Name: Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Öğrenin floresans tabanlı nöraminidaz inhibisyonu testiyle influenza A ve B virüslerinin antivirallere duyarlılığını değerlendirmeyi. Bu yöntem dirençli ve hassas suşları ayırt ederek etkili tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Grip Referans ve Araştırma İşbirliği Merkezi Melbourne DSÖ Avustralya Hükümeti Sağlık Bakanlığı tarafından desteklenmektedir.

1. Belirlenmesi bir Fluorometer&#39;de Floresan Ürün 4-MU Lineer Aralığı <ol><li> mutlak etanol, 5 ml 4-MU 11.3 mg eritilmesi ile 6.4 mM 4-MU stok çözeltisi, 10 mL hazırlayın. (Ağırlık / hacim) stok çözeltisi, 10 mL yapmak için% 0.9 NaCl 5 mL ekleyin. 9 mL 1x deney tamponu (33.3 mM 2- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES) ve 4 mM CaCl2, pH 6.5) içinde 6.4 mM 4-MU 1 mL seyreltilerek çalışma çözeltisi 640 uM hazırlayın. Not: MES, 13 g damıtık suyun 8 mL 1 M CaCb 2 992 ml ilave edilerek 2 x deney tamponu hazırlayın. NaOH, 10 M ile pH 6,5&#39;e ayarlanır. gözenek boyutu 0.2 um steril selüloz asetat filtre kullanılarak tampon filtre. Dikkat! Sodyum hidroksit, kostik ve deriye ve gözlere kimyasal yanıklara neden olabilir. O tam kişisel koruyucu ekipman yıpranmış olduğundan emin olun. </li><li> 4-MU konsantrasyonda (yani, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 # bir dizi 5 mL hazırlanması181; M ve 1 x deney tamponu kullanılarak 640 uM 4-MU bir, iki kat seri seyreltme ile 320 uM). </li><li> 4-MU (yani, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 uM, 320 uM ve 640 uM), berrak içerisine (seyreltme başına iki oyuk), 96- her seri seyreltme, 50 uL dağıtın gözlü düz tabanlı levhada ve (arka plan sinyallerini ölçmek için boşlukları olarak hizmet eden) geri kalan kuyular içine 1 x deney tamponu 50 uL. Not: reaksiyon hacmi içinde 4-MU son konsantrasyonları (50 uL 4-MU + 50 uL 300 uM Munana), 160 uM ve 320 uM 2.5 uM, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM olan . </li><li> damıtılmış suyun 20 mL Munana 25 mg sulandırılması ile 2.5 mM MUNANA stok çözelti hazırlayın. 300 uM Munana çalışma çözeltisi (bir plaka için yeterli hacmi) elde etmek üzere 5.28 mL 1x deney tamponu ile 2.5 mM MUNANA 0.72 mL karıştırın. 300 uM Munana workin içeren tüp Kapakhemen kullanılan sürece g alüminyum folyo ile çözeltisi ve buz üzerinde tutun. herhangi bir artık malzeme atılır. Not: 2.5 mM MUNANA stok çözeltisi, 1 ay boyunca -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir ve bir donma / erime döngüsüne içinde kullanılmalıdır. 4-MU ve Munana çözeltiler ışığa duyarlı olan ve uzun süreli ışığa maruz kalmaktan korunmalıdır. </li><li> hafifçe karıştırmak için dokunun her kuyuya 300 uM Munana 50 mcL ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Buharlaşmayı önlemek için bir plaka kapatıcı ile örtün plaka. NOT: Bu adım, NA engelleme tahlilinde eşiğe hesaba etmektir. </li><li> 0.824 M NaOH 2.225 mL (bir plaka için yeterli hacim) ile mutlak etanol 11 mL karıştırılarak durdurma çözeltisi hazırlayın. </li><li> Reaksiyonu durdurmak ve hafifçe karıştırmak için dokunun her stop solüsyonu 100 mcL ekleyin. </li><li> PE olarak, 355 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu ayarı ve 460 nm&#39;lik bir emisyon dalga boyu ayarlı bir florometre kullanılarak plaka okumaÜreticinin talimatlarını r. </li><li> bir 4-MU içeren bütün yuvalara floresans sinyalleri kullanan ortalama arka zemin sinyali hesaplayın. 4-MU ihtiva eden yuvaların her biri bu ortalama arka zemin sinyali çıkarma ve her 4-MU konsantrasyonu için ortalama sinyal (RFU) hesaplar. Şekil 1a&#39;da gösterilen 4-MU konsantrasyonu (uM) karşı RFU bir standart eğri çizilir; Eğrinin yakından lineer kesiti Şekil 1b &#39;de gösterilmiştir. </li><li> doğrusal aralığını ve optimum hedef sinyalini belirlemek için 4-MU konsantrasyonu (uM) karşı RFU arsa Görselleştirin; lineer aralığı olduğu arsa üzerinde 4-MU artan konsantrasyonları ile orantılı olarak floresans sinyali arttıkça, en uygun hedef sinyal doğrusal aralığı içindeki bir rasgele 4-MU konsantrasyonu ise. NOT: doğrusal aralık ve optimal hedef sinyal florimetre özeldir. Örneğin, Melbourne WHOCCRRI de florimetre 2 doğrusal bir aralığı vardır0,5-40 uM 4-MU ve ~ 1.500 RFU tekabül ~ 30 uM 4-MU, optimal hedef sinyal. </li></ol> 2. Virüs NA Etkinliğinin Belirlenmesi NOT: Grip virüsleri Madin-Köpek Böbrek (MDCK) hücreleri veya embriyo halindeki tavuk yumurtalarının 8&#39;de yeterli titrelerine için kültürlenir. <ol><li> % 0.1 TFA içeren 1. sütun içine seyreltilmemiş kültür influenza virüslerinin oyuk başına 120 uL ve 1 x deney tamponu 60 uL dağıtın NP-40, 96 oyuklu U tabanlı bir plakanın geriye kalan 11 sütun halinde. </li><li> Seri olarak plaka boyunca virüslerin, iki kat seyreltme yerine (örneğin, sütun 2 sütun 1 60 uL transferi ve benzeri, sütun 11 kadar) sadece 1 x deney tamponu içeren bir boş olarak kolon 12 bırakarak bir çok kanallı pipet kullanarak. </li><li> berrak, 96-çukurlu, düz-tabanlı bir plakaya oyuklara (seyreltilmiş virüs ve boşluklar) her biri 50 uL aktarın. NOT: Bu c gerekli değildirMalzemeler 1. sütun üzerine kolon 12&#39;den transfer edilmesi halinde hange pipet uçları. </li><li> oyuk başına (1.4 adım göre hazırlanmıştır), 300 uM Munana 50 uL eklenir ve hafifçe karıştırın plaka dokunun. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakası. Buharlaşmayı önlemek için bir plaka kapatıcı ile örtün plaka. </li><li> reaksiyonun sona erdirilmesi ve yavaşça plaka karıştırmak için dokunun göz başına (adım 1.6 uygun olarak hazırlandı) durdurma çözeltisi, 100 uL ekleyin. </li><li> Bir fluorometreyle plakasını okuyun. <ol><li> 355 nm&#39;lik bir uyan dalga boyu ayarı ve 460 nm emisyon dalga boyu ayarını kullanın. </li></ol></li><li> 12. kolonunda floresans değeri göre ortalama arka zemin sinyali belirlemek ve her bir ortalama arka plan sinyali çıkarılır. Virüs dilüsyonları karşı RFU grafiğini çiziniz. Not: WHOCCRRI Melbourne 100 uM Munana için arka plan değerleri 50 ve 120 RFU arasında, tipik olarak, ancak bu florimetre bei bağlı olarak farklılıkng kullanılır. </li><li> Her bir virüs (Şekil 2) için eğrinin doğrusal bölümünün orta-noktasını belirlemek için virüs seyreltmeleri karşı RFU arsa gör. referans noktası olarak (aşama 1 &#39;de belirlenen) en uygun hedef sinyali kullan. Not: Bu bölüm 1 &#39;de tayin florometre 4-MU lineer aralığı uygun olmalıdır ve virüslerin uygun bir konsantrasyon bölüm 3&#39;te kullanılmak üzere sağlar. </li></ol> 3. NA önleme deneyi kullanılarak NA İnhibitörlerine Virüs duyarlılık değerlendirilmesi <ol><li> 300 uM konsantrasyonlarda NA inhibitörlerinin ana stoklarının hazırlanması. <ol><li> 50 ml 2 x deney tamponu (66.6 mM MES ve 8 mM CaCl2, pH 6.5) zanamivir 5.0 mg eritilmesi ile 300 uM zanamivir (molekül ağırlığı, molekül ağırlığı = 332,32 g / Mol) hazırlayın. </li><li> 2 x deney tamponu, 50 mL 5.8 mg çözülmesiyle (MW = 386,44 g / mol D-tartrat) 300 uM oseltamivir karboksilat hazırlayın. </li><li> hazırlamak300 uM peramivir trihidrat (MW = 382,45 g / Mol) 2 x deney tamponu, 50 mL 5.7 mg çözülmesiyle. </li><li> 2 x deney tamponu, 50 mL 5.2 mg çözülmesiyle 300 uM laninamivir (MW = 346,34 g / Mol) hazırlayın. Not: NA inhibitörü ana stoklar 12 ay boyunca -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. Doğru ağırlıkları ve hacimleri, yeniden kullanılır sağlamak NA inhibitörü MW edin. Oseltamivir karboksilat ön-ilaç, oseltamivir fosfat aktif bileşiktir. Bu nedenle, sadece oseltamivir karboksilat NA engelleme tahlilinde kullanılmalıdır. </li></ol></li><li> master stoklar kaynaktan, 0.03 nM, 0.3 nM, 3 nM, 30 nM, 300 nM, 3,000 nM konsantrasyonlarda 50 ml lik santrifüj tüpleri içinde NA inhibitörü olarak on kat seri seyreltmeler stokları çalışma hazırlanması ve 2x deneyde 30.000 nM tampon (66.6 mM MES, ve 8 mM CaCl2, pH 6.5); Bu çoklu tahliller arasında kullanım içindir. Not: Reaksiyon volum NA inhibitörü nihai konsantrasyonlarıE (virüs seyreltme 300 uM Munana + 50 uL NA inhibitörü + 50 uL 50 uL), sırasıyla 0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1,000 nM ve 10,000 nM bulunmaktadır. nihai konsantrasyon durdurma çözeltisi, 100 uL içermez. 2-8 ° C sıcaklıkta bütün NA inhibitörleri dilüsyonları saklayın. Son kullanma tarihi ana stoklarının aynıdır. </li><li> 96 derin oyuklu blokta% 0.1 NP-40 yüzey aktif madde ihtiva eden 1 x deney tamponu içinde virüs seyreltim dizileri hazırla. Dört NA inhibitörlerini test etmek virüs başına 2 mL toplam hacim kullanma bölüm 2. türetilen NA etkinlik tahlili sonuçlarına göre virüs seyreltmeleri kullanın. NOT: 96 derin oyuklu bloğunda virüs başına iki kuyu (oyuk başına 1 ml) hazırlayın. VİRÜS 1, 2 ve 3 için virüs seyreltmeleri örnekleri Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> 8, derin gözlü rezervuara (adım 3.2 uygun olarak hazırlandı) NA inhibitörlerinin gerekli hacmi koyun. Oradan, değişen seyreltiklerinde 50 uL NA inhibitörlerinin dağıtmak 0 nM (2x deney bUffer sadece) berrak, 96-çukurlu, düz-tabanlı plaka içindeki H&#39;ye kadar olan sıralara A 30,000 nM. Not: levha düzeni, Şekil 3&#39;te gösterilmektedir. </li><li> İyice karıştırın ve 45 dakika için oda sıcaklığında inkübe plaka dokunun yalnızca sütun 12. sütunlar 1-11 ve 1 x deney tamponu oyuk başına 50 uL oyuk başına seyreltilmiş test virüslerinin 50 uL ekleyin. Buharlaşmayı önlemek için bir plaka kapatıcı ile örtün plaka. </li><li> oyuk başına (1.4 adım göre hazırlanmıştır), 300 uM Munana 50 uL eklenir ve hafifçe karıştırın plaka dokunun. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakası. Buharlaşmayı önlemek için bir plaka kapatıcı ile örtün plaka. </li><li> karıştırmak için plaka dokunun de hafifçe her birine (adım 1.6 uygun olarak hazırlandı) durdurma çözeltisi, 100 uL ekleyin. </li><li> Bir fluorometreyle plakasını okuyun. <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi, 355 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu ve 460 nm&#39;lik bir emisyon dalga boyunu kullanarak. </li></ol></li></ol> 4. HesaplamaIC 50 Değerler Not: JASPR v1.2 IC50 değerlerinin hesaplanmasını sağlar eğri uydurma yazılımı. yazılım CDC, Atlanta, ABD Grip Bölümü tarafından geliştirildi. Yazılım denklem kullanır: H = Vmaks x (1 - ([I] [l])) / (K +), V max metabolizması maksimum hızı olduğu, [I], V inhibitör konsantrasyonudur olan yanıtı inhibe edilen, ve K inhibisyon eğrisi için IC50. <ol><li> Kopyalama ve 12 kolon plaka biçiminde (96-gözlü) &#39;de bir elektronik tabloya florometre tarafından üretilen ham verileri yapıştırın hücre A1 ile başlanarak hazırlandı. NOT: sonraki her plakadan Ham veri bir sıra boş sendeleyerek edilmelidir. buradaki her bir virüs, dört NA inhibitörü karşı test edilmişse, (her bir plaka arasında boş bir sıra ile) dört bir kümesindeki ham verileri yapıştırın. </li><li> uydurma yazılım ve cl açın&quot;Deney&quot; sekmesine Ick. &quot;Alternatif 2-ilaç Flor 11 Örnekleri&quot; ı seçin. </li><li> &quot;Seçenekler&quot; sekmesini tıklayın ve kene &quot;Grafikler oluşturun.&quot; </li><li> &quot;Seçenekler&quot; tekrar tıklayın ve &quot;Yeni Anahtar&quot; sekmesine tıklayın. Ham veriler tablo dosyası ile aynı klasörde &quot;inhibition_key&quot; .csv dosyası olarak kaydedin. </li><li> inhibition_key dosyasında, ID altındaki tüm örnek adlarını listeler. Her örnek adı benzersiz olmalıdır. </li><li> Dört NA inhibitörleri test edilmiştir ise, Oseltamivir altında iki ek satır için boşluk eklemek ve &quot;peramivir&quot; ve tip &quot;Laninamivir.&quot; inhibition_key dosyaya yapılan değişiklikleri kaydedin. </li><li> &quot;Jaspr v 1.2-İnhibisyon Eğri uydurma&quot; penceresi dönün ve olarak &quot;Deney Dosya&quot; ve inhibition_key olarak ham veri dosyasını seçin &quot;Anahtar Dosyası.&quot; analizini çalıştırın. .csv ve .pdf formatlarında sonuçları kaydedin. NOT: yazılım otomatik bir inhibisyon eğrisini çizmek olacaktır (RFU agaiNST NA inhibitörü konsantrasyonları), Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi. Bu program aynı zamanda tek bir NA inhibitörü (Şekil 4) karşı her bir virüs için IC50 değerlerini hesaplar. Buna ek olarak, JASPR IC50 değerleri ve tablo biçiminde sinyal-arka plan (S / B) oranı sunmaktadır. Arka plan değerleri kullanılır florometrede bağlı laboratuardan laboratuara farklılık gösterebilir. Melbourne WHOCCRRI anda, arka plan 50 ila 120 RFU 100 uM Munana aralığı için değer verir. 10&#39;dan daha az bir oran, özellikle çok düşük bir NA aktiviteye sahip mutant virüs, yine de kabul edilebilir olmasına rağmen güvenilir bir IC50 değeri, ≥10 bir S / B oranı tercih edilir. </li><li> IC50 değerleri ve yazılımı ile üretilen eğri şekiller kontrol edin. Bütün veri noktaları, ilgili düşebilir veya eğrisine yakın olmalıdır; Eğer başaramazlarsa, NA önleme deneyi tekrarlayın. NOT: olağanüstü yüksek IC 50 değerlerini gösteren virüsler için tahlil tekrarı olmalıed sonucu teyit etmek. </li></ol>

<ol><li>Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuraminidase+inhibitors+for+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22N.Engl.J.Med%22%5BJournal%5D)">Neuraminidase inhibitors for influenza.</a> N.Engl.J.Med. 353 (13), 1363-1373 (2005).</li>
<li>Hurt, A. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19132915">Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors.</a> Antiviral Res. 132, 178-185 (2016).</li>
<li>Meijer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+update+on+the+susceptibility+of+human+influenza+viruses+to+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors.</a> Antiviral Res. 110, 31-41 (2014).</li>
<li>Takashita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+update+on+the+susceptibility+of+human+influenza+viruses+to+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors.</a> Antiviral Res. 117, 27-38 (2015).</li>
<li>Lackenby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+resistance+to+oseltamivir+among+influenza+A%28H1N1%29+viruses+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveill%22%5BJournal%5D)">Emergence of resistance to oseltamivir among influenza A(H1N1) viruses in Europe.</a> Euro Surveill. 13 (5), (2008).</li>
<li>Hurt, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+transmission+of+oseltamivir-resistant+A%28H1N1%29pdm09+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Community transmission of oseltamivir-resistant A(H1N1)pdm09 influenza.</a> N Engl J Med. 365 (26), 2541-2542 (2011).</li>
<li>Takashita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+large+cluster+of+influenza+A%28H1N1%29pdm09+viruses+cross-resistant+to+oseltamivir+and+peramivir+during+the+2013-2014+influenza+season+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Characterization of a large cluster of influenza A(H1N1)pdm09 viruses cross-resistant to oseltamivir and peramivir during the 2013-2014 influenza season in Japan.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (5), 2607-2617 (2015).</li>
<li>Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus+isolation%2C+culture+and+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus isolation, culture and identification.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meetings+of+the+WHO+working+group+on+surveillance+of+influenza+antiviral+susceptibility+-+Geneva%2C+November+2011+and+June+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Wkly+Epidemiol+Rec%22%5BJournal%5D)">Meetings of the WHO working group on surveillance of influenza antiviral susceptibility - Geneva, November 2011 and June 2012.</a> Wkly Epidemiol Rec. 87 (39), 369-374 (2012).</li>
<li>A summary of amino acid substitutions in the influenza neuraminidase associated with resistance or reduced susceptibility to NAIs. WHO. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/antiviral_susceptibility/avwg2014_nai_substitution_table.pdf?ua=1">http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/antiviral_susceptibility/avwg2014_nai_substitution_table.pdf?ua=1</a> (2016).</li>
<li>Okomo-Adhiambo, M., Hurt, A. C., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemiluminescent+neuraminidase+inhibition+assay%3A+a+functional+method+for+detection+of+influenza+virus+resistance+to+the+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The chemiluminescent neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors.</a> Methods Mol Biol. 865, 95-113 (2012).</li>
<li>Hurt, A. C., Okomo-Adhiambo, M., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescence+neuraminidase+inhibition+assay%3A+a+functional+method+for+detection+of+influenza+virus+resistance+to+the+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The fluorescence neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors.</a> Methods Mol Biol. 865, 115-125 (2012).</li>
<li>Analysis of IC50 data. isirv Antiviral Group (isirv-AVG). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://isirv.org/site/index.php/methodology/analysis-of-ic50-data">https://isirv.org/site/index.php/methodology/analysis-of-ic50-data</a> (2016).</li>
<li>Sleeman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R292K+substitution+and+drug+susceptibility+of+influenza+A%28H7N9%29+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">R292K substitution and drug susceptibility of influenza A(H7N9) viruses.</a> Emerg Infect Dis. 19 (9), 1521-1524 (2013).</li>
<li>Gubareva, L. V., Robinson, M. J., Bethell, R. C., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+and+framework+mutations+in+the+neuraminidase+active+site+of+influenza+viruses+that+are+resistant+to+4-guanidino-Neu5Ac2en%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Catalytic and framework mutations in the neuraminidase active site of influenza viruses that are resistant to 4-guanidino-Neu5Ac2en.</a> J Virol. 71 (5), 3385-3390 (1997).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

NA inhibitörlerine grip virüsü duyarlılık küresel izleme anda flüoresan veya kimyasal olarak ışık veren NA engelleme deneyleri 11, 12 kullanarak Bir çok laboratuarda ile yürütülmektedir. floresan deneyi daha yaygın kimyasal parlaklık deneyinde daha kullanılır. Her iki testte de sağlam ve tekrarlanabilir olmasına rağmen, flüoresan bazlı deneyde elde edilen IC50 değerleri 13 zor iki deneyden elde edilen verilerin doğrudan bir karşılaştırma yapmak, kimyasal ışıldama bazlı deneyde genellikle daha yüksektir. Hatta aynı protokol kullanılarak, bir laboratuardan elde edilen veri bir arasında değişebilir. Çünkü laboratuarlar arasında bu varyasyonların, WHO Çalışma Grubu Grip Antiviral DUYARLILIKLARININ Gözetim üzerinde laboratuvarlar arası karşılaştırmalar yardımcı olacak bir kılavuz üretti. Daha ziyade, bu kılavuz araç kullanımı mutlak IC50 değerleri karşılaştırarak dahamedyan her bir laboratuarda test NI influenza virüslerinin IC50 IC 50 kat farka dayalı olarak sa karşılaştırması. Beş işbirliği merkezlerinden verileri karşılaştırmak yeteneği küresel Antiinfluenza duyarlılık verileri 2, 3, 4 yıllık yayın ile sonuçlanmıştır. Kamu malı grip duyarlılık verilerin büyük miktarda mevcudiyeti araştırmacılar kendi laboratuarlarında üretilen bu olanlar çalışmalardan IC50 verileri karşılaştırmak için izin verir. benzer bir kavram kabul Diğer NA engelleme analizleri de ticari olarak mevcuttur. Hazır kullanımlı reaktifleri içerir Bu ticari takımlar (NA dahil değildir inhibitörleri) eşit tekrarlanabilir. reaktiflerinin çoğu, in-house yapılabilir Ancak, in-house NA engelleme tahlil, ticari kitler büyük ölçüde daha ucuz olanDaha büyük miktarlarda ve daha önce tayinin büyük maliyeti oluşur Munana substrat, şimdi rekabetçi fiyatlarla çeşitli kaynaklardan satın alınabilir. ilaç başına bir grip izolatı test maliyetinin yaklaşık $ 1 (ABD) &#39;dir. Melbourne WHOCCRRI da gelişmeler tahlilin sıvı işleme bileşenleri için bir robot platformun dahil edilmesinin ardından in-house NA engelleme deneyi yapılmıştır. Yanı sıra virüs seyreltmeleri elle preparattan, prosedürlerin çoğu, sıvı işleme robotunu kullanılarak gerçekleştirilir. Bu el işçiliğini en aza indirmek, ama aynı zamanda bir günde çalıştırılabilir tahliller sayısını artırır kalmaz. NA engelleme deneyi son derece sağlam olmakla birlikte, ek dikkatle tamamlanması gereken kritik adımlar bir dizi vardır. İlk olarak, inhibisyon eğrileri ve IC50 değerleri kayabilir NA inhibitörü konsantrasyonlarında herhangi bir düzensizlik; Dolayısıyla, dikkatli dikkat edilmelidirNA inhibitörü konsantrasyonları hazırlanırken ödenir. İkinci olarak, doğru pipetleme ve hassas inkübasyon süreleri deneyleri tutarlı sonuçlar korunması için önemlidir; Bu kalibre pipetler ve zamanlayıcılar kullanılarak elde edilebilir. Her deneyde kontrol virüsleri dahil edilmesi de tahlilinden tahlile ve uzun süreler boyunca tahlil performansı izlenmesini sağlar. mevsimsel grip virüsleri NA enzim aktivitesi pH değeri 6.5 olan en uygunudur, çünkü Üçüncü olarak, deney tamponu doğru pH değeri önemlidir. Bazı raporlar, düşük değerli pH koşulları kullanılması, R292K mutasyon 14, 15 ihtiva eden bir (H7N9) varyant influenza varyantları belirlenmesini geliştirdiğini bulmuşlardır. Bununla birlikte, deney tamponu pH modifikasyon IC50 değerleri kayacak ve bu lâboratuarlarda ve laboratuarlar arasında veri karşılaştırmasını güçleştirebilir. Diğer modifikasyonlar ve p olabilir sorunerformed Tablo 5&#39;te listelenmiştir. NA inhibitörleri şu anda grip virüsleri dolaşan karşı etkilidir onaylanmış antiviral sadece sınıfıdır. diğer antiviral sınıflar klinik kullanıma hazır hale kadar, grip virüsleri dolaşan antiviral duyarlılık gözetim yalnız NA inhibitörleri üzerinde durulacaktır. Çünkü basitlik ve sonuçların tekrar edilebilirlik, UA inhibisyon deneyinin kullanımı devam edecek NA inhibitörlerine grip virüsü duyarlılığını değerlendirmek için.

Hemaglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA), grip A ve B virüsleri, iki ana yüzeyi glikoproteinleridir. NA, hücre yüzeyi 1 galaktoz sialik asit bölünmesiyle virüsü serbest iken, HA, hücre yüzeyi glikoproteinleri ya da glikolipidler sialik asit-galaktoz bağlanır. UA inhibitörleri rasyonel ve böylece virüs progenisinin salınmasını ve yayılmasını önlemek, UA, enzimatik olarak aktif siteye sıkı bir şekilde bağlamak için tasarlanmıştır grip antiviraller sınıfıdır. Oseltamivir ve zanamivir tedavisi ve grip profilaksisi için dünya çapında birçok ülkede onaylanmıştır iki NA inhibitörleri. Son yıllarda, iki ek NA inhibitörleri, peramivir ve laninamivir, ülkelerin sınırlı sayıda kullanım için onaylanmıştır. NA inhibitörlerine karşı duyarlılık ve direnç kazandıran mutasyonun belirlenmesi için grip virüsleri taranması belirlenmesi ve etkiliğin izlenmesinde önemlidirantiviral bu sınıfın eness. Son 16 yıl içinde, flüoresan bazlı NA engelleme deneyi, grip virüsleri, dolaşımdaki arasında antiviral duyarlılık değişen eğilimini izlemek için Influenza, Melbourne (Melbourne WHOCCRRI) ile Referans ve Araştırma Merkezi WHO rutin gerçekleştirilmiştir. Yıllık olarak yaklaşık 2.000 grip virüsleri antiviral duyarlılık için test edilir. 2007-2008 Kuzey Yarıküre influenza mevsiminde, önceki mevsim A (H1N1) virüs sayısında bir artış vardı, ancak en fazla grip mevsimlerde, virüslerin&gt;% 98, dört NA inhibitörü 2, 3, 4 yatkındır o oseltamivir 5 düşük yatkınlık almıştı. 2008 yılı sonuna kadar dünyanın geri kalanına yayıldı NA amino asit ikamesi H275Y içerdiği virüs grubu, oseltamivir inappropri yapmaBu virüsün tedavisi için küresel yedi. Şu anda, grip B, influenza A (H3N2), ve grip A dolaşan büyük çoğunluğu (H1N1) pdm09 suşları oseltamivire hassas olsalar da, her ne kadar oseltamivir düşük kazandıran NA amino asit ikamesi H275Y ihtiva eden A (H1N1) pdm09 varyantlarının topluluğu kümeleri ve peramivir duyarlılık, dünyanın 6, 7 çeşitli yerlerinde bildirilmiştir. Çünkü yeterince yüksek bir virüs titresi için ihtiyaç, (hayvan nazal yıkama da dahil olmak üzere), klinik numuneler, hücre kültürü içinde geçirilir veya antiviral duyarlılık testi öncesinde tavuk yumurtası embriyolu gerekir. Bu makalede açıklanan NA engelleme deneyi, üç bölüme ayrılabilir: Belirli bir florometrede floresan ürünü 4-metilumbelliferonun (4-MU) doğrusal aralığının belirlenmesi Nedeniyle Fluorometreler arasındaki içsel farklılıklar nedeniyle, tO floresan son ürünün, 4-MU ve nispi floresan ünitesi (RFU) doğrusal aralık oluşturulması gerekmektedir. 4-MU için lineer aralığı bir kez kurulduğunda, en uygun hedef sinyal influenza virüsleri konsantrasyonu, NA aktivitesi deneyinde ayarlanır hangi seçilir. Belirli flüorometrede için Tamamlandığında, bu tekrarlanması gerekmez. virüslerin NA aktivitesini belirleme Seri virüsleri seyreltildi (4Metilumbelliferil) -α-D-N -acetylneuraminic asit (Munana) substratı - yoktur aktivite deneyi 2 &#39;eklenmesini içerir basit bir testtir. NA ile Munana parçalanmasından elde edilen floresan son ürün 4-MU miktarı, bir florometre kullanılarak ölçülür. NA engelleme tahlilinde kullanılacak uygun virüs seyreltme virüsü seyreltme karşı floresans birimleri çizilerek seçilir. üretilen sigmoid eğriden, doğrusal kesitin orta noktası uygun olmalıdırflorometre 4-MU lineer aralığı bölüm 1 &#39;de tayin ve bölüm 3&#39;te kullanılmak üzere virüslerin uygun bir konsantrasyonunu bilgilendirir. NA engelleme analizi kullanılarak NA inhibitörlerine değerlendirilmesi virüs duyarlılığı Belirli bir NA inhibitörü virüslerin duyarlılığını değerlendirmek için, bölüm 2&#39;de belirlenen seyreltide virüs NA inhibitörü bir konsantrasyon aralığında ile inkübe edilir. Munana ile daha sonraki bir inkübasyonun ardından, inhibe edilmemiş virüs tarafından üretilen 4-MU florometre ile RFU ölçülür. Bir virüsün NA enzim aktivitesi NA inhibitörün inhibe edici etkisi, bir IC50 değeri olarak verilir NA aktivitesinin% 50&#39;sini azaltmak için gerekli olan NA önleyici konsantrasyonuna göre hesaplanır.

<table><tbody><tr><td>İnfluenza A ve B virüsleri</td><td></td><td>MDCK hücrelerinde veya 9 günlük embriyonlu spesifik patojen içermeyen (SPF) yumurtalarda</td><td></td>kültürlenmiş</tr><tr><td>Madin-Darby Köpek Böbreği (MDCK) hücreleri</td><td>ATCC</td><td>PTA-6500</td><td></td></tr><tr><td>2- (4-metilumbelliferil) -a-D-N-asetilnöraminik asit (MUNANA)&nbsp;</td><td>Biosynth AG</td><td>M-5507</td><td></td></tr><tr><td>2- (4-metilumbelliferil) -a-D-N-asetilnöraminik asit (MUNANA) &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M8639</td><td></td></tr><tr><td>4-Metilumbelliferon (4-MU)</td> <td>Sigma</td><td>M1381-25G</td><td></td></tr><tr><td>2 - [N-morfolino] etansülfonik asit (MES hidrat) (serbest asit) &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M8250-250G</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür (Ca Cl2)&nbsp;</td><td>APS AJAX İnce Kimya&nbsp;</td><td>127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Yüzey Aktif Madde-Amps-NP-40 (%10 çözelti)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td></td><td></td>PIE28324</tr><tr><td>Sodyum Hidroksit (NaOH)&nbsp;</td><td>APS AJAX Finechem</td><td>482-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Mutlak Etanol&nbsp;</td><td>APS AJAX Finechem</td><td>214-2.5L GL</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu şeffaf düz tabanlı plakalar</td><td>NUNC</td><td>456537</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu U-tabanlı plakalar</td><td>Greiner Bio-one&nbsp;</td><td></td><td></td>4650101</tr><tr><td>8 kanallı derin kuyu bloğu</td><td>Pasifik Laboratuvar Ürünleri</td><td>RES-MW8-HP</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu derin plakalar, 2.0 mL kare kuyular</td><td>Pasifik Laboratuvar Ürünleri</td><td>P-2ML-SQ-C</td><td></td></tr><tr><td>Plaka kapatıcılar</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>236366</tr><tr><td>Şişe üstü vakum filtre sistemi (selüloz membran (nitrat), gözenek boyutu 0.2 & mu; m, membran alanı 33,2 cm2, filtre kapasitesi 500 mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430758-12EA</td><td></td></tr><tr><td>Tek kanallı pipetler (1 & mikro; L - 1.000 ve mikro; L)</td> <td>Tedarikçilerin çeşitliliği (örn. Eppendorf, Sartorius)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı pipetler</td><td>Tedarikçi çeşitliliği (örn. Eppendorf, Sartorius)</td><td>8 veya 12 kanallı elektronik ve manuel pipet (5 - 1250 & mikro; L hacim)</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları (1 & mikro; L - 1.250 ve mikro; L)</td> <td>Tedarikçilerin çeşitliliği (örn. Eppendorf, Sartorius)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık pipetler (10 mL ve 25 mL)</td><td>Greiner Bio-one&nbsp;</td><td>P7740-200EA ve P7865-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Pipet kontrolörü</td><td>Eppendorf</td><td>4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpleri 50 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Raflı tüpler</td><td>Scientific Specialties, Inc.</td><td>1750-00</td><td></td></tr><tr><td>355 nm uyarma dalga boyu ayarına ve 460 nm emisyon dalga boyu ayarına sahip florometre</td><td>TermoFisher Scientific</td><td>ASCENT FL 374</td><td></td></tr><tr><td>Ascent yazılımı</td><td>TermoFisher Scientific</td><td>5185410CD</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör 37 &°C olarak ayarlanmıştır; C</td><td>Lab Tedarik</td><td>Biocell 1000</td><td></td></tr><tr><td>Zanamivir</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>Doğrudan şirketten</td><td></td></tr><tr><td>talep Oseltamivir karboksilat</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peramivir (BCX-1812)</td> <td>BioCryst</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laninamivir (R-125489)</td> <td>Daiichi-Sankyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; CDC Atlanta, ABD'de JASPR v1.2</td><td>Grip Bölümü&nbsp;</td><td>İstek üzerine ücretsiz olarak temin edilebilir (fluantiviral@cdc.gov)</td><td></td></tr></tbody></table>

floresans tabanlı nöraminidaz İnhibisyonu tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü class nezle virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

nöraminidaz (NA) önleyicisi, dolaşımdaki suşlara karşı etkili olan grip tedavisi ve profilaksisi için onaylanmış antiviraller sadece sınıfıdır. mevsimsel grip tedavisinde kullanımlarına ek olarak, NA inhibitörleri bir pandemi durumunda kullanılmak üzere bir dizi ülke tarafından biriktirildi. Antiviral bu sınıfa grip virüsleri dolaşan duyarlılığını izlemek için önemlidir. Orada NA inhibitörlerine influenza virüslerinin duyarlılığını değerlendirmek için kullanılabilir deneyleri farklı türleri vardır, ancak bir floresan substrat veya kemilüminesan substrat kullanılarak enzim engelleme tahlilleri en yaygın olarak kullanılan ve tercih edilir. Bu protokol, NA inhibitörlerine influenza virüs duyarlılığı değerlendirmek için bir floresan bazlı tahlilin kullanımını tarif eder. Munana ((4-metilumbelliferil) -α-D-N -acetylneuraminic asit - Deney 2 &#39;yaran NA enzim dayanır) Floresan ürünü 4-metilumbelliferon (4-MU) serbest bırakmak için alt-tabaka. Bu nedenle, influenza virüsü üzerine düzenlenen an NA inhibitörü önleyici etkisi bir IC50 değeri olarak verilir NA aktivitesinin% 50&#39;sini azaltmak için gerekli olan NA önleyici konsantrasyonu, göre belirlenir.

Grip Antiviral Duyarlılıkları 9 Gözetimi üzerine WHO Çalışma Grubu standardize raporlama kurallarına kullanarak, NA inhibitörlerine grip virüslerinin duyarlılık şartlarını normale inhibisyon (NI), azaltılmış engelleme (RI) ve yüksek oranda azaltılmış inhibisyon kullanılarak rapor edilir (HRI) . NI virüsleri 50 değerleri en az 10 kat daha influenza A virüs (veya grip B virüsleri, 5-kat daha az) için IC50 orta referans ile karşılaştırıldığında IC sahip olanlardır. RI virüsleri 10- ve influenza A virüs (veya 5- ve grip B için 50-kat) için IC50 orta referans yaklaşık 100 kat arasında IC50 değerlerine sahip olanlardır. HRI virüsleri 100 kat 50 değerleri, influenza A virüs (veya grip B virüsleri 50 kat üzerinde) IC50 orta referansla yukarıda IC sahip olanlardır; Tablo 2 ye bakınız. 50 değerleri IC50 değerleri küçük değişiklikleri yansıtacak şekilde hesaplanmış ve Melbourne WHOCCRRI de yıllık olarak güncellenir NA inhibitörlerine influenza suşlarına dolaşım (Tablo 3). İnfluenza A (H1N1) medyan IC50 değerleri pdm09 virüsleri dört NA inhibitörleri arasında hemen hemen aynıdır, ancak orta zanamivir ve laninamivir IC A (H3N2) virüs 50 değerleri oseltamivir kıyasla 4 kat daha yüksektir 2- ve peramivir IC50 değerleri (Tablo 3). İnfluenza B virüsleri için orta oseltamivir IC50 değeri, genel olarak 5 ila zanamivir peramivir ve laninamivir IC50 değerleri (Tablo 3) daha yüksek 10-kat fazladır. NA engelleme deneyi genetik değişiklikler Associ hakkında bilgi sağlamaz bir fenotip deneyidirUR veya İHK yol açabileceği. Nedenle, genetik analiz UR veya İHK ile virüslerin tespiti aşağıdaki yapılır önemlidir. Melbourne WHOCCRRI anda, varyantların NA geni Sanger sıralama ve piro-dizileme kullanılarak analiz edilir. R &#39;ve HRI varyantları ile virüslerin NA geninin bulunabilir amino asit ikamelerinin temsili bir listesi, Tablo 4&#39;te sunulmuştur. NAI duyarlılık değiştirebilir amino asit ikamelerinin daha geniş bir listesi de WHO websitesini 10 mevcuttur. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55570/55570fig1.jpg" /> Şekil 1: 4-MU konsantrasyonuna karşı RFU. 4-MU konsantrasyonu (uM) karşı RFU (a) standart eğrisi. noktalı kutu florometre 4-MU doğrusal aralığını gösterir. doğrusal aralığı üzerinde floresan sinyalleri, doymuş ve bu nedenle, herhangi bir s edilebilirfloresan içinde alışveriş merkezi değişiklikler florometreyle tespit edilmeyebilir. (B) tanımlanması için Şekil 1a, standart eğrinin yakın çekim doğrusal bölüm &quot;en uygun hedef sinyali&quot;. Melbourne WHOCCRRI de florimetre 2,5-40 uM 4-MU bir doğrusal aralığı ve ~ 1.500 RFU tekabül ~ 30 uM 4-MU optimal hedef sinyal vardır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55570/55570fig2.jpg" /> Şekil 2: influenza virüslerinin NA aktivitesi grafikler Örnek. 50.61 RFU ortalama arka plan değeri NA aktivite eğrisi üzerinde, her seyreltme noktasından çıkarılır edilmiştir. Oklar her bir virüs için NA engelleme tahlilinde kullanılacak uygun virüs seyreltme göstermektedir. daha kolay hazırlık içinVirüs dilüsyonları Preparasyonu, tek VİRÜSÜ 3 yerine 1/96 seyreltme için 1/100 seyreltme gerçekleştirmek tercih edebilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55570/55570fig3.jpg" /> Şekil 3: Mevcut inhibisyon deneyinin kurulumu için plaka düzeni. Her plaka bir virüs sadece 1 x deney tamponu (AB), UA inhibitörü, Munana ihtiva eden bir negatif kontrol olarak görev yapan son sütunu, içerir ve durdurma çözeltisi. NOT: JASPR IC50 değerlerinin hesaplanmasında kullanılan ortalama boş sinyali belirlemek için her bir plakanın 12. kolonunda okumaları kullanır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> Şekil 4: A (H1N1) pdm09 virüsü A / Perth / 82/2015 bir inhibisyon eğrisi ve IC50 değeri örneği. JASPR yazılım eğrisi içinde her bir nokta bir uyum için, UA inhibitörünün artan bir konsantrasyonu ile (nM) karşı floresan (RFU) ve inhibisyon eğrisini göstermektedir. NA önleyici konsantrasyonu, virüs NA aktivitesinin% 50&#39;sini azaltmak için inhibisyon eğrisine göre, IC50 değeri belirlenir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Virüs </td><td> Virüs seyreltilmesi gerekli </td><td> 1x değerlendirme tampon maddesi hacmi (uL) </td><td> Yüzey aktif madde-Amp-NP-40 (% 10) (ml) </td><td> Virüs hacmi (ml) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 20/01 </td><td> 940 </td><td> 10 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1/40 </td><td> 965 </td><td> 10 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1/100 </td><td> 890 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: NA engelleme tahlilinde VİRÜS 1, 2 virüs seyreltmeleri hazırlanması ve 3. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Virüs tipi / alt tip / soy </td><td> Normal engelleme </td><td> Azaltılmış engelleme </td><td> Son derece düşük inhibisyon </td></tr><tr><td> (NI) </td><td> (Rİ) </td><td> (HRI) </td></tr><tr><td> A (H1N1) pdm09 </td><td> &lt;10 kat </td><td> 10-100 kat </td><td> &gt; 100 misli </td></tr><tr><td> A (H3N2) </td><td> &amp;60.; 10 kat </td><td> 10-100 kat </td><td> &gt; 100 misli </td></tr><tr><td> B Yamagata ve B Victoria </td><td> &lt;5 kat </td><td> 5-50 kat </td><td> &gt; 50 kat </td></tr></tbody></table> Tablo 2: WHO Antiviral Çalışma Grubu NA inhibitörlerine grip virüsü duyarlılık sınıflandırılması için kurallar önerilir. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Virüs tipi / alt tip / soy </td><td rowspan="2"> N- </td><td> Zanamivirin </td><td> oseltamivir </td><td> peramivir </td><td> Laninamivir </td></tr><tr><td> Medyan (aralık) nM IC50 </td><td> Medyan (aralık) nM IC50 </td><td> Medyan (aralık) nM IC50 </td><td> Medyan (aralık) nM IC50 </td></tr><tr><td> A (H1N1) pdm09 </td><td> 1326 </td><td> 0.42 (0,1-3,43) </td> &lt;td&gt; 0.36 (0,01-3,48) </td><td> 0.19 (0,07-1,60) </td><td> 0.55 (0,05-2,29) </td></tr><tr><td> A (H3N2) </td><td> 1654 </td><td> 0.9 (0,11-4,0) </td><td> 0.38 (0,01-3,65) </td><td> 0.33 (0,12-3,06) </td><td> 1.38 (0,01-9,38) </td></tr><tr><td> B Yamagata ve B Victoria </td><td> 1115 </td><td> 2,2 (1,24-10,72) </td><td> 15,12 (2.39-70.75) </td><td> 1.36 (0,57-6,67) </td><td> 2.89 (1,62-9,15) </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Normal inhibisyon medyan IC50 ve IC50 aralık 2015 (NI) virüsleri WHO CCRRI Melbourne, elde edilen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Amino asit ikamesi </td><td rowspan="2"> Tür / alt tip / soy </td><td colspan="4"> IC50 kat-değişimi komedyan IC50 değerleri referans mpared. </td></tr><tr><td> Zanamivirin </td><td> oseltamivir </td><td> peramivir </td><td> Laninamivir </td></tr><tr><td> H275Y </td><td> A (H1N1) pdm09 </td><td> 1 </td><td> 557 (HRI) </td><td> 123 (HRI) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> E119V </td><td> A (H3N2) </td><td> 1 </td><td> 63 (RI) </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> H134Y </td><td> B Victoria </td><td> 1 </td><td> 4 </td><td> 76 (HRI) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> N151T </td><td> B Victoria </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 42 (HRI) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> G104E </td><td> B Victoria </td><td> 1.220 (HRI) </td><td> 87 (HRI) </td><td> 17.724 (HRI) </td><td> 701 (HRI) </td></tr><tr><td> E105K </td><td> B Victoria </td><td> 3 </td><td> 5 (RI) </td><td> 59 (HRI) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> I222T </td><td> B Victoria </td><td> 2 </td><td> 7 (RI) </td><td> 8 (RI) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> H273Y </td><td> B Yamagata </td><td> 1 </td><td> 230 (HRI) </td><td> 377 (HRI) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> D197N </td><td> B Yamagata </td><td> 4 </td><td> 7 (RI) </td><td> 32 (RI) </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: düşük inhibisyon (RI) veya NA inhibitörlerine oldukça düşük inhibisyon (HRI) bağlanmış bir amino asit ikamelerinin temsili listesi. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sorun </td><td> Olası nedenler) </td><td> Çözüm (ler) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Hayır veya düşük NA etkinliği </td><td> Virüs, bu ya da düşük bir virüs verimi. </td><td> Klinik örnek hücre çizgileri kültürlenebilir (yani Madin Darby Köpek Böbrek hücreleri) veya embriyo halindeki tavuk yumurtalarının içinde olmalıdırNA engelleme tahlilinde kullanım için daha yüksek bir virüs yükü. </td></tr><tr><td> Bazı mutant virüsler yüksek virüs yükünde rağmen son derece düşük NA aktiviteye sahiptir. </td><td> Test için düzgün virüs konsantrasyonunu kullanın. Düşük bir pH tamponu (örneğin pH 5.3) kullanılabilir. Verileri karşılaştırırken Ancak, dikkatli alınmalıdır. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Resim veya NA engelleme tahlilinde düşük NA aktivitesi </td><td> Hiçbir virüs eklendi. </td><td> virüs yeniden seyreltin. virüs emin direkt olarak 1 x deney tamponu ilave edilir. </td></tr><tr><td> Yanlış virüs seyreltme kullanılmıştır. </td><td> NA aktivite deneyi tekrarlayın. </td></tr><tr><td> Yetersiz inkübasyon süresi. </td><td> İnkübasyon süresi sağlamak izlemektedir. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Veri noktaları, IC50 eğri dışında kalan </td><td rowspan="2"> daha yüksek bir konsantrasyonda NA inhibitörü çapraz kirlenme. </td><td> ipuçları NA inhibi ile temas halinde değildir emin oluntor 96 oyuklu bir plaka içerisinde seyreltilmiş virüs püskürtüldüğü zaman. </td></tr><tr><td> 8 derin kuyu deposu kullanılmışsa, atılır ve yeni bir 8 derin kuyu rezervuara inhibitör konsantrasyonu NA yeniden dağıtmak. </td></tr><tr><td> NA inhibitörü veya Munana veya seyreltilmiş virüs hacmi her bir kuyunun içine eşit eklenmedi. </td><td> bir kalibre edilmiş çok kanallı pipet ile tahlil tekrarlayın. her bir reaktifin eşit hacimde her bir kuyunun içine tevzi emin olun. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Olağandışı yüksek IC50 değerleri </td><td> virüs çok yüksek konsantrasyonu ilave edildi. </td><td> UA aktivite deneyi ve NA engelleme deneyi tekrarlayın. </td></tr><tr><td> Deney örneği grip A ve grip B&#39;ye karışımlarını ihtiva </td><td> Virüs karışımlarının varlığı tespit etmek real-time PCR gerçekleştirin. </td></tr><tr><td> numunedeki Bakteriyel kontaminasyon </td><td> antibiyotik varlığında ile steril bir durumda kültür virüsü. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Yüksek eşiğe sinyali </td><td> Munana alt-tabaka zaman içinde bozulabilir. </td><td> Munana alt-tabakanın yeni toplu kullanın. </td></tr><tr><td> komşu kuyu floresans saptama. </td><td> siyah 96-gözlü düz dipli plakalar kullanın </td></tr></tbody></table> Tablo 5: NA engelleme tahlilinde potansiyel sorunlar için sorun giderme.

Biz antivirallerin nöraminidaz inhibitörü sınıfına influenza A ve B virüsleri duyarlılığını değerlendirmek için bir fenotipik flüoresan bazlı nöraminidaz inhibisyonu deneyi kullanılmasını tarif eder.

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Bu metodolojinin genel amacı, floresan tabanlı bir analiz kullanarak influenza A ve B virüslerinin nöraminidaz inhibitörlerine karşı duyarlılığını değerlendirmektir. Bu yöntem, bir influenza virüsünün antiviral nöraminidaz inhibitörü sınıfına karşı dirençli mi yoksa duyarlı mı olduğunu belirlemeye yardımcı olabilir. Analizin temel prensibi, nöraminidaz inhibitörü antiviralin nöraminidaz enzim aktivitesinin işleyişini engelleyip engellemediğini görmektir.Antiviral duyarlılık testi öncesinde, virüs ya MDCK hücreleri gibi hücre kültürlerinde pasajlanarak ya da embriyonize tavuk yumurtalarında yüksek viral titreye kadar büyütülmelidir. Bu gösterimde, H1N1 ve H3N2 alt tiplerine ait canlı influenza A virüslerini kullanacağım. 96 kuyucuklu U tabanlı bir plaka ile başlayarak, birinci sütundaki her bir kuyucuğa 120 µL seyreltilmemiş kültürlenmiş influenza virüsü dağıtın.Kalan 11 kolona %0,1 NP40 içeren 60 µL bir kat assay tamponu ekleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 12. kolonu yalnızca bir kat assay tamponu içeren bir boş kontrol olarak bırakacak şekilde, plaka boyunca seri olarak iki tam dilüsyon gerçekleştirin. Her bir kuyucuktan 50 µL'yi şeffaf 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakaya aktarın.Her kuyucuğa 300 micromolar MUNANA'dan 50 microliters ekleyin. Ardından, karıştırmak için plakaya hafifçe vurun. Evaporasyonu önlemek için plakayı bir plaka kapatıcı ile kapatın.Plakayı 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Reaksiyonu sonlandırmak için her kuyucuğa 100 µL durdurma çözeltisi ekleyin. Ardından, karıştırmak için plağa hafifçe vurun.Plakayı okumak için bir florometre kullanın. Ardından, metin protokolüne uygun olarak RFU'nun virüs dilüsyonlarına karşı grafiğini çizdikten sonra, virüs NA aktivite eğrilerinin doğrusal bölümünün orta noktasını seçmek için optimal hedef sinyali bir referans noktası olarak kullanarak, virüslerin NA inhibitörlerine olan duyarlılığını değerlendirmek için uygun virüs konsantrasyonunu belirleyin. 300 micromolar zanamivir hazırlamak için, beş miligram zanamiviri 50 mililitre iki katlı assay tamponunda çözün.5,8 miligram oseltamivir karboksilatı 50 mililitre iki kat assay tamponu içinde çözerek 300 mikromolar oseltamivir karboksilat hazırlayın. 300 mikromolar stok konsantrasyonu için 5,7 miligram peramivir trihidratı 50 mililitre iki kat assay tamponunda çözün. Ardından, 5,2 miligramı 50 mililitre iki kat assay tamponunda çözerek 300 mikromolar laninamivir hazırlayın.Ana stoklardan, NA inhibitörlerinin on katlık dilüsyonlarından oluşan çalışma stoklarını, aşağıdaki konsantrasyonlarda 50 mililitrelik santrifüj tüplerinde hazırlayın. NA inhibitör konsantrasyonları serisi hazırlanırken dikkatli olunmalıdır. NA inhibitör konsantrasyonlarındaki herhangi bir düzensizlik, inhibisyon eğrilerinde belirgin hale gelecektir.Bu videonun önceki kısımlarında belirlenen NA aktivitesine dayalı virüs dilüsyonlarını kullanarak, 96 derin kuyucuklu bir blok içerisinde %0,1 NP40 sürfaktan içeren bir katlı analiz tamponu ile iki mililitre virüs dilüsyonu hazırlayın. Virüsü dilüye ederken, doğrudan bir katlı analiz tamponuna eklendiğinden emin olun. Bu durum, özellikle virüs hacminin çok düşük olduğu durumlarda kritik öneme sahiptir.Gerekli hacimdeki NA inhibitörlerini sekiz derin kuyucuklu bir rezervuara dağıtın. Ardından, sıfırdan 30,000 nanomolar'a kadar farklı dilüsyonlarda 50 mikrolitre NA inhibitörü dağıtın. Birinci sütundan 11. sütuna kadar her kuyucuğa 50 mikrolitre dilüe edilmiş test virüsü ekleyin.Ve 12. kolona kuyuk başına 50 µL 1x assay buffer ekleyin. Karıştırmak için plakaya hafifçe vurun ve buharlaşmayı önlemek için üzerini kapatın. Ardından plakayı oda sıcaklığında 45 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyonu takiben, her kuyucuğa 50 µL 300 µM MUNANA ekleyin. Ardından, karıştırmak için plakaya hafifçe vurun ve plakayı kapatın. Plakayı 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.Her kuyucuğa 100 µL durdurma çözeltisi ekleyin. Karıştırmak için plakayı hafifçe vurun. Ardından, plakayı okumak için bir florometre kullanın.IC50 değerlerini hesaplamak için, florometre tarafından verilen ham verileri A1 hücresinden başlayarak 12 sütunlu plaka formatındaki bir hesap tablosuna kopyalayıp yapıştırın. Uyumlama yazılımını açın ve deney sekmesine tıklayın. Alternative 2-drug Fluoro 11 Samples seçeneğini belirleyin. Seçenekler sekmesine tıklayın ve Grafikleri Oluştur kutucuğunu işaretleyin.Seçeneklere tekrar tıklayın ve Yeni Anahtar sekmesini seçin. Ardından inhibisyon anahtarı SEV dosyasını, ham veri hesap çizelgesi dosyasıyla aynı klasöre kaydedin. inhibition_key dosyasında, ID'nin altına tüm örnek isimlerini listeleyin. Eğer dört NA inhibitörü test edildiyse, oseltamivir'in altına iki ek satır için boşluk bırakın ve peramivir ile laninamivir'i yazın.inhibition_key dosyası üzerinde yapılan değişiklikleri kaydedin. jasprv1.2 Inhibition Curve Fitting penceresine geri dönün ve ham veri dosyasını deney dosyası, inhibition_key dosyasını ise anahtar dosya olarak seçin.Analizi çalıştırın. Ardından, sonuçları CSV ve PDF formatlarında kaydedin. Yazılım tarafından oluşturulan IS50 değerlerini ve eğri şekillerini inceleyin.Tüm veri noktaları eğrinin üzerinde veya eğriye yakın olmalıdır. Eğer böyle değilse, NA inhibisyon testi tekrarlanmalıdır. Bu inhibisyon eğrisinde gösterildiği gibi, A(H1N1)pdn09 virüsü A/Perth/82/2015 için artan NA inhibitörü konsantrasyonuna karşı floresans değeri grafiğe dökülmüştür.Burada IC50 belirtilmiştir. IC50 değerinin medyan ile karşılaştırılmasıyla test virüslerine normal inhibisyon, azalmış inhibisyon veya oldukça azalmış inhibisyon sonucu atanır. Medyan IC50 değerleri, her laboratuvarda normal inhibisyona sahip virüslerin test edilmesiyle elde edilen veriler kullanılarak türetilmelidir.Melbourne'daki DSÖ Grip İş Birliği Merkezi'nde ilgili türler ve alt türler için belirlenen medyan IC50 değerlerine bir örnek. İnfluenza A virüsleri için normal inhibisyon virüsleri, ilgili alt türleri için referans medyan IC50 değerine kıyasla 10 katından daha düşük IC50 değerine sahip olanlardır. Azalmış inhibisyon virüsleri ise, ilgili alt türleri için referans medyan IC50 değerinin 10 ile 100 katı arasında IC50 değerlerine sahip olanlardır.Çok düşük inhibisyonlu virüsler, referans medyan IC50 değerinin 100 kat üzerinde IC50 değerlerine sahiptir. İnfluenza B türleri için, normal inhibisyonlu virüsler referans medyan IC50 ile karşılaştırıldığında beş kattan daha düşük IC50 değerlerine sahiptir. Düşük inhibisyonlu virüsler beş ile 50 kat arasında yer alır ve HRI virüsleri referans medyan IC50 değerinin 50 kat üzerinde değerlere sahiptir.Bu tablo, son beş yıl içinde tespit edilen ve nöraminidaz inhibitörlerine karşı azalmış inhibisyon sağlayan NA amino asit substitüsyonlarının bir listesini sunmaktadır. Bu videoda gösterilen floresan tabanlı NA inhibisyon testi, oldukça sağlam ve tekrarlanabilir bir testtir. Bu videoyu izledikten ve protokolü okuduktan sonra, influenza virüslerinin antivirallerin nöraminidaz inhibitörü sınıfına olan duyarlılığının nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

fluorescence-based-neuraminidase-inhibition-assay-to-assess

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Sialidase testi canlı makrofaj hücre yüzeyinde reseptör düzeyinde iltihabi hastalıklar mikrobik enfeksiyonlar ve katılımı TLR sensörleri yeni moleküler mekanizma (lar) aydınlatmak basit bir teknik yaklaşım.

Toll-like reseptör Etkinleştirme Düzenlenmesi Neu1 Sialidase Faaliyet Algılama

En korunmuş dizileri biyoinformatik analizleri ile tespit hedefleyen evrensel bir antikor kullanarak influenza virüs hemaglutinin ve nöraminidaz miktarının tayini için basit bir yuva blot yöntemi geliştirilmiştir. Bu yenilikçi yaklaşım, tüm viral hemaglutinin ve nöraminidaz kantitatif tayini için kullanışlı bir alternatif sunabilir.

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Bu yöntem, yüksek hassasiyet enfekte olmuş fareler bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısında H1N1 tespiti için Kızılötesi boya temelli görüntüleme sisteminin kullanımı açıklanmaktadır. Bu metodoloji, bir 96 veya plaka 384-iyi, test malzemesi &lt;10 ul hacmi gerektirir ve birden fazla patojenlerin eşzamanlı tarama için bir potansiyele sahiptir.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Video, influenza virüsleri A ve B'yi ölçmek için bir testi göstermektedir. Bu test, influenzaya özgü primerler ile çentikli endonükleaz amplifikasyonunu ve moleküler işaret probları kullanılarak hedef tespitini kullanır.

İnfluenza A ve B Virüslerini Ölçmek için Moleküler Bazlı Bir Test

Bu video, bir serum örneğinde influenza nöraminidaz (NA) inhibe eden antikor titrelerini ölçen bir testi göstermektedir. NA'ya karşı antikorlar içeren bir serum örneği, fetuin kaplı bir mikrokuyu plakasına eklenir. Virüs eklendikten sonra, antikorlar viral NA'nın fetuini parçalamasını ve galaktoz kısmını açığa çıkarmasını önler. Daha sonra, açıkta kalan galaktoza bağlanan peroksidaz konjuge bir lektin eklenir. NA-inhibe edici antikor titresi, bir peroksidaz substratının, renk üretmek için...

İnfluenza Nöraminidaz İnhibisyonu Antikor Titrelerini Ölçmek İçin Bir Test

Basılı bir glikan mikrodizi stratejisi kullanılarak, influenza A virüsü hemaglutinin aviditesi ve sialik asit içeren reseptörler için özgüllüğünün analizi için geleneksel bir 96 oyuklu plaka testi minyatürleştirildi.

Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi

Biz moleküler temelli İnfluenza A, hızlı ve B tahlil açıklar. Grip deneyi moleküler işaret probları ile hedef tespiti ve ardından influenzaya spesifik primerler ile izotermal amplifikasyon kullanılarak 15 dakika içinde her bir hedef tespit eder. Grip A ve B tahlil kullanıcı dostu ve gerçekleştirmek için en az eller-zaman gerekli.

Hızlı moleküler algılama ve Nezle Virüsleri A ve B farklılaşması

Serumlarda influenza nöraminidaz (NA)-inhibisyon antikor titrelerini ölçmek için enzime bağlı lektin testini (ELLA) tarif ediyoruz. Tahlil, NA'nın fetuin kaplı, 96 oyuklu plakalardan sialik asidi çıkardığında erişilebilir hale gelen galaktoz kalıntılarını ölçmek için fıstık aglütinini kullanır.

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Bu çalışma, bir açıklar   görüntüleme bazlı mikro-nötralizasyon deneyi virüsler arasında antijenik ilişkileri analiz etmek. protokol düz yataklı tarayıcı kullanır ve titrasyon, titrasyon kantitatif, nötralizasyon ve nötralizasyon kantitatif olmak üzere dört adım vardır. Tahlil akımı dolaşan grip A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B virüsleri ile iyi çalışır.

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

Grip nötralize antikorlar grip enfeksiyonlar korunması ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Microneutralization deneyleri insan sera nötralize antikor ölçmek ve sık sık grip insan seroloji için kullanılır. Biz bir microneutralization tahlil nötralize antikor titreleri çağdaş 3C.2a ve 3C.3a A(H3N2) virüs grip aşısı ya da enfeksiyon takip için ölçmek için MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak açıklar.

MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi

Burada, enfekte hücrelerin elektriksel empedansının gerçek zamanlı izlenmesi kullanılarak enfeksiyöz viral parçacıkların ölçülmesi için bir protokol bildirilmektedir. Bu yöntemin pratik bir uygulaması, influenza A virüs çürümesinin çevresel koşulları taklit eden farklı fizikokimyasal parametreler altında ölçülmesiyle sunulmaktadır.

Gerçek Zamanlı Hücre Analizi Kullanarak Konak Dışında Influenza Virüsünün Hayatta Kalmasını İzleme

Öğrenin floresans tabanlı nöraminidaz inhibisyonu testiyle influenza A ve B virüslerinin antivirallere duyarlılığını değerlendirmeyi. Bu yöntem dirençli ve hassas suşları ayırt ederek etkili tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir (Video) | JoVE Journal

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

Daha fazla video keşfet