Birliğin Rekombinant Protein Ekspresyonu, Kristalleştirilmesi ve Biyofiziksel Araştırmaları

Bu prosedürün genel amacı, protein x-ışını kristalografisi veya enzimatik kinetik gibi biyofiziksel kimyasal çalışmaları kolaylaştırmak için patojen olmayan bakterilerden rekombinant protein hazırlamaktır. Bu yöntem, ön biyofiziksel karakterizasyon için patojen olmayan bakteriler kullanılarak ilgili rekombinant proteinin nasıl hazırlanacağına dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilgili proteinin biyofiziksel karakterizasyonunun, hücre kültürü inkübatörleri ve spektrofotometreler gibi yaygın cihazlarla donatılmış herhangi bir laboratuvarda gerçekleştirilebilmesidir.

Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği şekilde ligasyon reaksiyonunu hazırlayın. Hazırlanan ligasyon reaksiyonundan 3 µL miktarını, 50 µL kimyasal kompetan E.coli DH5 alpha hücreleri içeren bir tüpe pipetleyin. Bir pipet kullanarak çözeltiyi nazikçe karıştırın.

Çözeltiyi 30 dakika boyunca buzda bekletin. Ardından, 42 °C'de 45 saniye boyunca ısı şoku uygulayın. Bunun ardından, bir mililitre LB besiyeri ekleyin ve hücreleri 37 °C'de, dakikada 250 devirle şiddetli şekilde çalkalayarak 45 dakika boyunca büyütün.

Transform edilmiş hücrelerin 100 µL'sini, mililitre başına 100 µg kanamisin eklenmiş bir LB agar plağına yayın. 37 °C'de 18 saat boyunca inkübe edin. Steril bir uç kullanarak plaktaki kolonileri seçin.

Hücreleri, 18 °C'de, dakikada 250 rotasyonla şiddetli çalkalamayla, takviye edilmiş 3 ml LB besiyerinde 18 saat boyunca büyütün. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi plazmid DNA'sını hazırlayın ve nükleotid dizilimini doğrulayın. E.coli BL21 suşunu yeniden transforme ettikten sonra, steril bir uç kullanarak bir koloni seçin ve 150 µg/ml kanamisin içeren 10 ml LB besiyerine inoküle edin.

250 devir/dakika hızında güçlü çalkalama ile 37 °C'de 18 saat boyunca inkübe edin. Ardından, 10 mL gece boyu kültürü, bir litre LB ve kanamisinli ortama aktarın. 600 nanometredeki optik yoğunluk 0,7'ye ulaşana kadar 37 °C'de büyütün.

Ardından kültürü 15 dakika boyunca buzlu suya daldırın. Kültüre, final konsantrasyonu 1 mM olacak şekilde IPTG ekleyin. 18 °C'de 16 ila 18 saat daha inkübe edin.

Bundan sonra, 4 °C'de 30 dakika boyunca 5.000 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. Hücreleri 10 mM imidazol içeren 50 µL PBS içinde yeniden süspanse edin.

Ardından, metin protokolünde detaylandırıldığı üzere hücreleri buz üzerinde iki kez lize edin. Hücre lizatını temizlemek için 4 °C'de 30 dakika boyunca 25,000 ×g'de santrifüjleyin. Daha sonra, 50 mL'lik konik bir tüpte üç mL nikel boncuk ve 10 mM imidazol içeren 47 mL PBS'yi karıştırın.

2,5 x 10 cm'lik bir cam kromatografi kolonuna yerleştirilen dengelenmiş boncukların çökmesi için yerçekimi akışıyla ekstra tampon çözelti ekleyin. Süpernatantı bir pipet kullanarak kolona aktarın. 20 rpm hızındaki bir döner çark üzerinde, dört °C'de iki saat boyunca inkübe edin.

Bundan sonra, süpernatanın yer çekimi ile süzülmesini bekleyin. Nikel boncukları, her yıkama için 10 millimolar imidazol içeren 100 mililitre PBS kullanarak üç kez yıkayın. Ardından, RBC 1531 proteinini elüe etmek için 250 millimolar imidazol içeren beş mililitre PBS uygulayın.

Metin protokolünde belirtildiği şekilde, elüsyonun 15 µL'sini SDS Page ile analiz edin. Toplanan fraksiyonları bir diyaliz tüpüne pipetleyin. Tüpü, dört °C'de, dört litre trombin kesimi uyumlu tampon içeren bir behere gece boyunca yerleştirin.

Ertesi gün, fraksiyonları 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için bir pipet kullanın. Metin protokolünde belirtildiği şekilde, protein konsantrasyonunu tahmin etmek için 280 nanometrede absorbansı ölçün. Ardından, 50 mikrolitre RBC 1531 proteinini birkaç tüpe aktarın.

Her tüpe farklı miktarlarda trombin ekleyin ve 20 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Gerekli olan en düşük trombin miktarı belirlendikten sonra, 15 mL'lik bir tüpe 10 mg protein ve 60 ünite trombin ekleyin. 20 °C'de üç saat boyunca inkübe edin.

Ardından, trombin ile sindirilmiş proteini bir santrifüj filtre tüpüne aktarın. Hacmi beş mililitrenin altına düşürmek için dört santigrat derecede 3,000 ×g hızında santrifüjleyin. Bundan sonra, konsantre edilen proteini hazırlanmış bir boyut dışlama kromatografisi kolonuna uygulayın.

Tüp başına 0.5 mililitre olacak şekilde 60 elüsat fraksiyonu toplayın. Metin protokolünde belirtildiği üzere, her fraksiyondan 15 mikrolitreyi %15'lik bir SDS Page jelinde yürütün. Ardından, RBC 1531 proteinini içeren fraksiyonları birleştirin.

Başlamak için birleştirilmiş fraksiyonları bir santrifüj filtre tüpüne aktarın. Proteini yaklaşık 18.5 mg/mL konsantrasyona getirmek için 4 °C'de 3,000 ×g'de santrifüjleyin. Ardından, 96 kuyucuklu bir oturan damla kristalizasyon plakasının kuyucuklarına her bir kristalizasyon tarama solüsyonundan 50 µL ekleyin.

Oturtma tabanına 0.5 µL konsantre protein çözeltisi ekleyin. Protein çözeltisini 0.5 µL kuyucuk çözeltisi ile ayrı olarak karıştırın. Plakayı şeffaf yapışkan filmle kapatın.

18 °C'de inkübe edin ve buhar difüzyonuna izin verin. Kristal oluşumunu iki ila üç hafta boyunca günlük olarak izlemek için damlaları bir ışık mikroskobu kullanarak 20 ila 40 kat büyütmede tarayın. NTP substratlarını hazırladıktan sonra her birini 96 kuyucuklu bir plakaya ekleyin.

Karıştırmak için bir pipet kullanarak her kuyucuğa 20 µg RBC 1531 proteini ekleyin. Plakanın kapağını kapatın ve 30 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin. Ardından, RBC 1531 aracılı katalitik reaksiyonları durdurmak için plakayı 15 dakika boyunca 70 °C'lik bir su banyosuna aktarın.

Ardından, her bir kuyucuğa bir microliter S.cerevisiae inorganik pirofosfataz ekleyin. 20 degrees Celsius'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, rengin gelişmesi için reaksiyon plakasına 16 microliter molibdat asit çözeltisi ekleyin.

15 dakika sonra, 690 nanometredeki optik yoğunluğu okuyun. Bu çalışmada, B serisi BC1531 geninin protein ürünü moleküler düzeyde karakterize edilmektedir. Nikel afinite kromatografisi ile saflaştırmanın ardından bir trombin sindirim deneyi gerçekleştirilir.

RBC 1531'den afinite etiketini tamamen uzaklaştırmak için gereken en düşük miktarın 0,3 ünite trombin olduğu görülmüştür. Sindirim sonrası, etiketten arındırılmış protein, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak yaklaşık %99 saflıkta saflaştırılır. Ardından, oligomerik durum boyut dışlama kromatografisi ile tahmin edilir.

RBC 1531 yaklaşık 84 mililitrede elüye olduğu için moleküler ağırlığının 55 kilodalton olduğu tahmin edilmektedir. Monomerin hesaplanan moleküler ağırlığı yaklaşık 13 kilodaltondur. Bu nedenle, RBC 1531 bir tetramer olarak birleşmektedir.

Ardından, oturan damla buhar difüzyon yöntemi kullanılarak kristalleşme taraması gerçekleştirilir. Bir molar sodyum sitrat ve %20 polietilen glikol 3.000 ile ayrıca 0,1 molar sodyum kakodilat ve bir molar sodyum sitrat ile iki gün sonra kristaller görülür. Bunun ardından NTPaz aktivitesi belirlenir.

RBC 1531 aracılı hidroliz reaksiyonuna molibdat eklendikten sonra görünür bir renk değişimi gözlemlenmez. Ancak, pirofosfataz eklendiğinde rengin koyu maviye döndüğü görülür. Ardından, 690 nanometredeki optik yoğunluk ve NTP konsantrasyonu doğrusal olmayan regresyon kullanılarak analiz edilir.

RBC 1531 enziminin maksimum hızının 0,75 ve Michaelis sabitinin 10 micromolar olduğu belirlenmiştir. Bu prosedür uygulanırken, protein örneklerinin gecikmeksizin hazırlanması ve protein kristalleşmesini engelleyen veya enzimatik analizlerde hatalara yol açan herhangi bir safsızlık içeren fraksiyonların atılması önemlidir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, enzimoloji ve diğer protein bilimi alanındaki araştırmacıların, çoğu laboratuvarda bulunan spektrofotometreler ile ilgilendikleri proteinleri karakterize etmelerinin yolunu açmıştır.

Bu yöntem, rekombinant protein hazırlama, kristalizasyon taramaları ve enzimatik kinetik hakkındaki genel fikirler konusunda bilgi sağlayabilse de, ilgilendiğimiz diğer proteinlerin biyofiziksel kimyasal analizlerine de uygulanabilir. Proteinler son derece kararsız olabileceğinden, onlarla çalışırken dikkatli olmayı unutmayın. Numuneleri buz üzerinde tutmak ve uzun süreli saklama için -80 derecede dondurmak gibi önlemler gereklidir.

Bu videoyu izledikten sonra, X-ışını kristalografisi ile yapı tayini için protein kristalleri elde etmek amacıyla patojenik olmayan bakterilerden rekombinant proteinin nasıl hazırlandığını ve kolorimetrik bir yöntem kullanılarak enzimatik aktivitenin nasıl karakterize edileceğini iyi bir şekilde kavramış olmanız gerekir.