Name: Soğuk nosisepsiyon için Roman Tahlili Drosophila Larva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Öğrenin, Drosophila larvalarında soğuk nosisepsiyonu incelemek için özel Peltier probu kullanarak davranışsal yanıtları nicelendirmeyi. Bu yöntem, ağrı mekanizmalarının hücresel ve moleküler düzeyde araştırılmasına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz eleştirel el yazması okumak için soğuk prob deneyine, sinek hisse senetleri için Bloomington Drosophila Stok Merkezi ve Galko laboratuar üyelerinin erken aşamasını geliştirmek için Sarah Wu ve Camille Graham teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH NRSA HNT için (NIH F31NS083306) tarafından ve NIH R01NS069828, R21NS087360 ve MJG Temel Araştırma Texas MD Anderson Clark Fellowship bir üniversite tarafından desteklenmiştir.

Larva 1. Hazırlık <ol><li> 25 ° C kuluçka makinesi içinde stokları ya da genetik haç kaldırın. <ol><li> ortasını kültür durumunda, 20-25 bakire dişi ve düzenli mısır unu uçucu ortamı ihtiva eden şişe başına 15-20 erkek kullanın. dişiler yiyecek yeni şişeye transfer etmeden önce yaklaşık 48 saat yumurtalarını bırakmak için izin verin. </li></ol></li><li> 4-5 gün yumurta yumurtlama sonra yavaşça aşırı duygusal yiyecek ve larvaları içine su akışı püskürtme istenen genotip 3. instar larvaları toplamak ve orta büyüklükte temiz Petri çanağı içine içindekileri boşaltmak (60 mm x 15 mm). </li><li> Sonra, yavaşça test edilmesini büyük &quot;dolaşıp 3. instar&quot; ya da küçük hastalıklı larva engel olmak boyut kullanarak forseps veya bir fırça ile larva sıralamak. istenmeyen herhangi bir genetik marker ya da dengeleyici içeren sil larva. </li><li> deneyci ex &quot;kör&quot; olabilir, böylece sıralanmış larvalar koyulacak bir adam laboratuvar elemanı etiket yemekleri veya kapları varperimental koşul veya varsa larva genotipi. deneyci bir laboratuvar üyesi tarafından oluşturulan bir anahtar kullanarak deneme sonrasında toplanan verilere kodu çözülmüş etiket uygulayabilirsiniz. </li><li> Bir scoopula kullanılarak, (35 mm x 10 mm veya 60 mm x 15 mm), oda sıcaklığında su ile temiz, etiketlenmiş bir Petri çanağı dolu yarı yolda taze gıda bozuk para büyüklüğünde aktarın. </li><li> forseps veya fırça kullanarak hafifçe gıda üzerine sıralanmış larvaları hareket (test fazla 20 dk almak bekleniyorsa, açlık veya kuruma önlemek için). </li></ol> 2. Soğuk Sonda Denemesi <ol><li> burada arzu edilen sıcaklığa kadar soğumaya için birkaç dakika izin soğuk prob birimi açın. daha düşük sıcaklıklar için ayarlama, yoğunlaşma muhtemelen sonda boyunca oluşturacaktır. </li><li> Bir laboratuvar ile fazla nemi silin larva uygulanmadan önce silin. acil kullanımda, yer izole edin sonda üzerinde tecrit başlığı ve temiz ucu tutmak ve zarar görmesini önlemek için değil zaman. </li><li> Koyu hareket edebilen vinil ince bir parça üzerine bir orta 3. instar larva yerleştirin parlak alan mikroskobu altında (tipik olarak, bir dizüstü bilgisayar bağlayıcı kesilen küçük bir parça kullanın). Kontrast görüntüleme ve bu sonda ile doğru hizalamak için dokunmadan larva hareket siyah vinil yardımcı olur. </li><li> Kontrast sağlayan ve çok hızlı bir şekilde kurumasını larva önlemek için mikroskop (Malzemelerin Tablo) ve orta parlaklık (% 50-75 maksimum parlaklık) ışık birimi (Malzemelerin Tablo) ayarlayın. </li><li> onlar sonuçları katkı yapabilen olarak önce normal peristaltik lokomosyonunu göstermezler herhangi larvaları atın. su Petri kabı, aksi larva, normal lokomosyon inhibe vinil sopa gelen larva nemli olmalıdır. Su larva etrafında oluşan su birikintileri olmamalıdır. </li><li> cor içine larva taşımak için vinil kullanılarak, ön-arka gövde eksenine 90 ° bir açı ile larva doğru elle sonda Advancerect pozisyon (Şekil 1A bakınız). </li><li> Orient probunun ucu hafifçe prob mikroskop aşamasına, yaklaşık olarak 45 ° açı ile larva orta sırt yüzeyi boyunca sunmaktır. </li><li> Sonda temas ettiği zaman, bir laboratuvar zamanlayıcı başlatmak. yine öne veya arkaya doğru hareketi verirken hafif larva üst derinin yüzeyini girinti kadar aşağıya doğru basınç uygulanır. </li><li> En fazla 10 s için ya da bir soğuk-uyarılmış davranış cevabı görülmektedir kadar yerinde probu tutun - hangisi önce meydana gelirse. Daha sonra sonda çıkarın. </li><li> gözlenen davranışsal tepkisi ve tepki gecikmesini kaydedin. 10 saniye içinde yanıt yok Larva &quot;yanıt vermeyenler&quot; olarak kabul edilir. Gecikme ayrıca yanıt için kaydedilir ve yanıt sağlamlığı / genlik değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. </li><li> larva atın ve bir sonraki hazırlar. </li><li> Test larva istenilen sayıda (n üç grup ulaşılıncaya kadar tekrarlayın 2,3-2,11 adımları = 20-40 larva u idi) Buraya sed. </li></ol>

<ol><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).</li>
<li>Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+expression+of+tetanus+toxin+light+chain+in+Drosophila+specifically+eliminates+synaptic+transmission+and+causes+behavioral+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects.</a> Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).</li>
<li>Hwang, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).</li>
<li>Im, S. H., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pokes%2C+sunburn%2C+and+hot+sauce%3A+Drosophila+as+an+emerging+model+for+the+biology+of+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception.</a> Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).</li>
<li>Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+tool+for+studying+the+conserved+genetics+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain.</a> Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).</li>
<li>Turner, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TRP+Channels+Pkd2%2C+NompC%2C+and+Trpm+Act+in+Cold-Sensing+Neurons+to+Mediate+Unique+Aversive+Behaviors+to+Noxious+Cold+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila.</a> Curr Biol. , (2016).</li>
<li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction%3A+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).</li>
<li>Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+filopodia%2C+Ripped+Pocket%2C+NOMPC%2C+and+NMDARs+contribute+to+the+sense+of+touch+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).</li>
<li>Yan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+NOMPC+is+a+mechanotransduction+channel+subunit+for+gentle-touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation.</a> Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).</li>
<li>Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((painless%2C+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113 (2), 261-273 (2003).</li>
<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).</li>
<li>Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+global+methods+of+assessing+thermal+nociception+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (63), e3837(2012).</li>
<li>Grueber, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134 (1), 55-64 (2007).</li>
<li>Hughes, C. L., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensory+feedback+circuit+coordinates+muscle+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila.</a> Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).</li>
<li>Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pickpocket+is+a+DEG%2FENaC+protein+required+for+mechanical+nociception+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).</li>
<li>Neely, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrpA1+regulates+thermal+nociception+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila.</a> PLoS One. 6 (8), e24343(2011).</li>
<li>Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+directional+change+after+mechanical+stimulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila.</a> Mol Brain. 5, 39(2012).</li>
<li>Im, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tachykinin+acts+upstream+of+autocrine+Hedgehog+signaling+during+nociceptive+sensitization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila.</a> Elife. 4, e10735(2015).</li>
<li>Babcock, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+regulates+nociceptive+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization.</a> Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).</li>
<li>Berrigan, D., Pepin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/002219109400113U">How Maggots Move - Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera.</a> J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).</li>
<li>Galko, M. J., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+genetic+analysis+of+wound+healing+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae.</a> PLoS Biol. 2 (8), E239(2004).</li>
<li>Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+larvae+to+study+epidermal+wound+closure+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation.</a> Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).</li>
<li>Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+discovery+of+targets+and+anti-targets+for+cancer+polypharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology.</a> Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).</li>
<li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).</li>
<li>Gill, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistate+life-tables+and+regression+models%5BTitle%5D)+AND+%22Math+Popul+Stud%22%5BJournal%5D)">Multistate life-tables and regression models.</a> Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).</li>
<li>Mantel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ranking+procedures+for+arbitrarily+restricted+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Biometrics%22%5BJournal%5D)">Ranking procedures for arbitrarily restricted observation.</a> Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).</li>
<li>Breslow, N. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2334776?seq=1#page_scan_tab_contents">A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship.</a> Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).</li>
<li>Gehan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalized+wilcoxon+test+for+comparing+arbitrarily+singly-censored+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biometrika%22%5BJournal%5D)">A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples.</a> Biometrika. 52, 203-223 (1965).</li>
</ol>

A Amerika Birleşik Devletleri patent başvurusunda, (CL) soğuk prob tasarımına devam etmektedir. Soğuk prob parça numaraları ve inşaat ayrıntılarına bilgiye yanı sıra aracı tasarımına ek danışmanlık talep üzerine temin edilecektir.

Burada tarif edilen deney, nitel ve nicel olarak, çeşitli genetik geçmişlerde, çevresel etkiler, ve / veya hasar kaynaklı durumların larvaları nosisepsiyon veya nosiseptif hassasiyete değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu deney, bu araç ile soğuk bir uyarıcı odak uygulama için izin verdiği bir özellikle düşük ısılara yanıt, periferal sensor nöronların bir alt fonksiyonunu değerlendirmek. İlginç bir şekilde, bu soğuk uyarılmış davranışlar ısı 7, 11 tarafından...

Drosophila yeni korunmuş genler ve karmaşık davranışlar temelinde yatan nöronal devrelerin tanımlanması için yüksek ölçüde yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Sinekler gelişmiş bir genetik araç ve nosisepsiyon 5, 6, 7 hücresel ve moleküler bazları incelemek için genetik ve nöronal manipülasyon, 1, 2, 3, 4 izin basitleştirilmiş sinir sistemi sağlar. Larvalar, yumuşak bir dokunuş 8, 9, 10, zararlı ısı 11, 12, 13 ve zararlı uyarıcıya 4 mekanik hissi için davranışsal deneyleri göz önüne alındığında, bu analizler için özellikle yararlıdır </sup&gt; 11 zaten kurulmuş ve şeffaf larva kütikül epidermis ve altta yatan duyusal nöronların canlı veya sabit görüntüleme için izin verir edilmiştir. Son zamanlarda, zararlı soğuk için bir tahlil de burada daha detaylı olarak tarif 7, geliştirilmiştir. Ince, konik uçlu soğuk probu kullanarak, göstermektedir, ya da sert bir mekanik ya da yüksek sıcaklık uyaranlara 7, 8 sonra, 11 Drosophila larvaları sergilerler yumuşak bir dokunuş sonrasında normal hareket sırasında gözlenen davranışlar farklıdır soğuk spesifik reaktif davranışlar, bir dizi olduğu . Soğuk özgü davranış sağlam bir tam vücut kasılması (BT), bir U-şekli (ABD) içine arka segment (PR) ve ön eş zamanlı bir zam ve posterior segment 45-90º zam bulunmaktadır. Bu davranışların sıklığı düşen sıcaklıklar ama s, her tepe ile artarHafif farklı soğuk sıcaklıklarda. Son çalışmalar, BT tepkileri zararlı ısı veya sert mekanik uyarıcılara 7 cevap verdiği, bu daha farklı, periferal sensor nöronların aracılık olduğunu göstermektedir. Çok omurgalı nosiseptörlerin gibi, Drosophila birden fazla dendritik (md), periferal duyu nöronları epidermis üzerinde 1 arborize kompleks dentritik yapılara sahiptir. MD nöronlar ventral sinir kablosu 14 aksonları çıkıntı, her larva gövde bölümünün içinde mevcut bulunmaktadır. MD duyu nöronları dendritik morfolojiye göre dört farklı sınıflarına (I-IV) ayrılır ve duyusal fonksiyonları 4, 9, 10, 15, 16, 17 değişken adres. sınıf IV nöronlar larva lateral vücut rulo tepkileri için gerekli ikenyüksek sıcaklıklarda veya sert mekanik uyarıcılara 4, sınıf III nöronlar yumuşak bir dokunuş yanıtları 9, 10 için gereklidir ve sadece soğuk ile aktif hale getirilmediği, fakat aynı zamanda soğuk uyarılmış davranışsal tepkileri 7 için gereklidir. Her iki sınıf III ve sınıf IV nöronlar uyaranlara 9, 10, 17, 19 7, 11, 18, zararlı ve zararlı olmayan davranışsal tepkileri kolaylaştırmak ayrı geçici reseptör potansiyel (TRP) kanal kullanmaktadır. Bundan başka, larva nosisepsiyon 20, hücresel ve davranış seviyelerinde 12, 21, aşağıdaki yaralanması hassaslaştırılır. Burada tarif edilen deney, quantificatio sağlarNormal ya da potansiyel iki n ortam sıcaklıklarında (18-22 ° C) için, zararlı soğuktan (10 ° C &#39;≤) kadar düşük sıcaklıklarda, zararsız serin (11-17 ° C) için davranışsal tepkileri değiştirmiştir. Bu tahlilde kullanılan soğuk sıcaklıklarda, doğrudan, sınıf III duyu nöronlarını aktive edici nitelik olabilir ve niceliksel olarak 7 analiz edilebilir sağlam ve tekrarlanabilir kalsiyum artar ve soğuk uyarılmış davranışsal tepkileri ortaya çıkarma yeteneğine sahiptir. Bu deney, soğuk nosisepsiyon, nosiseptif duyarlılığın veya nosiseptif plastisite etki, genetik ve çevresel faktörlerin belirlenmesi çeşitli çevre koşullarına maruz larvası (değiştirilmiş beslenme, yaralanma, farmakolojik maddelere) yanı sıra hemen hemen herhangi bir genotip larvalarına uygulanabilir. thermosensation çok canlı üzerindeki her yerde olduğu göz önüne alındığında, bu deney, nosisepsiyon çalışma için değerli bir araç sağlar ve yeni gen hedefleri veya artıracak nöronal etkileşimleri ortaya çıkarabiliromurgalı nosisepsiyon anlayışımız. Özel oluşturulmuş soğuk prob (soğuk prob, Malzemelerin Tablo) termal iletim yoluyla alüminyum şaft ve konik ucunu soğutur, Peltier cihazı, kontrol edilen bir kapalı döngü sıcaklığı kullanmaktadır. Termistör alüminyum konik ucu içine gömülü olduğu kontrol birimi gerçek zamanlı sıcaklığını gösterir. Bir soğutucu ve fan (Termal Kontrol Ünitesi, Malzemelerin Tablo) elde edilebilir Peltier tesir ısı yükü (Qc) böylece (22-0 ° C) istenen sıcaklık aralığı ayarlamak için termoelektrik modül eklenir. Soğuk prob ucunun zararlı soğuk uyaran, ön ve arka uçlarından eşit uzaklıktaki segmenti (lar), sırt orta çizgisi için elle uygulanır larva (kabaca kademeli A4, Şekil 1A bakınız). Soğuk uyaranlara yanıt olarak, larva genellikle 10 s kesim içinde üç soğuk hatırlattığı hareketler birini üretmek: tam gövdekasılması (BT), bir U-şekli (ABD) ya da (Sonuçlar tarif edilmiştir) arka segment (PR) bir zam içine anterior ve posterior segment bir 45-90º kaldırmak. Bu davranışların hiçbiri, normal peristaltik hareketin veya yem arama davranışı sırasında gerçekleştirilir. Bu davranışlar da yumuşak bir dokunuş tepkiler ve yüksek sıcaklık veya zararlı mekanik uyarıcılara verdikleri caydırıcı haddeleme yanıt farklıdır.

<table><tbody><tr><td>Soğuk Prob</td><td>Pro-Dev Mühendisliği</td><td>Talep üzerine özel yapım</td><td>Parça numaraları ve yapım detayları istek üzerine sağlanabilir</td></tr><tr><td>Termal Kontrol Ünitesi</td><td>TE Teknolojisi</td><td>Özel Yapım muhafaza</td><td>Parça numaraları ve yapım detayları istek üzerine sağlanabilir</td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000 mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>NT55-605</td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite MI-150 Yüksek Yoğunluklu Aydınlatıcı</td><td>Dolan-Jenner Endüstrileri.</td><td>A20500</td><td></td></tr><tr><td>Schott Çift Deveboynu 23 inç Fiber Optik Işık Kılavuzu</td><td>Schott North America, Inc.</td><td>Schott A08575</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>FST</td><td>FS-1670</td><td>Larvaları sıralamak ve işlemek için kullanılır. Larvaları kazara delme veya yaralama riskini azaltmak için forseps uçlarını hafifçe düzleştirdiğinizden ve</td></tr> körelttiğinizden emin olun <tr><td>Boya Fırçası</td><td>Dick Blick Sanat Malzemeleri</td><td>06762-1002</td><td>Larvaları sıralamak ve işlemek için kullanılır. Kullanım sırasında boya fırçasının nemli olması faydalıdır.</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Polistiren Petri kabı</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>60mm x 10 mm Polistiren Petri kabı</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Siyah vinil parçası (en az 2 inç x 2 inç)</td><td></td><td></td><td>Kontrast sağlamak ve larvaları soğuk proba yönlendirmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Fisherbrand Scoopula Spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td>Yiyecekleri taşımak için kullanılır</td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Aşırı nem varsa larvaları ve soğuk probu kurutmak için kullanılır</td></tr></tbody></table>

soğuk nosisepsiyon için roman tahlili<em&gt; drosophila</em&gt; larva

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Nasıl organizmalar algılayıp hala tam olarak anlaşılamamıştır zararlı sıcaklıklara yanıt verirler. Bundan başka, örneğin periferik nöropati veya hasar kaynaklı hassasiyete geçiren hastalarda duyu makine hassasiyete, altında yatan mekanizmalar iyi karakterize değildir. Genetik olarak uysal Drosophila modeli, zararlı ısı tespiti için gerekli hücreleri ve genlerin çalışma için kullanılmıştır hangi ilgi birden fazla korunmuş genleri vermiştir. Küçük hücreler ve zararlı soğuk algılama için önemli reseptörler hakkında ancak bilinmektedir. Drosophila soğuk sıcaklıklarda (≤10 ºC) uzun süre maruz hayatta etmez ve zararlı soğuk uyarıcıları onlar anlamda nasıl davranış tercihi deneylerde, daha sıcak sıcaklıklar tercih serin önlemek ve muhtemelen önleyecektir rağmen ancak son zamanlarda incelendi. Burada tarif ve ilk zararlı soğuk (≤10 ºC) davranışsal tahlil karakterizeDrosophila. Bu aracı ve analizi kullanarak, kalitatif ve kantitatif olarak soğuk nosiseptif davranışlar değerlendirmek için nasıl bir müfettiş göstermektedir. Bu hastalık, yaralanma ya da duyarlılık bağlamında muhtemelen normal / sağlıklı kültür koşulları altında yapılabilir ya da edilebilir. Bundan başka, bu deney thermosensation, ağrı veya nosiseptif duyarlılığın etkileyebilir istenen genotipler, seçilen larvalarına uygulanabilir. ağrı ayrıca muhtemelen omurgalılar dahil diğer türlere, ağrı süreçlerinin önemli bir anlayış toplamaktadır olacak ısı nosisepsiyon incelemek için bu tahlil kullanılarak, yüksek düzeyde korunmuş bir süreç olduğu göz önüne alındığında.

Ara sıra duraklamaları, baş döner, ve yön 22&#39;de değişiklikleri içeren bir peristaltik hareketi ile Drosophila larvaları hareket. fokal ancak zararlı soğuk uyarıcının uygulanması, larva sergi zararlı ısı ve mekanik uyarıcılara karşı caydırıcı yatay rulo farklı kendine has davranışlar, bir dizi yanıt olarak. Bu davranışlar yumuşak bir dokunuş 8, 9, 10 ya da oda...

Burada Drosophila larvalarının soğuk nosisepsiyon incelemek için yeni bir test göstermektedir. Bu deney, bir fokal zararlı soğuk uyan uygulamak edebilen özel bir dahili Peltier prob kullanır ve ölçülebilir soğuk belirli bir davranış ile sonuçlanır. Bu teknik, soğuk nosisepsiyon başka hücresel ve moleküler diseksiyon sağlayacaktır.

Soğuk nosisepsiyon için Roman Tahlili<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Bu zararlı soğuk testiyle ilgili genel hedef, zararsızdan zararlıya soğuk algılamasındaki değişimleri nicelendirebilmek ve değerlendirebilmektir. Bu yöntem, yeni ve korunmuş soğuk nosisepsiyon genlerinin tanımlanmasını ve hastalık veya yaralanmalardaki ağrı yanıtı modülatörlerinin belirlenmesini kolaylaştırmak da dahil olmak üzere, nosisepsiyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, zararlı soğuk stimülüsünün hassas bir şekilde manipüle edilmesine ve çeşitli çevresel ve genetik bağlamlarda soğuğun tetiklediği yanıtların nicelendirilmesine olanak tanımasıdır.Genellikle bu yöntemde yeni olan kişilerin, bir deneye başlamadan önce probun tutarlı bir şekilde uygulanması konusunda pratik yapmaları gerekecektir. Bu yöntem fikri ilk olarak, drosophila larvalarının zararlı ısıya tepki verdiğini fark ettiğimizde ve zararlı soğuğa da aynı şekilde tepki verip vermediklerini merak ettiğimizde ortaya çıktı. Drosophila stoklarını veya genetik çaprazlamalarını 25 degrees Celsius bir inkübatörde yetiştirin.Not: Eğer bir melezleme kültürü yapılıyorsa, standart mısır unu sinek besiyeri içeren her şişe başına 20 ila 25 bakire dişi ve 15 ila 20 erkek kullanın ve sinekleri yeni bir besin şişesine aktarmadan önce yaklaşık 48 saat boyunca kültüre edin. Kültür başlatıldıktan beş gün sonra, yumuşamış besiyerine ve larvaların üzerine nazikçe bir su akımı püskürterek istenen genotipe sahip üçüncü instar larvaları toplayın. Ardından içeriği orta büyüklükte temiz bir Petri kabına boşaltın.Ardından, daha büyük ve hareketli üçüncü instar larvaların veya küçük, hastalıklı larvaların teste dahil edilmesini önlemek için pens kullanarak larvaları boyutlarına göre nazikçe ayırın. İstenmeyen genetik markerlar veya balansırlar içeren larvaları ayıklayın. Deney yapan kişinin, larvaların deney koşuluna veya genotipine karşı kör kalmasını sağlamak için, ayrılan larvaların yerleştirileceği kapları başka bir laboratuvar üyesinin etiketlemesini sağlayın.Bir scoopula kullanarak, oda sıcaklığındaki suyla yarıya kadar doldurulmuş, temiz ve etiketlenmiş bir Petri Kabına az miktarda taze yem aktarın. Son olarak, testlerin 20 dakikadan fazla sürmesi öngörülüyorsa, açlığı veya kurumayı önlemek için ayıklanan larvaları pens yardımıyla nazikçe yemin üzerine taşıyın. Soğuk prob ünitesini açarak ve istenen sıcaklığa soğuması için ona birkaç dakika tanıyarak başlayın.Prob üzerindeki fazla nemi bir laboratuvar mendiliyle silin. Hemen kullanılmadığında, hem yalıtım sağlamak hem de ucu temiz tutup hasarı önlemek için probun üzerine bir yalıtım kapağı yerleştirin. Ardından, kontrast görselleştirme ve probun hizalanmasına yardımcı olması için orta üçüncü instar larva bir parça ince koyu renkli hareketli vinil üzerine yerleştirin.Ardından, larva ile birlikte bu vinil parçayı bir parlak alan mikroskobunun altına yerleştirin. Kontrast sağlamak ve larvanın çok hızlı kurumasını önlemek için mikroskobu ve ışık ünitesini orta parlaklığa ayarlayın. Nemli bir resim fırçası kullanarak, larvanın vinile yapışmaması için Petri kabındaki su ile nemli olduğundan emin olun ve çevresindeki fazla suyu bir KimWipe kullanarak temizleyin.Vinili kullanarak larvayı doğru konuma getirin ve probu, anteroposterior vücut eksenine 90 derecelik bir açıyla larva yönünde elle ilerletin. Ardından, probun ucunu mikroskop tablasına yaklaşık 45 derecelik bir açıyla, larvanın orta-dorsal yüzeyinin üzerine nazikçe yatacak şekilde yönlendirin. Prob temas ettiği anda zamanlayıcıyı başlatın.İleri veya geri harekete izin verecek şekilde, larva kütikülünün yüzeyini hafifçe içeri çökertecek kadar aşağı doğru basınç uygulayın. Ardından, probu 10 saniyeye kadar veya soğuğun tetiklediği bir davranışsal yanıt gözlemlenene kadar, hangisi daha önce gerçekleşirse, yerinde tutun. Sonrasında probu geri çekin.Gözlemlenen davranışsal yanıtı ve yanıt süresini kaydedin. Yanıt vermeyenleri veya 10 saniye içinde yanıt vermeyen larvaları not edin. Son olarak, larvayı atın ve bir sonrakini hazırlayın.İstenilen test larvası sayısına ulaşana kadar prosedürü tekrarlayın. Soğuk prob ile temas sonrası, bu deneyden elde edilen sonuçlar, larvaların şu soğukla tetiklenen davranışlarla yanıt verdiğini göstermektedir: ön ve arka segmentlerini vücutlarının merkezine doğru büzerek kasılma (CT), ön ve arka segmentlerini havaya kaldırarak U-şekli oluşturma (US) ve yalnızca arka segmentlerini havaya kaldırma (PR). Ayrıca, farklı davranışlar değişen soğuk aralıklarında zirveye ulaşmaktadır; öyle ki PR ve US 3 ile 8 °C arasında, CT ise 9 ile 14 °C civarında zirve yapmaktadır. Son olarak, farklı soğuk davranışlarının latansları karşılaştırıldığında, bu veriler CT yanıtlarının 3 °C ve 10 °C'de PR ve US'den, 20 °C'de ise US'den anlamlı derecede farklı olduğunu göstermektedir.Bu teknikte uzmanlaşıldığında, 30 larvalık bir set için işlem yaklaşık 30 ila 40 dakikada tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken anormal lokomosyona, larvanın nem seviyesine, soğuk probun larva üzerine uyguladığı basınca ve yerleşimine dikkat etmek önemlidir. Soğuk probun hatalı uygulanması, farklı doz yanıt eğrilerine veya soğuk yanıt davranışının görülmemesine neden olabileceğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşır.Bu prosedürün ardından, floresan ışık görüntüleme, gen ekspresyon analizi ve davranışsal testler gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Tüm bunlar, soğuk maruziyetinin hücresel aktiviteyi, morfolojiyi, gen ekspresyonunu veya diğer davranışları nasıl etkilediğini belirleyecektir. Bu teknik, soğuk nosisepsiyon alanındaki araştırmacıların drosophila'daki genetik, çevresel ve hastalık etkilerini incelemesine yol açmaktadır.Bu videoyu izledikten sonra, soğukla tetiklenen yanıtları analiz etmek için soğuk prob aracını ve analizini nasıl kullanacağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalı ve soğuk nosisepsiyonunun hücresel ve genetik mekanizmalarını kavramalısınız.

novel-assay-for-cold-nociception-in-drosophila-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video makalede, istikrarlı ve denetlenebilir geometrileri odorant degradelerin inşaat sağlayan yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Biz kısaca bu gradyanlar koku alma kusurları (tam ve kısmi anosmi) ekrana nasıl kullanılabileceğini göstermek ve daha ince kemotaksis davranış özelliklerini incelemek için.

Yüksek çözünürlüklü Ölçüm Drosophila Larva Koku-Driven Davranış

Bu yazıda, tayinlerde termal nosisepsiyon çalışma...

Termal nosisepsiyon değerlendirilmesi Yerel ve Küresel Yöntemleri<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

&gt;Drosophila larvaları, potansiyel olarak zararlı termal uyaranlara tepkileri hayvanda caydırıcı veya "nosifensif" olarak adlandırılan davranışları tetikleyen özel duyusal nöronlara (nosiseptörler) sahiptir. Bu video, bir ısı probunun kütikül üzerine lokal olarak uygulanmasına yanıt olarak larva davranışını kaydederek termal nosisepsiyonunu değerlendirmek için bir yöntemi açıklar. Bu nedenle bu yönteme yerel ısı probu tahlili denir.

Lokal Isı Probu Deneyi: Drosophila Larvalarında Yüksek Sıcaklıkların Nosisepsiyonunu Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Bu video makalede, Drosophila melanogaster uçmak yetişkin meyve koku bağımlı gıda arama davranışı üzerine açlık veya tokluk etkisini ölçmek için otomatik bir deneyi açıklar.

Toplayıcılık Davranış için Tek-sinek Deneyi Drosophila

İnflamatuar hücre sinyal molekülü nitrik oksit (NO) seviyeleri yaygın olarak Griess reaktifi kullanılarak test edilir. Bu protokolde, NO'nun salgılanmasını basit, ölçülebilir ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir yöntemle tespit etmek için canlı Drosophila beyin dokusu kullanılarak modifiye edilmiş bir Griess testi oluşturduk.

Drosophila Nöroinflamatuar Yanıtında Nitrik Oksit Düzeylerinin Yeni Tüm Doku Kantitatif Testi

Burada, Drosophila larva sürekli termal degrade kullanarak tercih edilen ortam sıcaklığında belirlemek için bir iletişim kuralı mevcut.

Drosophila larva termal tercihlerini belirlemek için bir sıcaklık gradyanı tahlil

Bu protokolün amacı, Drosophila larvalarında mekanik nosiception için geliştirilmiş bir tahlilin nasıl gerçekleştirildiğini göstermektir. Buradaki tahlilleri, Drosophila larvalarında mekanik aşırı duyarlılığın (allodynia ve hiperaljezi) var olduğunu göstermek için kullanıyoruz.

Drosophila Larvalarında Mekanik Nosiception Ölçümü için Geliştirilmiş Bir Tahlil ve Araçlar

Bu makale, belirli nöronları aktive etmek ve susturmak için CsChrimson ve GtACR2 kullanarak Drosophila melanogaster'de optogenetik manipülasyon yöntemlerini sunmaktadır. Termotaktik ve tat davranışlarını keşfetmek için optogenetiği kullanmak ve bu süreçleri yöneten altta yatan nöral mekanizmalar hakkında bilgi sağlamak için dört deney tanımlanmıştır.

Drosophila melanogaster'de Nöral Devrelerin Optogenetik Manipülasyonu için Davranışsal Testler

Larva ve pupa da chordotonal organları immunostain ve görselleştirmek için bir...

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva ve Pupa

Drosophila larvaları tat ödül ile koku uyaranlara ilişkilendirmek edebiliyoruz. Burada iştahlı çağrışımlı koku öğrenme analizine olanak sağlayan bir basit davranışsal paradigma tarif.

In iştahlı İlişkilendirilebilir Olfaktör Öğrenme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Öğrenin, Drosophila larvalarında soğuk nosisepsiyonu incelemek için özel Peltier probu kullanarak davranışsal yanıtları nicelendirmeyi. Bu yöntem, ağrı mekanizmalarının hücresel ve moleküler düzeyde araştırılmasına olanak tanır.

Soğuk nosisepsiyon için Roman Tahlili

Daha fazla video keşfet