Name: bir In vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Öğrenin, hızlı denge diyalizi yöntemiyle tüberküloz lezyonlarındaki kazeuma ilaç bağlanmasını nasıl öngörebilirsiniz. Bu protokol, köpük makrofaj kaynaklı matris kullanarak antimikrobiyal penetrasyonu değerlendirmeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz sırasıyla, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid ve tedizolid Bedaquiline sağlamak için Johnson &amp; Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Kaburga-X ve Trius Therapeutics teşekkür etmek istiyorum. Brendan Prideaux Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin Emma Rey-Jurado Nancy Ruel, Leyan Li ve Danielle Weiner MALDI analizi, biyoanalitik yöntemler, caseum vekil hazırlanması, kimyasal sentez ve tavşan caseum izolasyonu ile destek sağlamıştır. Bu çalışma V. Dartois NIH Paylaşılan Enstrümantasyon Grant S10OD018072 yanı sıra Mükemmellik Bir Merkezi için Bill ve Melinda Gates Vakfı ve Wellcome Trust ortak finansmanı için Bill ve Melinda Gates Vakfı tarafından finanse ödül # OPP1044966 ve OPP1024050 ile yürütülmüştür P. VVyatt&#39;a Gelişen Dünya Hastalıklar Kurşun Optimizasyonu için.

Tüm hayvan çalışmaları NIAID Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (NIH), Bethesda, MD onayı ile Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı Kılavuzu uyarınca gerçekleştirilmiştir. M. tuberculosis içeren tüm çalışmalarda biyo-güvenlik tutucu seviye 3 (BSL-3) ile birlikte bir laboratuarda gerçekleştirilmiştir. 1. Tavşan Enfeksiyon Modeli ve Caseum Koleksiyonu <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi bir sadece burundan bir aerosol uygulama sistemi kullanılarak Yeni Zelanda M. tuberculosis ile beyaz tavşan Infect. 12, 13 enfeksiyon 12-16 hafta boyunca ilerlemeye izin verin. Oturaklı 35 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg ksilazin kas içinden, birlikte tavşan 0.22 ml / kg pentobarbital sodyum ve fenitoin sodyum ile tavşan damar ötenazi ve nekropsilerden devam edin. </li><li> cımbız ve bir neşter kullanılarak, göğüs ca akciğerleri kaldırmakvity. Her akciğer lobundan, bir neşter yardımıyla bireysel boşlukları ve geniş nekrotik granülomları inceleyin. Kaseyi dikkatli bir şekilde boşluk ve granülom duvarlarından kazıyın. 2 mL vidalı kaptaki tüpleri tartın, kaydedin ve depolayın -20 ° C&#39;de kullanıma hazır oluncaya kadar saklayın. </li><li> Kuru buz üzerinde 3 MegaRad&#39;de bulaşıcı kazein örneklerini gamma radyasyona maruz bırakarak onları bir bulaşıcı olmayan ve güvenli bir BSL-2 laboratuarında kullanın. </li></ol> 2. THP-1 Hücrelerinden Kaseum Vekilinin in vitro Üretimi <ol><li> T175 hücre kültürü şişeleri (80 mL / şişe) içinde RPMI 1640 ortamında (2 mM L-glutamin ve% 10 sığır fetüsü serumu) THP-1 monositleri büyütün. Şişeleri 37 ° C&#39;de% 5 CO 2 atmosferinde 3-4 gün inkübe edin. </li><li> Kültürü, 150 xg&#39;de iki 50 mL konik tüp içinde T175 bir şişeden 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve 10 mL RPMI 1640 ortamda pelet askıya alınız. </li><li> 45 uL t içeren 1.5 mL tüp içine bu kültürden 5 μL pipetleMavi rippan. Pipetleme ile iyice karıştırın. 10 μL&#39;lik bir hemositometreye aktarın ve canlı bir THP-1 monosit sayısını (renklendirilmemiş) bir ışık mikroskopu (10X büyütme) kullanarak sayın. Kültür mL başına canlı hücrelerin sayısını hesaplayın. RPMI ortamı ile 1.25 x 106 hücre / mL nihai yoğunluğa kadar seyreltin. </li><li> Büyük bir hücre kültürü plakasına (50 x 10 6 hücre / tabağa) 40 mL kültür yükleyin. 40 uL 100 uM PMA (etanol içinde hazırlanmış forbol 12-miristat 13-asetat) ilave edin ve hücrelerin inkübatöre gece boyunca yapışmasına izin verin. NOT: PMA&#39;nın nihai konsantrasyonu 100 nM&#39;dir. </li><li> Saf oleik asit (OA) (0.89 g / mL), 0.1 M konsantrasyonunda etanol içinde ( yani , 968.3 uL etanolde 31.7 μL OA) seyreltin. Bu çözeltiyi taze önceden ısıtılmış RMPI ortamında 10 mM&#39;lik bir konsantrasyona kadar seyreltin. Bu OA süspansiyonunu önceden 37 ° C&#39;ye ısıtılmış RPMI ortamında 0,4 mM&#39;ye (son çalışma konsantrasyonu) seyreltin. </li><li> Mevcut medyayı çıkarın veYapışmış hücreleri hücre kültür plakalarından hafifçe ilave edin ve THP-1 makrofajlarına (THP-M) 40 mL 0.4 mM OA ekleyin. Gece inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Her bir THP-M&#39;de sayısız lipid cesedi kapanımının varlığını teyit etmek için 40x büyütmede hafif bir mikroskop kullanın. Hücre kültürü plakalardan tüm RPMI orta çıkarın ve 50 ml serolojik pipet kullanarak fosfat tamponlu salin (PBS) ile yapışkan hücreleri hafifçe yıkayın. NOT: THP-M&#39;nin sitoplazmasındaki lipit cisimler küçük, net, küresel yapılar olarak görünür. </li><li> PBS içinde 40 mL 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) her bir tabağa ilave edilir. 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edin. </li><li> Köpüklü makrofajları (FM), 10 mL&#39;lik bir serolojik pipet kullanarak tüm plakanın yüzeyinde tekrar tekrar pipetleme ile ayırın. Hücre süspansiyonunu 50 mL&#39;lik bir konik tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 150 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. </li><li> 10 mL PBS (üçüncü PBS yıkama) içinde hücre topağını tekrar süspansiyon haline getirin.nd önceden tartılmış 15 mL&#39;lik konik tüplere aktarın. 5 dakika boyunca 150 x g hızında tekrar Spin. Dikkatle bir serolojik pipet ve imha edilmesini kullanarak süpernatant aspire. </li><li> hücreler lize edildi ve matris proteinleri denatüre etmek için 20-30 dakika süreyle 75 ° C&#39;de inkübe etmek 3 dondurma-çözme döngüsüne FM pelet Konu. Kullanım için hazır olana kadar -20 ° C &#39;de pelet saklayın. </li></ol> 3. hızlı bir dengeleme Diyaliz (kırmızı) Deneyi <ol><li> dimetil sülfoksit tüm test bileşikleri (DMSO) içinde 10 mM stok çözelti hazırlayın. Her bir deney öncesinde DMSO içinde çözüm çalışan 500 uM&#39;ye seyreltilir. </li><li> caseum vekil pelet içeren tüp tartılır. tek başına pelet ağırlığı elde etmek için boş bir borunun ağırlığı çıkarılır. (: Ağırlık / hacim 1: 9), her matrisin 10x seyreltilmiş süspansiyonu elde etmek için caseum veya PBS ile taşıyıcı matris bozabilir 1 dakika / dakika 1200 vuruş bir doku homojenleştirici kullanılarak, tüp başına 2-3 metal boncuk ekleyin ve. </li><li> 500 6.5 uL başakΜM solüsyonu, 5 uM (≤% 1 DMSO) nihai konsantrasyonunu elde etmek için 643.5 uL homojenata ve vorteks içine yerleştirin. </li><li> KIRMIZI insertleri taban plakasına yerleştirin. Her alıcı bölmesine her RED girişi ve 350 μL PBS verici bölmesine (kırmızı halka) ilaç-spiked matris 200 mcL ekleyin. Her bir test bileşiği için üç eklenti hazırlayın (üçlü örnekler). Plakayı yapışkan plakalı bir conta ile yapıştırın ve 4 saat boyunca 200 rpm&#39;de (1 xg) termomiksör üzerinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Kuluçka işleminden sonra verici ve alıcı odalarının içindekileri hafifçe 2-3 defa yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Donör odalardan 20 μL&#39;lik homojenat kısımları pipetleyin ve 1.5 mL&#39;lik bir tüpe (1: 1) 20 μL temiz PBS ekleyin. Benzer şekilde, alıcı odalardan PBS örnekleri 20 mcL alikotları pipetle ve temiz homojenat (matris eşleme) 20 mcL ekleyin. 8 NOT: Matris eşleştirme işlemi,Kantitatif analiz için yapılacak 2 ayrı kalibrasyon eğrisi (homojenat ve PBS&#39;de) için. Donör odasının içeriği zamanla sedimantasyon yapabilir. Alikotları çıkarmadan önce içeriğini pipetle hafifçe karıştırın. </li></ol> 4. LC-MS Niceleme ve Veri Analizi <ol><li> Her bir tüpe 500 ng / mL diklofenak veya 10 ng / mL verapamil (iç standart) içeren 160 uL 1: 1 metanol: asetonitril ekleyin ve proteinleri çökeltmek için girdap ekleyin. Çökeltiyi tortu haline getirmek ve süpernatantları sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LCMS) analizi için 96 oyuklu derin plakalara aktarmak için 5 dakika boyunca 10,000 xg&#39;de santrifüjleyin. 7 </li><li> Yukarıdaki numunelerle aynı matris bileşimini koruyarak, her test bileşiği için 1-1000 nM&#39;den kalibrasyon eğrileri oluşturun. Bir LC-MS yöntemi kullanarak verici ve alıcı odalarından alınan numunelerdeki test bileşiğinin konsantrasyonunu hesaplayın. </li><li> Bağsız fraksiyonu hesapla ( f u ) of denklem 1 kullanılarak seyreltilmiş matris içinde ilaç denklem 2 (D = 10 seyreltme faktörü) kullanılarak seyreltilmemiş matris içinde f u hesaplayın. 14 <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li> stabilite / metabolizma / spesifik olmayan bağlanma konularla bileşimleri belirlemek için Denklem 3 kullanılarak her bileşiğin kurtarma (kütle dengesi) kontrol edin. NOT: Kurtarma tipik% 70 ve% 130 arasında düşer. 15 <img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+versus+bugs%3A+in+pursuit+of+the+persistent+predator+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+and+dormant+tubercle+bacilli+and+latent+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis.</a> Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).</li>
<li>Aber, V. R., Nunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+chemotherapy+of+tuberculosis.+Factors+affecting+relapse+following+short+term+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Int+Union+Tuberc%22%5BJournal%5D)">Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy.</a> Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).</li>
<li>Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nested+case-control+study+on+treatment-related+risk+factors+for+early+relapse+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).</li>
<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+path+of+anti-tuberculosis+drugs%3A+from+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li>
<li>Sarathy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+Drug+Penetration+in+Tuberculosis+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions.</a> ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).</li>
<li>Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+rapid+equilibrium+dialysis+approach+for+the+measurement+of+plasma+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding.</a> J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).</li>
<li>Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. <a target="_blank" href="http://jpharmsci.org/article/S0022-3549(16)32735-6/pdf">Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma.</a> J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbound+drug+concentration+in+brain+homogenate+and+cerebral+spinal+fluid+at+steady+state+as+a+surrogate+for+unbound+concentration+in+brain+interstitial+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid.</a> Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).</li>
<li>Able, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+localization%2C+native+tissue+binding+and+ex+vivo+occupancy+for+centrally+penetrant+P2X7+antagonists+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat.</a> Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).</li>
<li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits%3A+a+failed+host+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).</li>
<li>Via, L. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2423064/">Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates.</a> Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).</li>
<li>Kalvass, J. C., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+nonspecific+brain+and+plasma+binding+on+CNS+exposure%3A+implications+for+rational+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biopharm+Drug+Dispos%22%5BJournal%5D)">Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery.</a> Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).</li>
<li>Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+recovery+on+fraction+unbound+using+equilibrium+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis.</a> J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).</li>
<li>Lenaerts, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+persisting+mycobacteria+in+a+Guinea+pig+model+of+tuberculosis+revealed+by+r207910%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li>
</ol>

Rakip finansal çıkarlar yoktur.

Tüberkülozla enfekte hastalarda pulmoner nekrotik lezyonlar ve boşluklar, ilaç tedavisine dirençli bakteri alt popülasyonlarını içerir. Bu yapıların kazeöz çekirdeği, özellikle, bu persisörleri ekstraselüler bir ortamda barındırmaktan sorumludur. Anti-bakteriyel maddelerin bu uzak yerlere olumlu dağılımının tüberküloz ilaç etkinliğinin önemli bir belirleyicisi olduğuna inanılmaktadır. Bu protokolün onaylanmasından önce, konstitüsyonel lezyonlarda ilaç keşfi bileşiklerinin dağılımını öngören mevcut in vitro tekn...

akciğer tüberkülozu hastalığının tedavisi lezyonlar farklı içine ilaç etkin dağıtım gerektirir. Nekrotik lezyonlar ve boşluklar ilaç toleranslı veya &#39;kalıcı&#39; bakteri alt-popülasyonunu liman peynir merkez içerir. 1, 2 kaviter hastalık alt kür oranları ve kötü prognoz ile ilişkilidir. 3, 4 önceki çalışmalar caseum nüfuz kabiliyeti önemli ölçüde bir ilaç sınıfı diğerine değişir, nicel ve görüntüleme teknikleri kullanılarak, göstermiştir. 5, 6 Ancak bu yöntemler, yavaş ve zahmetlidir hayvan enfeskiyon modellerinden kullanılmasını gerektirir. Ex vivo olarak caseum bağlanma ilaç ölçen bir in vitro deney tasarlanmıştır. Bu ters nedenle, peynir granülomada ilaç nüfuzunun ile ilişkili ve bulunmuştur bağlanma, birTahmin edici bir araç olarak kullanılmıştır. 7 Dengeleme diyalizi, plazma protein bağlama çalışmalarına altın standart yaklaşım olarak görülür. Hızlı denge diyalizi (RED) cihazı, bu tür testleri gerçekleştirmek için hızlı, kullanımı kolay ve güvenilir bir sistem sağlar. 8 Cihaz iki bileşenden oluşur: yarı geçirgen zarın dikey bir silindiri ile ayrılmış 2 hazneden oluşan tek kullanımlık, tek kullanımlık uçlar; Ve aynı anda 48 ek parça tutabilen tekrar kullanılabilir taban plakaları. Diyaliz membranı, ilaç-makromolekül bağlama çalışmaları için ideal olan 8 kDa moleküler ağırlıklı bir kesime (MWCO) sahiptir. Membran kompartmanının yüksek yüzey alanı / hacim oranı, hızlı diyaliz ve dengeleme sağlar. Hem ekler hem de taban plakası, asgari spesifik olmayan bağlanma için onaylanmıştır. RED cihazının biyoanalitik tekniklerle kombinasyonu, ilaçların bağlanmamış fraksiyonlarının kesin tahminlerini plasma. 8 , 9 Başlangıçta plazma protein bağlanmasını ölçmek için tasarlanmış olmasına rağmen, RED cihazı homojenatları kullanarak çeşitli doku bağlama çalışmalarında kullanılmıştır. 10 , 11 Bu protokolde, tüberkülozla enfekte tavşanların nekrotik lezyonlarından ve boşluklarından eksize edilen nekrotik çöpler, kaseum ile ilacın bağlanmasını ölçüyoruz. Caseus materyalinin asellüler ve non-vascular özelliği, tahlil ile uyumlu homojen bir süspansiyona homojenleştirilmesini kolaylaştırır. Kaseum üretmek için sıkıcı ve zor gelmesi nedeniyle, protokol de köpüklü makrofajlardan hazırlanan bir vekil matris ile kullanım için onaylanmıştır. THP-1 monosit türevi makrofajlar, onlara &#39;köpüklü&#39; görünüm veren çoklu lipid cisimcikleri biriktirmek için oleik asit ile indüklenir. Bu lipit yüklü hücreler hasat edilir veBiz caseum için bir ikame olarak kullanmak, bir matris üretmek üzere işlenir. Bu çalışma, bu taşıyıcı matris etkin bir granülomlar ve boşlukların peynir çekirdek ilacın nüfuz etmesine engel in vivo işlemi taklit caseum bağlanma ile iyi bir korelasyon ile bağlanan ilaç göstermiştir.

<table><tbody><tr><td>Yeni Zelanda Beyaz Tavşanları</td> Covance-HN878 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Kaynakları</td><td>NR-13647&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamin) 100 mg / mL C3N</td><td>Henry Schein Hayvan Sağlığı</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Ksilazin) 100 mg / mL</td><td>Henry Schein Hayvan Sağlığı</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Ötesol (pentobarbital sodyum ve fenitoin sodyum) Çözeltisi &nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 monositik hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 cm & sup2; TC ile İşlem Görmüş Şişe (T175)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 glutamin içermeyen ortam</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hiplon Fetal Sığır Serumu, Gama ışınlanmış&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone L-glutamin, 200 mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar TC kabı, 145 mm x 20 mm, havalandırmalı</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Oleik asit&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15178101</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Cihazı Yeniden Kullanılabilir Taban Plakası</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Cihaz Ekleri, 50/kutu&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED kesici uç çıkarma aleti&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>Yapışkan plaka contası</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Sigma</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil hidroklorür</td><td>Sigma</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Diklofenak sodyum tuzu</td><td>Sigma</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözelti, %0.4</td> <td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 geçirmez</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 Geno/Öğütücü</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>Boncuk Değirmeni Homojenizatör Aksesuarı, Metal Dökme Boncuklar</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R Kobalt 60 Işınlayıcı</td><td>JL Shepard</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&nbsp; C-Chip Tek Kullanımlık Hemasitometreler</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>Dik Işık Mikroskobu</td><td>Leica</td><td>DM1000</td><td></td></tr><tr><td>İkili Sıvı Kromatografisi sistemi</td><td>Agilent</td><td>1260</td><td>Çok bileşenli</td></tr><tr><td>Kütle spektrometresi</td><td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr></tbody></table>

bir<em&gt; in vitro</emtüberküloz lezyonlarında İlaç penetrasyonunu Öngören caseum bağlanma testi

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Tüberküloz hastalığının ortadan kaldırılması, kompleks pulmoner lezyonların çok katmanına nüfuz edebilen ilaç rejimleri gerektirir. Çukurların ve lezyonların kazeöz damarlarındaki ilaç dağılımı, özellikle persistan olarak da adlandırılan uyuşturucuya dirençli bakterilerin alt popülasyonlarını barındırdığı için çok önemlidir. Tüberküloz lezyonlarında ilaç penetrasyonunun ölçülmesine ilişkin mevcut metotlar, biyoanalitik veya görüntüleme teknikleriyle birleştirilen yüksek maliyetli ve zaman alan in vivo farmakokinetik çalışmaları içerir. Kozmetik makromoleküllere bağlanan ilacın in vitro ölçümü, bu tür teknikler için bir alternatif olarak önerildi çünkü bu bağlanma, ilaç moleküllerinin kaseum yoluyla pasif difüzyonunu engelledi. Hızlı denge diyalizi plazma proteini ve doku bağlama çalışmalarında hızlı ve güvenilir bir sistemdir. Bu protokolde, kazanın homojenatlarına ilaç bağlanmasını ölçmek için hızlı denge diyaliz (RED) cihazı kullandık.Tüberküloz ile enfekte tavşanların lezyonlarından ve boşluklarından türetilmiştir. Protokol ayrıca, kaseum yerine kullanılacak lipid yüklü THP-1 makrofajlarından bir vekil matrisi nasıl oluşturulacağını açıklar. Bu kaseum / vekil bağlanma testi, tüberküloz ilaç keşfi için önemli bir araçtır ve lezyonlarda veya apselerde diğer hastalıkların yol açtığı ilaç dağılımının araştırılmasına yardımcı olmak için uyarlanabilir.

Bu protokolü kullanarak, yüzlerce tüberküloz ilaç geliştirme bileşiğini penetran kaseumda tahmin edilen etkinlikleri için test ettik. Şekil 1 , RED testinin temel kavramlarını görüntüler. RED eklentilerinin diyaliz zarları bağlanmamış kük moleküllerin donör kuyudan alıcı kuyusuna dağılmasına ve son olarak da her iki bölme arasında denge elde edilmesine olanak tanır. Proteinler veya lipidler gibi makromoleküllere bağlı olan küçük moleküller donör kuyusuna sıkışır. Her iki...

Burada pulmoner tüberküloz lezyonlarından ve boşluklardan alınan kaseum ile ilacın bağlanmasını ölçmek için hızlı bir denge diyaliz (RED) yöntemi anlatılmaktadır. Protokol, aynı zamanda, kaseum için etkili bir vekil olan köpüklü makrofaj kaynaklı bir matriste de kullanılır.

bir<em&gt; In vitro</emTüberküloz Lezyonlarında İlaç Penetrasyonunu Öngören Caseum Bağlanma Testi

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Bu protokolün genel amacı, tüberküloz lezyonlarından elde edilen kazeuma ilaç bağlanmasını öngörmektir. Bu yöntem, hayvan modelleri ve pahalı görüntüleme teknikleri kullanılmadan, antimikrobiyallerin nekrotik lezyonların kazeöz çekirdeğine ne kadar etkili nüfuz ettiğini belirlemeye yardımcı olabilir. Bu yöntem tüberkülozla ilgili doğrudan keşifler için bilgi sağlayabilmenin yanı sıra, ilaç penetrasyonunun sınırlı olduğu lezyon veya apse oluşumuyla karakterize diğer hastalıklar için de uygulanabilir.Protokolün uygulanmasındaki tutarlılık, deneyler arasındaki verilerin tekrarlanabilirliğini sağlayacağından bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bugün, hücre kültürü prosedürünü ve sürrogat matrisin hazırlanmasını göstereceğim. Laboratuvarımızdan araştırma görevlisi Hsin-pin, sağdaki denemeyi gösterecek.THP-1 monositlerini; 2 milimolar l-glutamin ve %10 fetal bovine serum içeren 80 mL RPMI 1640 besiyerine sahip T-175 hücre kültür flasklarında büyütün. Flaskları 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren inkübatörde üç ila dört gün bekletin. Hücreler yaklaşık %70 konfluense ulaştığında, onları iki adet 50 mL'lik konik tüpe paylaştırın ve 150 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Santrifüjleme işleminden sonra süpernatanı atın ve peletlemiş malzemeyi 10 mL RPMI 1640 besiyeri içinde süspande edin. Bu kültürden beş µL alarak 45 µL trypan blue içeren 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Pipetleme yoluyla iyice karıştırın.10 µL hemositometreye aktarın. Ardından 10x büyütmede bir ışık mikroskobu kullanarak canlı THP-1 monositlerinin sayısını belirleyin. Kültürdeki mililitre başına düşen canlı hücre sayısı belirlendikten sonra, RPMI medyumu ile mililitre başına 1,25 × 10⁶ hücre nihai yoğunluğuna seyrelitin.Tüpe 40 µL 100 µM PMA ekleyin. Ardından kültürü 140 x 20 mm'lik bir hücre kültürü plağına aktarın. Hücrelerin inkübatörde gece boyunca tutunmasını sağlayın.Ardından, saf iliac asidi etanol içinde 0,1 molar konsantrasyona seyreltin. Burada, 31,7 µL iliac asit, 968,3 µL etanol içinde çözülür. Çözeltiyi, taze ve önceden ısıtılmış RPMI besiyerinde 10 milimolar konsantrasyona seyreltin.İliyak asit süspansiyonunu, 37 °C'ye önceden ısıtılmış RPMI ortamında 0,4 milimolar nihai çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Yağ asidinin sulu bir çözeltide yeterince çözünmesini sağlamak için iliyak asidin önceden ısıtılmış RPMI ortamında seyreltilmesi kritik önem taşır. Bir pipet kullanarak, THP-1 makrofajlarını içeren hücre kültürü plağındaki mevcut ortamı ve yapışmayan hücreleri uzaklaştırın ve ardından 40 mL 0,1 milimolar iliyak asidi nazikçe ekleyin.İnkübatörde 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, THP makrofajlarında çok sayıda lipid gövdesi inklüzyonlarının varlığını görsel olarak doğrulamak için 40x büyütmede bir ışık mikroskobu kullanın. Lipid gövdeleri, sitoplazmada küçük, şeffaf, küresel yapılar olarak görünür.Hücre kültür plağındaki tüm RPMI besiyerini uzaklaştırın ve yapışkan hücreleri 50 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak PBS ile iki kez nazikçe yıkayın. Plağa 40 mL 5 millimolar EDTA ve PBS ekleyin. 37 derece Celsius'ta 15 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, köpüksü makrofajları ayırmak için 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak tüm plağın yüzeyi boyunca defalarca yukarı ve aşağı pipetleme yapın. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 150 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin.Santrifüj işleminden sonra, hücre peletini 10 mL PBS içinde yeniden süspande edin ve önceden tartılmış 15 mL'lik konik tüpe aktarın. Beş dakika boyunca 150 ×g hızda tekrar santrifüjleyin. Ardından, süpernatantı serolojik pipet kullanarak dikkatlice aspire edin ve atın.Köpüklü makrofaj paletlerini üç serbest döngüye tabi tutun. Hücreleri liz etmek için kuru buz ile termal blok üzerinde 37 °C inkübasyon arasında geçişler yapın. Ardından, matristeki proteinleri denatüre etmek için onları 75 °C'de 20 ila 30 dakika boyunca inkübe edin.Paletleri ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın. Videonun bu bölümünde gösterilen hızlı denge cihazları veya RED deneyi, az önce hazırladığımız sürögat matris veya TB enfeksiyonlu tavşan lezyonlarından alınan kılıflar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Burada, deneyi sürögat matris üzerinde uygulanış şekliyle göstereceğiz.Tüm test bileşiklerinin 10 millimolar stok çözeltilerini hazırlayın. Burada moxyfloxacin DMSO içinde hazırlanmıştır. Her deneme öncesinde DMSO ile 500 micromolar çalışma çözeltilerine seyreltin.Eksize edilmiş kazeum veya süragat palet içeren tüpü tartın. Kazeumun veya süragat paletin tek başına ağırlığını belirlemek için boş tüpün ağırlığını çıkarın. Tüp başına iki ila üç metal bilye ekleyin ve ardından 1/9 W/V oranında PBS ekleyin. Bir vorteks kullanarak, kazeumu veya süragat matrisi bir dakika boyunca parçalayın.Hazırlanan test bileşiğinden 6.5 µL'yi, 643.5 µL homogenata ekleyin. Beş µM nihai konsantrasyona ulaşmak için vortexleyin. Ardından, kırmızı insertleri taban plakasına yerleştirin.Her bir test için insertleri hazırlayın; her bileşiği üç tekrarlı olarak kullanın. Her bir kırmızı insertin kırmızı donör haznesine 200 µL ilaç katkılı matris ekleyin. Ardından, her bir alıcı hazneye 350 µL PBS ekleyin.Plakayı yapışkanlı bir sızdırmazlık folyosu ile kapatın ve termal karıştırıcıda 37 °C'de, dakikada 200 devir hızında dört saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, donör ve alıcı bölmelerin içeriğini pipetle iki ila üç kez aşağı yukarı çekerek nazikçe karıştırın. Her bir donör bölmesinden 20 µL homojenatı, 1,5 mL'lik bir tüp içindeki 20 µL temiz PBS'ye aktarın.Benzer şekilde, alıcı bölmelerden 20 µL'lik PBS numune alikotlarını 20 µL temiz homogenat içerisine aktarın. Matris eşleştirme, kantitatif analiz için homogenatta ve PBS'de iki ayrı renk görme eğrisi oluşturma gereksinimini ortadan kaldırır. Donör bölmenin içeriği zamanla çökelme yapar.Aliquotlar alınmadan önce içeriği pipetleyerek nazikçe karıştırın. İç standart olarak, her tüpe 500 ng/mL diklofenak veya 10 ng/mL verapamil içeren, acetonitrile ile metanolün bire bir karışımından 160 µL ekleyin. Proteinleri çöktürmek için vorteksleyin.Çökeleği çöktürmek için 10000 x g'de beş dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatantları sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (LCMS) ile analiz için 96 kuyucuklu derin kuyu plakalarına aktarın. Örneklerle aynı matris kompozisyonunu koruyarak, bileşik stok çözeltisinden dilüsyonlar yaparak her bir test bileşiği için 1 ile 1000 nanomolar arasında kalibrasyon eğrileri oluşturun. Donör ve alıcı bölmelerden alınan örneklerdeki test bileşiği konsantrasyonunu bir LCMS yöntemi kullanarak belirleyin.Burada gösterilen birinci denklemi kullanarak ilacın ve seyreltilmiş matrisin bağlanmamış fraksiyonunu veya fu değerini hesaplayın. Ardından, D'nin 10'luk bir seyreltme faktörüne eşit olduğu ikinci denklemi kullanarak seyreltilmemiş matristeki fu değerini hesaplayın. Son olarak, burada gösterilen üçüncü denklemi kullanarak her bir bileşiğin geri kazanımını veya kütle dengesini kontrol edin.Stabilite, metabolizma veya spesifik olmayan bağlanma sorunları olan bileşikleri belirlemek için kullanılır. Geri kazanımın tipik olarak yüzde 70 ile yüzde 130 arasında olduğunu unutmayın. Bu videoda açıklanan protokol, yüzlerce tüberküloz ilaç geliştirme bileşiğinin kazeuma nüfuz etmedeki öngörülen etkinliğini test etmek için kullanılmıştır.Kırmızı eklerin diyaliz membranı, bağlanmamış küçük moleküllerin donör kuyucuktan alıcı kuyucuğa difüze olmasına ve nihayetinde her iki bölme arasında bir denge kurulmasına olanak tanır. Proteinler veya lipidler gibi makromoleküllere bağlanmış küçük moleküller ise donör kuyucukta hapsolur. Her iki bölmeden alınan örneklerin kantitatif analizi, burada gösterildiği gibi, kazeum veya sürrogat matris içindeki her bir küçük molekülün bağlanmamış fraksiyonunun, fu, hesaplanmasını sağlar.fu değeri ne kadar yüksekse, ilaç kazeum içine o kadar yaygın difüze olur. Altı ilaç için Matriks Destekli Lazer Desorpsiyon İyonizasyonu veya MALDI kütle spektrometrisi görüntüleme gerçekleştirilmiştir. Sinyal yoğunluğunun soldaki ölçek çubuğu ile belirtildiği, temsili akciğer lezyonlarının iyon haritaları burada gösterilmiştir.Hematoksilin ve ESN veya HNE boyalı bitişik kesitler aşağıda gösterilmiştir. Siyah-beyaz kontur çizgileri, her bir lezyonun kazeöz merkezini vurgulamaktadır. Bu veriler, ilaç moleküllerinin kazeumun dış kısmına, lezyonun hücresel tabakalarıyla olan ara yüzeyinden difüze olduğu hipotezi ile tutarlıdır.Kazeöz makromoleküllere bağlanma, ilacı hapseder ve onun kazeöz çekirdeğe daha fazla difüzyon yapmasını engeller. Burada gösterildiği gibi, THP-1 kaynaklı köpüklü makrofajlardan hazırlanan matris, gerçek kazeum için etkili bir vekildir. Her iki matristeki bağlanma birbirleriyle güçlü bir korelasyon göstermektedir.Bu prosedür takip edilerek, zaman ve kaynak tasarrufu sağlamak amacıyla birkaç bileşik aynı anda test edilebilir. Biz buna kaset testi adını veriyoruz. Geliştirildiğinden beri bu deney, tüberküloz ilaç keşfi için birçok ön aday optimizasyon programı tarafından kullanılmıştır.Mikrobakteriler ve tüberküloz enfeksiyonlu doku örnekleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve BSL2 laboratuvarında enfekte kılıf örneklerini işlemeden önce gama radyasyonu kullanan onaylanmış bir doku sterilizasyon protokolünün uygulanması gerektiğini unutmayın. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

an-vitro-caseum-binding-assay-that-predicts-drug-penetration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Sarathy, J. P. ve diğerleri. Tüberküloz Lezyonlarında İlaç Penetrasyonunu Tahmin Eden Bir İn Vitro Caseum Bağlanma Testi. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, hızlı denge diyalizi kullanılarak tüberküloz lezyonlarından kazeuma ilaç bağlanmasını ölçmek için bir in vitro testi göstermektedir. Kazeum süspansiyonlarının hazırlanması, diyaliz yapılması ve kazeuma ilaç penetrasyonunu tahmin etmek için bağlanmamış ilaç fraksiyonunun hesaplanması için adımları özetlemektedir.

Tüberküloz Lezyonlarından Kazeuma İlaç Bağlanmasının Hızlı Denge Diyaliz Yöntemi ile Ölçülmesi

Bu video, ilaçların Mycobacterium tuberculosis (Mtb) enfeksiyonuna karşı etkinliğini değerlendirmek için bir testi göstermektedir. İn vivo enfeksiyonu taklit eden Mtb/makrofaj agregatları içeren bir in vitro enfeksiyon modeli oluşturulur. Uygun antibiyotikler eklendikten sonra, artan ilaç konsantrasyonları ile bakterilerin hayatta kalmasını izlemek için etkinlikleri resuzarin testi ile test edilir.

Mycobacterium tuberculosis Enfeksiyon Modeline Karşı İlaç Etkinliğini Değerlendirmek İçin Bir Test

Bu video, Mycobacterium tuberculosis'e karşı antibiyotik etkinliğini belirlemek için bir et suyu içi testi göstermektedir. Bakteri kültürü, farklı konsantrasyonlarda bir bakterisidal antibiyotik ile inkübe edilir. Bakterisidal etkinlik, bir resazurin testi kullanılarak canlı bakterilerin varlığının değerlendirilmesiyle ölçülür.

Bir Test Bileşiğinin Et Suyundaki Mikobakterilere Karşı Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Burada, küçük müdahale eden sentetik RNA (siRNA), kimyasal bileşik ve Mycobacterium tuberculosis mutant kütüphanelerinin Yüksek verimli / Yüksek içerikli ekranları için geçerli olan fenotipik bir test açıklıyoruz. Bu yöntem, otomatik konfokal mikroskopi kullanılarak floresan etiketli konak hücre içinde floresan etiketli Mycobacterium tuberculosis'in tespitine dayanır.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Charcoal agar r esazurin assay (CARA), test ajanlarının replike eden, replike olmayan veya her ikisi olan mikobakterilere karşı aktivitesini değerlendirmek için yarı kantitatif, orta verimli bir yöntemdir.  CARA, zamana ve konsantrasyona bağlı aktivitenin hızlı bir şekilde değerlendirilmesine izin verir ve koloni oluşturan birim (CFU) tahlilleri ile izlenecek parametreleri tanımlar.

Mikobakteriler Yarı kantitatif, Orta hacimli Sayımı İçin Kömür Agar Resazurin Testi görselleştirme

Bu hücre içi, Mycobacterium tuberculosis karşısında roman bileşiklerin bulunması hedefleme için ve in suyu memeli konakçı hücreye karşı bakteri hem de sitotoksisite büyüyen modüler yüksek verimli bir tarama sistemini geliştirdik.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Yeni nesil anti-tüberküloz ilaçlar için erken ilaç geliştirme sürecini iyileştirecek yeni modeller ve testler oldukça arzu edilmektedir. Burada, Mycobacterium tuberculosis'e karşı ilaç etkinliğini değerlendirmek için yüksek verimli tarama için kolayca uyarlanabilen hızlı, ucuz ve BSL-2 uyumlu bir testi açıklıyoruz.

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Burada, LC/MS analizi ile birleştiğinde lazer yakalama mikrodiseksiyon dağınık şekilde ölçmek-akciğer tüberkülozu granülomlar içinde uyuşturucu dağıtımı için bir iletişim kuralı'nı açıklar. Yaklaşım ilaç konsantrasyonları yüksek uzaysal detay dokularda miktarının için geniş uygulanabilirliği vardır.

Akciğer tüberkülozu lezyonlar lazer ilaçların kayma miktar yakalamak mikrodiseksiyon sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi (LCM-LC/MS)

Koloni oluşturan birimlerin (CFU) belirlenmesi, görünür koloniler oluşturması haftalar sürebilen Mycobacterium tuberculosis de dahil olmak üzere bakterilerin miktarını belirlemek için altın standart tekniktir. Burada, artan zaman verimliliği, azaltılmış laboratuvar alanı ve reaktif maliyeti ve orta ve yüksek verimli deneylere ölçeklenebilirlik ile CFU belirleme için bir mikro-CFU'yu açıklıyoruz.

Tüberküloza Karşı Aşıların Etkinlik Değerlendirmesi için Mikro Koloni Oluşturan Birim Testi

Bu çalışma, bakteri canlılığını hızlı bir şekilde değerlendirmek için floresan ve lüminesans kullanarak, yakın zamanda oluşturulmuş bir çift raportör suşu ile Mycobacterium abscessus'a karşı yüksek verimli tarama için bir test geliştirdi. Bu protokol, bu ilaca dirençli bakterilere karşı yeni ilaçları taramayı amaçlayan araştırmacılar için geçerli olacaktır.

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Öğrenin, hızlı denge diyalizi yöntemiyle tüberküloz lezyonlarındaki kazeuma ilaç bağlanmasını nasıl öngörebilirsiniz. Bu protokol, köpük makrofaj kaynaklı matris kullanarak antimikrobiyal penetrasyonu değerlendirmeyi kolaylaştırır.

bir

Daha fazla video keşfet