+before+initiation+of+the+adaptive+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).</li>
<li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+protein+calprotectin+modulates+the+Helicobacter+pylori+cag+type+IV+secretion+system+via+zinc+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004450(2014).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+clones+and+auto-induction+for+protein+production+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli.</a> Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).</li>
<li>Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+transition+metals+to+S100+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Binding of transition metals to S100 proteins.</a> Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).</li>
<li>Corbin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelation+and+inhibition+of+bacterial+growth+in+tissue+abscesses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses.</a> Science. 319 (5865), 962-965 (2008).</li>
<li>Kehl-Fie, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+metal+sequestration+by+calprotectin+inhibits+bacterial+superoxide+defense%2C+enhancing+neutrophil+killing+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus.</a> Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).</li>
<li>Liu, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+sequestration+by+the+neutrophil+protein+calprotectin+enhances+Salmonella+growth+in+the+inflamed+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut.</a> Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).</li>
<li>Damo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+manganese+sequestration+by+calprotectin+and+roles+in+the+innate+immune+response+to+invading+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).</li>
<li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).</li>
<li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+Resists+the+Antimicrobial+Activity+of+Calprotectin+via+Lipid+A+Modification+and+Associated+Biofilm+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation.</a> MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).</li>
<li>Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+requirements+and+antibiotic+resistance+patterns+of+Helicobacter+species+in+chemically+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media.</a> J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).</li>
<li>Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+calgranulin+proteins+S100A8%2C+S100A9+and+S100A12+are+expressed+in+the+inflamed+gastric+mucosa+of+Helicobacter+pylori-infected+children%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children.</a> Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).</li>
<li>Wilkie-Grantham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase-dependent+lipid+peroxidation+promotes+the+oxidative+modification+of+cytosolic+proteins+in+phagocytic+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils.</a> J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

İnsan S100A12&#39;nin ekspresyonu ve saflaştırılması için etkili bir protokol sunulmuştur. E. coli ekspresyon sistemi, özellikle biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar için mg miktarları gerektiğinde rekombinant proteinlerin üretimi için kullanılan en yaygın araçtır. Burada tarif edilen prosedürün anahtar geliştirilmesi, standart Luria besiyeri ortamı 18 ile ekspresyona kıyasla saflaştırılmış proteinin verimini neredeyse otuz kadar arttıran otomatik endüksiyon medyasının <sup class="xre...

S100 proteinleri, çeşitli fonksiyon dizisine sahip 1 EF-el ailesi kalsiyum bağlayıcı proteinlerin bir sınıfıdır. Bunlar doku ve hücreye spesifik bir şekilde ifade edilir ve geniş bir hücre fonksiyonları yelpazesini 2 , 3 düzenler. Kalsiyum bağlayıcı proteinlere özgü olan S100 proteinleri hem hücre içi hem de hücre dışı işlevleri gösterirler 4 , 5 . Hücre içinde, Ca 2 + bağlanması özellikle protein bağlama ortakları 6 hedefleyen bir hidrofobik yüzey ortaya bir yapısal değişiklik indüklenir. Bu hücre içi mekanizma hücre proliferasyonu, farklılaşma ve enerji metabolizması gibi önemli süreçleri düzenler. Ekstraselüler çevrede, S100 proteinleri iki işlev sergilemektedir 7 . Birinde, moleküler model (DAMP) proteinlerine hasar gibi davranırlar ve bir pro-inflammayı başlatırlarKalıp tanıma reseptörleri 8 , 9 ile etkileşim yoluyla bağışıklık cevabını ileri sürmek. Ek olarak, S100 protein sınıfının birkaç üyesi, geçiş metallerini, besleyici bağışıklık 10 , 11 olarak adlandırılan bir süreçte mikrobik patojenlere aç bırakmaya hizmet eden bir işlevi saklar. S100A12 (aynı zamanda calgranulin C ve EN-RAGE olarak da bilinir), makrofajlar ve nötrofillerde yüksek oranda eksprese edilir ve inflamatuar hastalıklar için potansiyel bir biyolojik belirteç olarak tanımlanmıştır 12,13. EF-Hand bölgelerinde kalsiyumu bağlamaya ek olarak, S100A12 dimer arayüzünün 14 , 15 karşı uçlarında bulunan iki yüksek afiniteli geçiş metali bağlama mevkisine sahiptir. Her bir bağlanma yeri, üç histidin kalıntısı ve bir aspartik asit kalıntısı içerir ve çinko veya bakır &lt;Sup class = &quot;xref&quot;&gt; 16 , 17 . Yakın zamanda, S100A12&#39;ye bağımlı çinko açlığın, Helicobacter pylori büyümesini ve pro-inflamatuar virulans faktörlerinin aktivitesini düzenleyen önemli olduğunu bildirdik. H. pylori , dünyadaki insan nüfusunun yaklaşık yarısının karnını enfekte eder; Bunu en başarılı bakteriyel patojenlerden biri haline getirir 19 . H. pylori ile enfeksiyon gastrit, peptik ve duodenal ülser, mukoza ilişkili lenfoid doku (MALT) lenfoma ve invaziv gastrik adenokarsinoma (mide kanseri) gibi önemli gastrik hastalık sonuçlarına yol açabilir. Karaciğer kanseri, dünyada kardiyovasküler kansere bağlı ölümlerin önde gelen sebebidir ve mide kanseri için tek büyük ilişkili risk faktörü H. pylori ile enfeksidir. H. pylori , gevrek olmasına rağmen mide nişinde devam ederBu bakteriyel enfeksiyonu kontrol altına almak için bağışıklık mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına ihtiyaç olduğunu vurguladı. H. pylori&#39;ye bağlı inflamasyon, enfeksiyon yeri 18 , 24 , 25&#39;de S100A12 de dahil olmak üzere antimikrobiyal proteinlerin bir repertuarını depolayan polimorfonükleer hücrelerin veya nötrofillerin derin infiltrasyonu ile karakterizedir. Ev sahibi ve patojen arasındaki karmaşık diyalogu anlamak için, S100A12&#39;yi saflaştırma tekniğini hassaslaştırmaya ve bu tıbbi açıdan ilgili patojene uyguladığı antimikrobiyal etkiyi incelemek için kullanmaya çalıştık. Aşağıdaki protokol, biyolojik açıdan aktif durumda S100A12 saflaştırması için geliştirilmiş bir tekniğin özetini vermektedir; Besleyici metalleri yüksek oranda bağlayabilenBunları işgal altındaki mikroorganizmalara toplayıp onları şelale haline getirin. Ayrıca, aşağıdaki yöntemler, bu proteinin, doğuştan gelen antimikrobiyal moleküllerin bakteriyel patojenlerin büyümesini sınırlandırdığı mekanizmayı incelemek için kritik bir reaktif olarak kullanılmasını vurgulamaktadır. S100A ailesindeki proteinler, konak savunmasının yanı sıra bağışıklık sinyalizasyonuna katılan doğal bir bağışıklık sistemi molekülünün önemli bir parçası olarak takdir kazanmışlardır. Bunların en iyi çalışılanı kalprotektindir (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin, dimer ara yüz 31&#39;de geçiş metallerini bağlayan S100A8 ve S100A9 alt birimlerinin bir heterodimeri oluşturan nötrofile bağlı bir proteindir. Calprotectin&#39;in iki metal bağlama sahasına sahip olduğu gösterilmiştir: Site 1, Zn 2+ , Mn 2+ veya Fe 2+ &#39;yi bağlayabilir ve Site 2,<html> Zn 2+ 31 , 32&#39;yi bağlayın . Calprotectinin, Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli ve H. pylori gibi çeşitli patojenlere karşı antimikrobiyal etkinlik gösterdiğini ve önleyici etkilerin calprotectin 25 , 28&#39;in metal şelasyon aktivitesinden kaynaklandığını gösteren çok sayıda rapor var. , 29 . Calprotectin, dış membrandaki lipit A yapısının değiştirilmesi, cag -Type IV salgılama sisteminin ( H. pylori içinde önemli bir proenflamatuar virulans faktörüdür) bastırılması, biyofilm oluşumuna neden olması ve bastırılması da dahil olmak üzere H. pylori üzerinde çok sayıda etkinlik sergilediğini gösterdi H. pylori büyümesi ve canlı dozu doza bağımlı bir şekildeClass = &quot;xref&quot;&gt; 25 , 33 . Dahası, genetik ve biyokimyasal analizler, H. pylori&#39;ye karşı calprotectin&#39;in antibakteriyel etkisinin büyük oranda besleyici çinkoyu 25 bağlama yeteneğinden kaynaklandığını ortaya koymuştur. H. pylori , bu patojenin büyümesi ve çoğalması için mikrobesin gereksinimlerini belirlemek için kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam kullanan önceki araştırmalar tarafından belirlendiği üzere çinko gerektirir 34 . Buna ek olarak, kalprote- tein, H. pylori ile enfekte dokular içinde oldukça miktarda bulunur ve nötrofilik infiltratlarla ilişkili olup, konakçıya enfeksiyondan sonra inflamasyon sırasında kalprotektini antimikrobiyal bir strateji olarak kul- lanılabilir. Yansız proteomik tarama tekniklerinden elde edilen son bulgular, reaktif oksijen türlerinin bol olduğu koşullar altında, kalprotecKalay, hekza-histidin bağlanma yerini değiştiren, dolayısıyla proteinin metal bağlanma aktivitesini inhibe eden translasyon sonrası modifikasyonları gerçekleştirir 36 . Bu nedenle, bu moleküllerin geniş repertuarındaki diğer S100A ailesindeki proteinlerin potansiyel olarak yardımcı metal-kıskaçlayıcılar olarak işlev görebileceğini varsaydık. Daha sonraki çalışma için S100A12&#39;yi seçtik çünkü söz konusu translasyon sonrası modifikasyon ekranı üzerinde tanımlanmadı, çinkoyu bağlama kapasitesine sahipti ve H. pylori ile enfekte olmuş kişilerden türetilen insan dokularında oldukça bol miktarda bulunur. Çalışmalarımız, S100A12&#39;nin, H. pylori&#39;nin G27 suşunda H. pylori büyümesini ve yaşayabilirliğini doza bağımlı bir şekilde inhibe edebildiğini ve bu proteinin antimikrobiyal aktivitesinin fazla besleyici çinko ilavesiyle tersine çevrilebileceğini gösteriyor. Bu çalışma, S100A12&#39;nin PMSS1 ve 7.1&#39;e karşı antimikrobiyal etkinlik gösterdiğini gösteren önceki çalışmamızı tamamlamaktadır3 suşu H. pylori , sayısız klinik izolelere ve laboratuara uyarlanmış H. pylori suşlarına karşı geniş antibakteriyel etkisini göstermektedir. Birlikte, bu sonuçlar S100A12&#39;nin besleyici bağışıklık yoluyla bakteri gelişimini ve proliferasyonunu kontrol eden bir mekanizma olarak önemini teyit eder. Bu önemli konak-bakteriyel etkileşimin gelecekteki çalışmaları arasında, konukçu dokulardaki bakteri yükünü azaltmak veya H. pylori enfeksiyonu bağlamında bu proteinin bağışıklık sinyalizasyonuna katkısını belirlemek için S100A12 aktivitesini kullanmak yer alabilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü>S100A12 İfade< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > İfade hücreleri< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL 21 (DE3) yetkili hücreler</td><td>New England Biolabs</td><td>C25271</td><td></td></tr><tr><td>Otoindüksiyon ortam bileşenleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>Y20020-250.0</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>S23020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>T60060-250.0</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2877</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>M65240-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</alt></td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>S23100-500.0</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>P41200-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>A20424-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>S25150-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Uluslararası Gliserol</td><td>Araştırma Ürünleri</td><td>G22020-1.0</td><td></td></tr><tr><td>D-glikoz</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>G32040-500.0</td><td></td></tr><tr><td>laktoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2643</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Seçim ajanı</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ampisilin</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>A40040-5.0</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>S100A12 Saflaştırma</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA Start Kromatografi Sistemi</td><td>GE</td><td>29-220-94</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q Sefaroz Hızlı Akış</td><td>GE</td><td>17-5156-01</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td><td>GE</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop lite spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-LITE</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>T60040-1000.0</td><td></td></tr><tr><td> H. pylori Kültür</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kan agar plakaları</td><td>Laboratuvar Tedarik Şirketi</td><td>BBL221261</td><td></td></tr><tr><td>Brucella suyu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3051</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol (250x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Tris Baz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Çinko Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229997</td><td></td></tr></tbody></table>

s100a12&#39;nin ekspresyon, saflaştırma ve antimikrobiyal aktivitesi

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteinleri doğal bağışıklığın önemli aracılarıdır ve EF el ailesinin kalsiyum bağlayıcı proteinlerin S100 sınıfının üyesidir. Bazı S100 proteinleri, geçiş metallerini yüksek afinite ile bağlama kapasitesine sahiptir ve bunları, &quot;beslenme bağışıklığı&quot; olarak adlandırılan bir süreçte mikrobiyal patojenlere işgal etmekten alıkoyar. S100A12 (EN-RAGE), hem çinko hem de bakırı bağlar ve makrofajlar ve nötrofiller gibi doğal immün hücrelerde oldukça bol miktarda bulunur. S100A12&#39;nin aktif, metal bağlayıcı konfigürasyonunda ekspresyon, zenginleştirme ve saflaştırma için rafine edilmiş bir metodu sunuyoruz. Bakteriyel büyüme ve canlılık analizlerinde bu proteinin kullanılması, S100A12&#39;nin bakteri patojeni Helicobacter pylori&#39;ye karşı antimikrobiyal etkinliğe sahip olduğunu ortaya koymaktadır . Antimikrobiyal aktivite, besleyici çinkoyu kenetleyen S100A12&#39;nin çinko bağlanma aktivitesine dayandığından, büyüme için çinko gerektiren H.pylori&#39;yi açlıktan besler ve proliferation.

S100A12 ifade ve saflaştırma Üç aşamalı bir saflaştırma 50 mL bakteri kültüründen ~ 40 mg rekombinant S100A12 üretti. İlk adım, endojen E. coli proteinlerinin amonyum sülfat çökeltilmesiydi. Bu aşamayı anyon değişim kromatografisi izledi ( Şekil 1A ). Protein, Coomassie Brilliant Blue ile boyanan bir SDS-PAGE ile izlenir ( Şekil 1B ). Saflaştırma prosedürünün son adımı p...

Burada, S100A12&#39;yi (calgranulin C) ifade etmek ve saflaştırmak için bir yöntem sunuyoruz. İnsan patojen H. pylori&#39;ye karşı antimikrobiyal aktivitesini ölçmek için bir protokolü açıklıyoruz.

S100A12&#39;nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Bu protokolün genel amacı, antimikrobiyal analizlerde kullanılabilmesi için S100A12'nin aktif formunun izolasyonunu ve saflaştırılmasını kolaylaştırmaktır. Bu yöntem, patojenik bakterilerin neden olduğu enfeksiyona yanıt olarak üretilen antimikrobiyal bir peptid olan S100A12'nin rolünün ne olduğu gibi mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, optimize edilmiş protokolümüzün, besin metallerini bağlama ve hapsetme kapasitesine sahip, stabil ve saf S100A12 dimerinin yüksek verimle elde edilmesini sağlamasıdır.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşarlar; çünkü S100A12 belirli koşullar altında farklı boyutlarda oligomerler oluşturur ve bu oligomerlerin in vitro antimikrobiyal aktiviteleri azalmıştır. Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, kalprotektin olarak adlandırılan ilgili bir S100A ailesi proteinini saflaştırmaya ve antimikrobiyal aktivitesini incelemeye başladığımızda ortaya çıktı. Bu yöntemin görsel gösterimi, boyut ve kolonla yapılan son saflaştırma adımları için kritik öneme sahiptir.Antimikrobiyal analizler, bu sürecin başarısı için önemlidir. Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği şekilde kompetan BL21 DE3 hücrelerini transforme edin. Ardından, buz üzerinde bulunan bir mikrosantrifüj tüpündeki 50 µL bakteriye bir ila beş µL plazmid ekleyin.20 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, hücrelere 42 °C'de 30 saniye boyunca ısı şoku uygulayın. İki dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.Ardından, 500 µL SOC medyumu ekleyin. 37 °C'de, orbital çalkalayıcıda 250 rpm hızda bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, transformasyon reaksiyonundan 150 µL'yi, 100 µg/mL ampicillin ile desteklenmiş LB agar medyumu üzerine ekleyin.37 °C'de 12 ila 16 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, tek bir koloni seçin ve ampicillin eklenmiş 2 mL LB besiyerine inoküle edin. Bir orbital çalkalayıcıda, 300 rpm'de, 37 °C'de dört ila altı saat boyunca inkübe edin.Ardından, 50 mL ampicillin katkılı ZYM 5052 otoindüksiyon besiyerine 500 µL başlangıç kültürü ekleyin. 37 °C'de, 300 rpm hızında 24 saat boyunca çalkalayın. Daha sonra, bakteri süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın.4.000 ×g'de ve dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjleme işleminden sonra medyumu boşaltın, örneği kaydedin ve hücre pastasini eksi 80 derece Celsius'ta saklayın. Başlamak için, hücre pastasini pH 8.0'da 30 mililitre 20 milimolar tris içinde resüspande edin. Ardından, hücreleri lizlemek için süspansiyonu buz üzerinde, beş saniye açık ve beş saniye kapalı döngü kullanarak 20 watt'ta beş dakika boyunca sonikasyona tabi tutun.Sonikasyon uygulanmış çözeltiyi yüksek kaliteli santrifüj tüplerine aktarın. Hücre lizatını berraklaştırmak için 4 °C'de 20,000 ×g hızında 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, süpernatantı temiz 100 mL'lik polipropilen bir behere dekante edin.Çözeltiyi soğutmak için beheri buz üzerine yerleştirin. Bir manyetik karıştırıcı ekleyin ve yavaşça 11.20 gram amonyum sülfat ilave edin. Çözeltiyi buz üzerinde bir saat boyunca karıştırın.Ardından, çözeltiyi santrifüj tüplerine aktarın ve çöktürülen proteini peletlemek için 4 °C'de 20.000 ×g hızda 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı diyaliz tüpüne boşaltın. 4 °C'de ve pH 8.0'de, bir litre 20 mM tris karşısında diyaliz yapın. Diyaliz tamponunu, her değişim arasında dört saat olacak şekilde iki kez değiştirin.Bundan sonra, beş mililitrelik bir sepharose kolonunu 10 mililitre 20 milimolar tris ile dengeleyin. Numune pompasını kullanarak yaklaşık 40 mililitre S100A12 çözeltisi yükleyin. Akış sonrası sıvıyı toplayın.Ardından, kolonu 20 millimolar tris ile yıkayın. 19 kolon hacmi boyunca %0'dan %30'a kadar olan bir gradyan kullanarak kolonu geliştirin. Beş mililitrelik fraksiyonlar toplayın.Her fraksiyonun 10 microliter'lik bir alikotunu analiz etmek için coomassie boyamalı MES SDS page kullanın. Ardından, S100A12 içeren fraksiyonları ayırın. Bir ultra filtrasyon cihazı kullanarak fraksiyonları beş mililitreye konsantre edin.Bunun ardından, bir S75 kolonunu 20 millimolar tris ve 100 millimolar sodyum klorür içeren 120 mililitrelik bir çözelti ile dengeleyin. Konsantre fraksiyonlardan oluşan beş mililitrelik örneği enjekte edin. Sonrasında, kolonu dakikada bir mililitre akış hızında 120 mililitre boyunca yürütün.Beş mililitrelik fraksiyonlar toplayın. Coomassie boyamalı SDS-PAGE kullanarak, her örneğin 20 mikrolitrelik bir alikotunu analiz edin. Ardından, metin protokolünde belirtildiği şekilde protein kimliğini doğrulayın ve fraksiyonları çekin.Başlamak için, H.pylori'yi 1X kolesterol ile desteklenmiş brucella besiyerine ekin. %5 karbondioksit takviyeli havada, 37 °C'de ve 250 rpm sarsıntıyla gece boyunca kültüre edin. H.pylori'yi, %50 brucella besiyeri ve %50 kalprotektin tamponu artı 1X kolesterol karışımında bir eze ona dilüe edin.Ve gerektiği şekilde S100A12 proteini ve/veya eksojen metaller ekleyin. Antimikrobiyal analizler kritik bir noktadır. S100A12 dimerlerinin stabilitesini sağlamak için kalprotektin tamponu kullanmak ve bakteriyolojik büyüme analizleri için metalle sınırlı bir mineral ortamı sağlamak önemlidir; böylece protein, zengin kompleks bakteriyolojik ortamlarda yaygın olarak bulunan aşırı mikro besinlerle etkilenmeyecektir.Ertesi gün, örnekleri seri olarak seyreltin. Ardından, kanlı agar plaklarına ekin. Bakteri kolonilerinin %5 karbondioksit takviyeli havada, 37 °C'de iki ila üç gün boyunca büyümesini sağlayın.Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği üzere bakteriyel büyümeyi hesaplayın. Bu çalışmada, S100A12'nin aktif metal bağlayıcı konfigürasyonunda eksprese edilmesi ve saflaştırılması için geliştirilmiş bir yöntem sunulmuştur. Üç aşamalı saflaştırma işlemi, endojen E.coli proteinlerinin amonyum sülfat çöktürmesi ile başlar ve ardından anyon değişim kromatografisi takip eder.Protein, Coomassie Brilliant Blue ile SDS-PAGE üzerinden takip edildikten sonra, S100A12 içeren fraksiyonlar boyut dışlama kromatografisi için ayrılır. S100A12, alt birim başına 92 amino asit içeren bir homodimerdir ve toplam moleküler ağırlığı yaklaşık 21 kilodaltondur.S100A12'nin antimikrobiyal aktivitesi daha sonra kantitatif mikrobiyolojik kültür teknikleri aracılığıyla incelenir. Bakteri hücrelerinin sayımı, eksojen bir besin kaynağı olan çinkonun varlığında veya yokluğunda 100 µg/mL S100A12'ye maruz kalmanın bakteri canlılığını anlamlı düzeyde inhibe etmediğini ortaya koymaktadır. Ancak, tek başına besiyerinde 1.000 µg/mL S100A12'ye maruz kalmak, bakteri canlılığında 69 katlık bir azalma ile sonuçlanmaktadır.Ekzojen bir çinko besin kaynağı eklenmesi bu sonucu tersine çevirir; bu durum, S100A12'nin antimikrobiyal aktivitesinin çinko bağlama aktivitesine bağlı olduğunu kanıtlamaktadır. Uygun şekilde gerçekleştirildiğinde, saflaştırmadaki protein ekspresyonu süreci, yöntem kavrandıktan sonra üç ila dört günde tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, ek soruları yanıtlamak için indüktif bağlı plazma kütle spektrometrisi gibi diğer yöntemler kullanılabilir.Metal sekestrasyonu mikrobiyal büyümeyi nasıl kısıtlar? Geliştirilmesinin ardından bu teknik, mikrobiyoloji alanındaki araştırmacıların H.pylori'nin besinsel immünitesini keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, antimikrobiyal protein S100A12'nin nasıl eksprese edileceği, saflaştırılacağı ve aktivitesinin nasıl nicelleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.H.pylori ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedür uygulanırken, BS2 sertifikalı bir alanda çalışmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır. Bu tekniğin etkileri; ülser, gastrit ve invaziv adneksiyal karsinom dahil olmak üzere gastrik hastalıkları kapsamaktadır.Bu süreçleri anlayarak, bu süreçleri hedef alan yeni antimikrobiyal moleküller geliştirmek için daha donanımlı hale geleceğiz. Bu yöntem, S100A ailesi proteinlerinin biyokimyası hakkında içgörü sağlayabilmesinin yanı sıra, bunların bağışıklık sinyalizasyonundaki rollerini ve kanser, artrit ve bulaşıcı hastalıklar gibi çok sayıda hastalık sürecini incelemek için de uygulanabilir.

expression-purification-and-antimicrobial-activity-of-s100a12

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu videoda, bir Escherichia coli kültüründen alınan proteinin net yüzey yüküne dayalı olarak insan kalsiyum bağlayıcı protein S100A12 saflaştırmak için bir anyon değişim kromatografisi tekniği gösteriyoruz.

Anyon değişim kromatografisi bazlı protein saflaştırması: Net yüke dayalı olarak diyaliz edilmiş bakteri lizatından ilgilenilen bir proteini izole etmek için bir ayırma tekniği

Bu video, patojenik bir bakteri olan Staphylococcus aureus tarafından üretilen proteinlerin izole insan polimorfonükleer lökositleri (PMN'ler) üzerinde sitotoksisitesini araştırmak için bir testi göstermektedir. Salgılanan sitotoksik proteinler, PMN hücre zarı üzerinde gözenekler oluşturarak hücre ölümünü başlatır. Ölü hücreler propidyum iyodür kullanılarak boyandıktan sonra, ölü hücrelerin miktarını belirlemek ve bakterilerin sitotoksisitesini değerlendirmek için akış sitometrisi yapılır.

PMN'lerde Bakteriyel Hücre Dışı Protein Aracılı Sitotoksisite için Bir Test

Yüksek kaliteli maya hücre ekstrelerinin hazırlanması bireysel proteinler veya tüm proteomlarda analizinde gerekli bir ilk adımdır. Burada protein fonksiyonları, etkileşimleri ve translasyon sonrası modifikasyonlar korumak için optimize edilmiştir tomurcuklanan maya hücreleri için, hızlı, verimli ve güvenilir homojenizasyon protokol açıklar.

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Burada, keratinositler üzerinde sterptolisin S, grup A streptococcus tarafından üretilen bir salgılanmış toksin etkilerini incelemek için geçirgen bir membran geçme tabanlı enfeksiyon sistemi kullanılarak bir yöntem tarif edilmektedir. Bu sistem, kolaylıkla enfeksiyon sırasında çeşitli ev sahibi hücre tipleri diğer salgılanan bakteriyel proteinlerin çalışmaya uygulanabilir.

Bir Geçirgen Membran Ekle tabanlı Enfeksiyon Sisteminin Uygulanması memeli konakçı hücreleri üzerinde salgılanan Bakteriyel Toksinler Etkilerinin Eğitim için

Protokol Escherichia colisunar-lactococcal antimikrobiyal peptid nisin içine seçici basınç birleşme kanonik olmayan amino asit (ncAAs) dayalı. Özelliklerini rekombinant ifade ile ikame ile tanımlanmış büyüme medya istenen ncAAs sırasında değiştirilebilir. Bioactivity ortaya çıkan değişimler büyüme inhibisyon deneyleri ve floresan mikroskopi tarafından eşleştirilir.

Antimikrobiyal peptidler kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından üretilen

Doğuştan gelen bağışıklık MALT1 düzenleyen ama nasıl oluşur kötü tanımlanmış kalır. Biz doğuştan gelen sinyal MALT1 myeloid sitokinler, üretimini düzenler gösteren Toll benzeri veya C tipi lektin-benzeri reseptörler aşağı ve aşağı akım için MALT1 katkısını çözülmeye selektif MALT1 paracaspase inhibitörü MLT-827 kullanılan C tipi lektin benzeri reseptörlerinin seçerek.

Myeloid doğuştan gelen sinyal yolu düzenleme MALT1 Paracaspase etkinlik tarafından

Bu protokol, rekombinant etiketsiz kalsiyum bağlayıcı protein S100A12 ve insan monosit stimülasyonu tahlilleri için iyonkaynaklı oligomerler için bir arıtma yöntemini tanımlar.

İnsan S100A12 ve Bağışıklık Hücre Stimülasyonu için Iyon kaynaklı Oligomerlerin Saflaştırılması

Onun etiketi saflaştırma, diyaliz ve aktivasyon, bakterilerde çözünür, aktif matriks metalloproteinaz-3 katalitik alan protein ekspresyonunun verimini arttırmak için kullanılır. Protein fraksiyonları SDS-PAGE jelleri ile analiz edilir.

Afinite Kromatografisi Kullanılarak İnsan Matriksi Metalloproteinaz-3'ün Bakteriyel İfadesi ve Saflaştırılması

Bu el yazması, mutasyonlar termo için ekran insan serotonin taşıyıcı arındırmak, yüksek afiniteli antikorların üretilmesi ve antidepresan ilaç S -citalopramın bağlı serotonin taşıyıcı-antikor kompleksi kristalize açıklamaktadır. Bu protokol için diğer zor membran ileticileri, reseptör ve kanal çalışması için adapte edilebilir.

Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound<em&gt; S</em&gt; -citalopram

Bu makalede biyokimyasal miktarda deterjan çözündürüldükten TRPV1 spektroskopik analiz için elde için belirli yöntemleri açıklar. Kombine protokoller memeli iyon kanalları membran kontrollü bir ortamda yapısal ve fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırmak için uyarlanmış Biyokimya ve biyofizik araçları sağlar.

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Öğrenin, S100A12 proteininin ekspresyonu, saflaştırılması ve H. pylori'ye karşı antimikrobiyal aktivitesinin ölçümü için optimize edilmiş bu yöntemi. Yüksek verimli stabil dimer elde ederek besin metal bağlama kapasitesini inceleyin.

S100A12'nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Daha fazla video keşfet