Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

Bu metodolojinin genel amacı, floresan bazlı bir test kullanarak influenza A ve B virüslerinin nöraminidaz inhibitörlerine duyarlılığını değerlendirmektir. Bu yöntem, bir influenza virüsünün nöraminidaz inhibitörü sınıfı antivirallere dirençli veya duyarlı olup olmadığını belirlemeye yardımcı olabilir. Testin ana prensibi, nöraminidaz inhibitörü antiviralin nöraminidaz enzim aktivitesinin etkisini bloke edip etmediğini görmektir.

Antiviral duyarlılık testinden önce, virüsün MDCK hücreleri gibi hücre kültürlerinde veya embriyonatlı tavuk yumurtalarında geçirilerek yüksek viral titreye büyütülmesi gerekir. Bu gösterimde, H1N1 ve H3N2 alt tiplerinin canlı influenza A virüslerini kullanacağım. 96 oyuklu U alt plakadan başlayarak, seyreltilmemiş kültürlenmiş influenza virüslerinin oyuğu başına 120 mikrolitreyi birinci sütuna dağıtın.

Ve kalan 11 sütuna% 0.1 NP40 içeren 60 mikrolitre bir kez tahlil tamponu. Çok kanallı bir pipet kullanarak, plaka boyunca seri olarak iki tam seyreltme gerçekleştirin ve sütun 12'yi yalnızca bir kez tahlil tamponu içeren bir boşluk olarak bırakın. Kuyucukların her birinden 50 mikrolitreyi net bir 96 kuyulu düz taban plakasına aktarın.

Kuyucuk başına 50 mikrolitre 300 mikromolar MUNANA ekleyin. Ve karıştırmak için plakaya hafifçe vurun. Ardından, buharlaşmayı önlemek için plakayı kaplamak için bir plaka kapatıcı kullanın.

Ve plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Reaksiyonu sonlandırmak için oyuk başına 100 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin. Ve karıştırmak için plakaya hafifçe vurun.

Plakayı okumak için bir florometre kullanın. Daha sonra, metin protokolüne göre virüs seyreltmelerine karşı bir RFU grafiği çizdikten sonra, virüs NA aktivite eğrilerinin doğrusal bölümünün orta noktasını seçmek için referans noktası olarak optimal hedef sinyali kullanarak NA inhibitörlerine karşı viral duyarlılığı değerlendirmek için uygun virüs konsantrasyonunu belirleyin. Amivirde 300 mikromolar hazırlamak için, beş miligram zanamiviri 50 mililitre iki kez tahlil tamponunda çözün.

5.8 miligram oseltamivir karboksilatı 50 mililitre iki kez tahlil tamponunda çözerek 300 mikromolar oseltamivir karboksilat hazırlayın. 5.7 miligram peramivir trihidratı 50 mililitrede 300 mikromolar stok konsantrasyonu için iki kez tahlil tamponunda çözün. Daha sonra 5.2 miligramı 50 mililitrede iki kez tahlil tamponunda çözerek 300 mikromolar laninamivir hazırlayın.

Ana stoklardan, aşağıdaki konsantrasyonlara sahip 50 mililitrelik santrifüj tüplerinde NA inhibitörlerinin on kat seyreltilmesinin çalışma stoklarını hazırlayın. NA inhibitörlerinin konsantrasyon serisini hazırlarken dikkat edilmelidir. NA inhibitör konsantrasyonlarındaki herhangi bir düzensizlik, inhibisyon eğrilerinde belirgin olacaktır.

Bu videoda daha önce belirlendiği gibi NA aktivitesine dayalı virüs seyreltmelerini kullanarak, 96 derinliğinde bir kuyu bloğunda% 0.1 NP40 yüzey aktif madde içeren tek seferlik test tamponunda iki mililitre virüs seyreltmesi hazırlayın. Virüsü seyreltirken, doğrudan tek seferlik tahlil tamponuna eklendiğinden emin olun. Bu, özellikle virüs hacmi çok düşük olduğunda çok önemlidir.

Gerekli miktarda NA inhibitörünü sekiz derinliğinde bir kuyu rezervuarına dağıtın. Daha sonra sıfır ila 30.000 nanomolar arasında değişen seyreltmelerde 50 mikrolitre NA inhibitörü dağıtın. Birinci ila 11 arasındaki sütunlara oyuk başına 50 mikrolitre seyreltilmiş test virüsü ekleyin.

Ve bir kerelik tahlil tamponunun kuyusu başına 50 mikrolitre sütun 12'ye. Buharlaşmayı önlemek için karıştırmak ve üzerini kapatmak için plakaya hafifçe vurun. Daha sonra plakayı oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.

Kuluçkayı takiben, her oyuğa 50 mikrolitre 300 mikromolar MUNANA ekleyin. Ardından karıştırmak ve üzerini kapatmak için plakaya hafifçe vurun. Plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Her kuyucuğa 100 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin. Ve karıştırmak için plakaya hafifçe vurun. Ardından plakayı okumak için bir florometre kullanın.

IC50 değerlerini hesaplamak için, florometre tarafından çıkan ham verileri kopyalayıp A12 hücresinden başlayarak 1 sütunlu plaka biçimindeki bir elektronik tabloya yapıştırın. Uygulama yazılımını açın ve deney sekmesine tıklayın. Alternatif 2 ilaçlı Floro 11 Örneklerini seçin. Seçenekler sekmesine tıklayın ve Grafik Oluştur'u işaretleyin.

Seçeneklere tekrar tıklayın ve Yeni Anahtar sekmesini seçin. Ardından, engelleme anahtarı SEV dosyasını ham veri elektronik tablosu dosyasıyla aynı klasöre kaydedin. inhibition_key Dört NA inhibitörü test edildiyse, oseltamivir'in altına iki ek satır için boşluk ekleyin ve peramivir ve laninamivir yazın.

inhibition_key dosyasında yapılan değişiklikleri kaydedin. jasprv1.2 İnhibisyon Eğrisi Uydurma penceresine dönün ve deney dosyası olarak ham veri dosyasını seçin. Ve inhibition_key anahtar dosya olarak.

Analizi çalıştırın. Ardından sonuçları CSV ve PDF formatlarında kaydedin. Yazılım tarafından oluşturulan IS50 değerlerini ve eğri şekillerini inceleyin.

Tüm veri noktaları eğrinin üzerine veya eğrisine yakın olmalıdır. Aksi takdirde, NA inhibisyon testini tekrarlayın. Bu inhibisyon eğrisinde gösterildiği gibi, artan NA inhibitörü konsantrasyonuna karşı floresan, bir A (H1N1) pdn09 virüsü, A / Perth / 82/2015 için çizilmiştir.

IC50 burada belirtilmiştir. Normal inhibisyon, azalmış inhibisyon veya yüksek oranda azaltılmış inhibisyonun bir sonucu, IC50'nin medyan ile karşılaştırılmasıyla test virüslerine atanır. Medyan IC50 değerleri, normal inhibisyona sahip virüslerin test edilmesinden elde edilen veriler kullanılarak her laboratuvarda türetilmelidir.

Ve ilgili türler ve alt tipler için Melbourne'deki DSÖ Grip İşbirliği Merkezi'nde belirlenen medyan IC50 değerleri örneği. İnfluenza A virüsleri için, normal inhibisyon virüsleri, ilgili alt tipleri için referans medyan IC50'ye kıyasla IC50 değerleri 10 kattan daha az olan virüslerdir. İndirgenmiş inhibisyon virüsleri, kendi alt tipleri için referans medyan IC50'nin 10 ila 100 kat üzerinde IC50 değerlerine sahip olanlardır.

Yüksek oranda azaltılmış inhibisyon virüsleri, referans medyan IC50'nin 100 kat üzerinde IC50 değerlerine sahiptir. İnfluenza B'ler için, normal inhibisyon virüsleri, referans medyan IC50'ye kıyasla beş kattan daha az IC50 değerlerine sahiptir. İndirgenmiş inhibisyon virüsleri beş ila 50 kat arasındadır ve HRI virüsleri, referans medyan IC50'nin 50 kat üzerinde değerlere sahiptir.

Bu tablo, nöraminidaz inhibitörlerine azalmış inhibisyon sağlayan son beş yılda tespit edilen NA amino asit ikamelerinin bir listesini sunmaktadır. Bu videoda gösterilen floresan bazlı NA inhibisyon testi, oldukça sağlam ve tekrarlanabilir bir testtir. Bu videoyu izledikten ve protokolü okuduktan sonra, influenza virüslerinin nöraminidaz inhibitörü antiviral sınıfına duyarlılığını nasıl belirleyeceğinizi iyi anlamalısınız.