Name: Birliğin Rekombinant Protein Ekspresyonu, Kristalleştirilmesi ve Biyofiziksel Araştırmaları Bacillus - Konserve Nükleotid Pyrophosphorylase, BcMazG (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Öğrenin, patojen olmayan bakterilerden rekombinant protein hazırlama ve biyofiziksel karakterizasyon yöntemlerini. Bacillus cereus kullanarak güvenli protein kristalizasyonu ve enzimatik kinetik çalışmaları yapın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

X-ışını kırınımı veri setleri, Pohang Hızlandırıcı Laboratuvarının (Kore) kiriş çizgisi 7A&#39;da toplandı. Bu çalışma, Bilim Bakanlığı, BİT ve Gelecek Planlama (2015R1A1A01057574 - MH) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) aracılığıyla uygulanan Temel Bilim Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

1.RBC1531&#39;in Rekombinant Protein Üretimi ve Saflaştırılması <ol><li> Bir rekombinant BC1531 proteini (rBC1531) ekspresyon plazmidinin hazırlanması <ol><li> B. cereus&#39;un genomik DNA&#39;sını hazırlayın 10 . </li><li> Sırasıyla Bam HI ve Sal I kısıtlama enzimi siteleri oluşturmak için ileri ve geri primerler (Bkz. Malzeme Listesi) kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile B. cereus genomik DNA şablonundan bc1531 genini yükseltin 10 . </li><li> PCR ürününü ve değiştirilmiş bir pET49b vektörünü (pET49bm) Bam HI ve Sal I kullanarak tanımlayın ( 11) . </li><li> Söndürülen PCR ürününü ve vektörünü (adım 3&#39;te tarif edildiği gibi) bir 10 uL reaksiyonda T4 DNA ligaz kullanarak 1.1.3 adımından karıştırın. 18 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. </li><li> 50 μL kimya içine ligasyon reaksiyonu 3 mcL pipetleyinYetkili E. coli DH5α hücrelerini bir tüp içinde tutun. Pipetleme yaparak yavaşça karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde bırakın. 42 ° C&#39;de 45 sn ısı şoku. 1 mL Luria-Bertani (LB) ortamı ekleyin ve kuvvetli çalkantılar yaparken hücreleri büyütünüz (250 rpm, 37 ° C, 45 dak.). </li><li> Adım 1.1.6&#39;dan 100 μL dönüştürülmüş hücreleri alın ve bunları 100 μg / mL kanamisin (Kan) ile LB-agar plakalarına yayın. ~ 18 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Steril bir uç kullanarak koloniler seçin ve 100 μg / mL Kan ile 3 mL LB ortamında hücreleri büyütün; Çalkalayın (250 rpm, 37 ° C, 18 saat). </li><li> Plazmid DNA&#39;yı, açıklandığı gibi bir alkalin-SDS liziz yöntemi kullanarak hazırlayın. </li><li> DNA dizilemesi kullanılarak rBC1531-ekspresyon yapısının nükleotid dizisini doğrulayın 12 . </li></ol></li><li> RBC1531 proteinin aşırı ekspresyonu <ol><li> E. coli BL21 (DE3) suşunu rBC1531-exp ile yeniden transforme edinAşırı ekspresyon için aşamalar 1.1.5-1.1.6&#39;da tarif edildiği gibi hazırlama plazmiti. </li><li> Bir koloni seçin ve 50 μg / mL Kan (LB + Kan) içeren 10 mL LB ortamında büyütün; 37 ° C&#39;de 18 saat şiddetle çalkalayın. </li><li> 1 L LB + Kan ortamında gece boyunca 10 mL kültür inoküle edin ve OD 600 (600 nm&#39;de optik yoğunluk) ~ 0.7&#39;ye ulaşıncaya kadar 37 ° C&#39;de büyütün. </li><li> Sıcaklığı 18 ° C&#39;ye soğutmak için ~ 15 dakika boyunca buz soğuk suda kültür batırın ve rekombinant protein ekspresyonu için 1 mM nihai konsantrasyonda kültür izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ekleyin. Kültürü 18 ° C&#39;de ek bir 16-18 saat daha büyütün. </li></ol></li><li> RBC1531&#39;in saflaştırılması <ol><li> Hücreleri santrifüjle (5,000 xg, 4 ° C, 30 dakika) hasat edin. Hücreleri rahatsız etmeyecek şekilde süpernatanı dikkatle atın. Hücreleri, 10 mM imidazol içeren 50 mL fosfat tamponlu salin (PBS) solüsyonunda yeniden süspanse edin. </li><li> Hücre lizatlarının fazla ısınmasını önlemek için (saat: 2 dak. 30 s; devir sayısı: 5 s; devreden çıkma: 10 s; genlik:% 38), buz üzerinde sonikasyon ile hücreleri iki kez lize edin. </li><li> Santrifüjleme (~ 25.000 xg, 4 ° C, 30 dakika) ile hücre lisatını boşaltın. </li><li> Dengelenmiş nikel boncuklarını 2,5 x 10 cm&#39;lik bir cam kromatografi kolonuna yerleştirmek için, 3 mL nikel boncukları ve 10 mM imidazol ve yerçekimi akışı içeren 60 mL PBS&#39;yi ekstra tamponla karıştırın. </li><li> Süpernatantı adım 1.3.3&#39;ten önceden dengelenmiş nikel boncukları olan kolona aktarmak için pipet ve düşük devirde (~ 20 rpm) bir eğirme tekerleğinde 2 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Süpernatanın yerçekimi ile boşaltılmasına izin verin ve kolondaki nikel boncuklarını 10 mM imidazol ihtiva eden 100 mL PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> 250 mM imidazol içeren 4 x 5 mL PBS uygulayarak rBC1531 proteini elute edin. </li><li> Adım 1.3.7&#39;den 15 uL elüsyon alın ve% 15 SDS-PAGE&#39;de çalıştırın. Üzerinde protein bantları görselleştirmekCoomassie mavisi boyama 10 kullanarak jel. </li></ol></li><li> RBC1531 proteinin afinite etiketlerinin trombin proteoliziyle giderilmesi <ol><li> Fraksiyonları diyaliz tüpüne pipetleyin (molekül ağırlığı kesildi: 3 kDa) ve tüp, 4 L trombin bölünme-uyumlu tampon (20 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl ve 1.5 mM β-merkaptoetanol) içeren bir beher içine yerleştirin. Gece boyunca 4 ° C&#39;de. </li><li> Kesirleri pipetleyin ve konik bir boruya aktarın. </li><li> 280 nm&#39;de absorbansı ölçün ve tarif edildiği gibi rBC1531 protein konsantrasyonunu hesaplayın 13 . </li><li> 0.5 mL&#39;lik bir tüpte 50 μg rBC1531 alın ve çeşitli miktarlarda trombin ekleyin ( yani 2, 1, 0.6 ve 0.3 birim). N-terminal afinite etiketini parçalamak için gereken en düşük trombin miktarını belirlemek için rBC1531 ve trombin reaksiyonlarını 20 ° C&#39;de ~ 3 saat inkübe edin. </li><li> RBC1531 ve trombin reaksiyonlarını% 15SDS-PAGE ile yıkayın ve N-terminal afinite etiketini tamamen sindiren ve etiketsiz bir rBC1531 üreten en düşük trombin miktarını ( örn., 50 μg rBC1531 başına 0.3 ünite trombin) belirleyin. </li><li> 15 mL&#39;lik bir tüpe 10 mg rBC1531 proteini ve 60 ünite trombin ekleyin ve trombin-proteoliz reaksiyonu için ~ 3 saat boyunca 20 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Açıklanan moleküler ağırlıkların ve elüsyon hacimlerinin standart bir eğrisini hazırlamak için jel filtreleme standartlarını boyut dışlama kromatografısi (SEC) sütununa uygulayın 13 . </li><li> Adım 1.4.6&#39;dan trombin ile sindirilmiş rBC1531 proteinini bir santrifüj filtresi tüpüne (molekül ağırlığı kesilmiş: 3 kDa) yerleştirin ve 5 mL&#39;den daha düşük bir hacme indirgemek için 3 ° C&#39;de 4 ° C&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Konsantre rBC1531 proteinini SEC sütununa uygulayın ve tüp başına 0.5 mL içinde elüsyona uğramış 60 fraksiyon toplamayın 13 . </li><li> Her fraksiyonun 15 μL&#39;ini alın, onları% 15&#39;lik bir SDS-PAGE üzerinde çalıştırın ve stai10&#39;da tarif edildiği gibi, Coomassie boyama çözeltisi (% 0.15 (v / v) Coomassie parlak mavi,% 40 (v / v) metanol ve% 10 (v / v) glasiyal asetik asit) kullanılarak jel. </li><li> RBC1531 içeren fraksiyonları pipetleyin ve bir tüpe toplayın. </li></ol></li></ol> 2. rBC1531&#39;in Kristalizasyon Tarama ve Optimizasyonu <ol><li> RBC1531 protein kristalleşmesi için tarama koşulları <ol><li> Adım 1.4.8&#39;de tarif edildiği gibi, rBC1531&#39;i, adım 1.4.11&#39;den ~ 18.5 mg / mL&#39;ye kadar bir santrifüj filtresi tüpü kullanarak konsantre hale getirin. </li><li> Her kristalleştirme tarama solüsyonundan 50 μL (bkz. Bölüm 2.2) 14 , 96-gözlü oturma-damla kristalizasyon plakalarının oyuklarına ilave edin. Oturan bir yatağa 0.5 uL 18.5 mg / mL rBC1531 protein solüsyonu yerleştirin. Protein solüsyonunu 0.5 mL&#39;lik iyi çözeltiyle karıştırın, plakanın tamamı için işlemi tekrarlayın. </li><li> Plakayı açık yapışkan filmle örtün.96 oyuklu plakaları 18 ° C&#39;ye yerleştirin ve buhar difüzyonuna izin verin. </li><li> 2-3 hafta boyunca günlük olarak kristal oluşumunu izlemek için hafif bir mikroskop kullanarak damlaları 20-40X büyütmede tarayın. </li><li> Elde edilen rBC1531 protein kristallerini kullanarak X-ışını kırınım verilerini 12 toplayın. </li></ol></li><li> RBC1531 kristalleşme koşullarının optimizasyonu <ol><li> Seçilen başlangıç ​​kristalleştirme koşul solüsyonundan ( örn., 0.1 M sodyum cacodylate, pH 6.5 ve 1.0 M sodyum sitrat) 500 mcL hazırlayın ve oturma damlası için 24 gözlü bir kristalleştirme plakasını doldurun. </li><li> Bir oturma yatağına 0.5 μL 18.5 mg / mL rBC1531 protein solüsyonu ilave edin, 0.5 mL&#39;lik iyi çözeltiyle karıştırın ve plakayı açık yapışkan filmle hemen örtün. Plakayı 18 ° C&#39;ye yerleştirin. </li><li> Haftalık bir mikroskop altında kristal büyümesine bir hafta boyunca dikkat edin. </li><li> PH değerini değiştirerek çeşitli kristalleşme koşullarını optimize edin ( örn., PH 5.5-6.8) ve sodyum sitratın tuz konsantrasyonunu ( yani, 0.9-1.2 M) değiştirerek tekil kristaller elde edildi. ~ 1 hafta boyunca kristal büyümesini izleyin ve X-ışını kırınım verileri toplamak 12 . </li></ol></li></ol> 3. rBC1531&#39;in Nükleozid Trifosfataz (NTPaz) Aktivitesinin Karakterizasyonu <ol><li> İnorganik fosfat bağımlı kolorimetrik çalışmanın doğrulanması <ol><li> Bir pirofosfat (100 mM) stokunu hazırlayın ve reaksiyon tamponunun 200 mcL&#39;sinde (20 mM HEPES, pH 7.4; 150 mM) 0,1, 0.25, 0.5, 1.0, 5.0, 10, 50, 100 ve 250 mcM nihai konsantrasyonlarına kadar sulandırın. MM NaCI ve 2 mM MgCl2) ile yıkandı. İlk plakayı bir kontrol olarak kullanın (bu pirofosfataz içermez). İkinci plakanın, adım 3.1.2&#39;de belirtildiği gibi, bir çalışma plakası olarak pirofosfataz içerdiğinden emin olun. </li><li> 0.01 birim Saccharomyces cerevisiae inorganik pYrophosphatase (1 μL) çalışma plakasının çukurlarına bırakın ve 20 ° C&#39;de 30-60 dakika inkübe edin. </li><li> Molibden asit çözeltisini, 7: 3 oranında amonyum molibdat (% 0.86 v / v) ve askorbik asit (% 14 v / v) çözeltileri ile karıştırarak hazırlayın. Çalışma ve kontrol kuyularına molibdat asit çözeltisi 16 uL ekleyin ve 15 dakika bekleyin. </li><li> Optik yoğunluğu 690 nm&#39;de (OD 690 nm) okuyun . </li></ol></li><li> Kolorimetrik NTPaz tahlili <ol><li> 100 mM nükleozid trifosfat (NTP) substrat stoğu hazırlayın ve 180 uL tahlil tamponu (20 mM HEPES, 100 mM NEP) içinde beklenen konsantrasyona ( örn., 0, 0.2, 4.4, 11, 22, 44, 88 veya 132 uM) PH 7.4; 150 mM NaCI ve 2 mM MgCl2). </li><li> Adım 3.2.1&#39;den 20 μg rBC1531 (1.5 mM) ve NTP substratları, 96 oyuklu bir plakada 200 μL&#39;ye kadar reaksiyona ekleyin ve iyice karıştırmak için pipetleyin. Plakayı kapağı ile kapatın ve 30 dakika boyunca 37 ° C inkübatöre yerleştirin.Substrat hidrolizi reaksiyonu gerçekleştirmek için. </li><li> Plakayı 70 ° C su banyosuna aktarın ve rBC1531 aracılı katalitik reaksiyonları durdurmak için 15 dakika bekletin. </li><li> Reaksiyon plakasının her bir gözüne (adım 3.2.3&#39;ten) 0,01 ünite S. cerevisiae inorganik pirofosfataz (1 uL) ilave edin ve 20 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. Rengi (~ 15 dakika) geliştirmek için reaksiyon plakasına molibdat asit çözeltisi 16 uL ekleyin. OD 690nm&#39;de okuyun. </li><li> Michaelis-Menten denklemini kullanarak tarif edildiği gibi analiz edin 12 . </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ivanova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+Bacillus+cereus+and+comparative+analysis+with+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis.</a> Nature. 423, 87-91 (2003).</li>
<li>Spencer, R. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1769905/">Bacillus anthracis.</a> J Clin Pathol. 56, 182-187 (2003).</li>
<li>Deli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LmbE+proteins+from+Bacillus+cereus+are+de-N-acetylases+with+broad+substrate+specificity+and+are+highly+similar+to+proteins+in+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">LmbE proteins from Bacillus cereus are de-N-acetylases with broad substrate specificity and are highly similar to proteins in Bacillus anthracis.</a> FEBS J. 277, 2740-2753 (2010).</li>
<li>Gross, M., Marianovsky, I., Glaser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MazG+--+a+regulator+of+programmed+cell+death+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MazG -- a regulator of programmed cell death in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 59, 590-601 (2006).</li>
<li>Galperin, M. Y., Moroz, O. V., Wilson, K. S., Murzin, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((House+cleaning%2C+a+part+of+good+housekeeping%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">House cleaning, a part of good housekeeping.</a> Mol Microbiol. 59, 5-19 (2006).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+Escherichia+coli+MazG%2C+the+regulator+of+nutritional+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of Escherichia coli MazG, the regulator of nutritional stress response.</a> J Biol Chem. 283, 15232-15240 (2008).</li>
<li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimeric+dUTPases%2C+HisE%2C+and+MazG+belong+to+a+new+superfamily+of+all-alpha+NTP+pyrophosphohydrolases+with+potential+%26%2334%3Bhouse-cleaning%26%2334%3B+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dimeric dUTPases, HisE, and MazG belong to a new superfamily of all-alpha NTP pyrophosphohydrolases with potential &#34;house-cleaning&#34; functions.</a> J Mol Biol. 347, 243-255 (2005).</li>
<li>Robinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+house-cleaning+enzyme+encoded+within+an+integron+array%3A+1.8+A+crystal+structure+defines+a+new+MazG+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A putative house-cleaning enzyme encoded within an integron array: 1.8 A crystal structure defines a new MazG subtype.</a> Mol Microbiol. 66, 610-621 (2007).</li>
<li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+a+complex+of+Campylobacter+jejuni+dUTPase+with+substrate+analogue+sheds+light+on+the+mechanism+and+suggests+the+%26%2334%3Bbasic+module%26%2334%3B+for+dimeric+d%28C%2FU%29TPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of a complex of Campylobacter jejuni dUTPase with substrate analogue sheds light on the mechanism and suggests the &#34;basic module&#34; for dimeric d(C/U)TPases.</a> J Mol Biol. 342, 1583-1597 (2004).</li>
<li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.molecularcloning.com/">Molecular cloning: A laboratory Manual</a>. 1, John Inglis. (2012).</li>
<li>Brown, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+TA+%22Gene+cloning+an+introduction%22">Gene cloning an introduction</a>. , Chapman & Hall. (1986).</li>
<li>Kim, M. I., Hong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+Bacillus-conserved+MazG+protein%2C+a+nucleotide+pyrophosphohydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the Bacillus-conserved MazG protein, a nucleotide pyrophosphohydrolase.</a> Biochem Biophys Res Commun. 472, 237-242 (2016).</li>
<li>Sheehan, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSheehan%2C+D+%22Physical+biochemistry%3A+Principles+and+applications%22">Physical biochemistry: Principles and applications</a>. , A John Wiley & Sons. (2009).</li>
<li>Lesley, S. A., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+crystallization+at+the+joint+center+for+structural+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">Protein production and crystallization at the joint center for structural genomics.</a> J Struct Funct Genomics. 6, 71-79 (2005).</li>
<li>Jeon, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+characterization+of+bacterial+YpgQ+protein+reveals+a+metal-dependent+nucleotide+pyrophosphohydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical characterization of bacterial YpgQ protein reveals a metal-dependent nucleotide pyrophosphohydrolase.</a> J Struct Biol. 195, 113-122 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Gerçek patojenlerle ilgili çalışmalar, güvenlik kısıtlamaları ve düzenlemeleri nedeniyle sınırlıdır. Alternatif olarak, patojenler, evrimsel olarak ilişkili patojen olmayanlar veya daha az patojenik türler kullanılarak incelenebilir. ba1554 geni, B. anthracis'te kritik bir gen olarak kabul edilir. Neyse ki, klinik olmayan B. cereus'ta aynı gen mevcuttur.Bu nedenle, ciddi güvenlik endişeleri olmaksızın, rekombinant BC1531 proteini biyofiziksel ve enzimatik karakterizasyon için kullanılabilir. B...

Rekombinant protein ekspresyonu, sınırlı protein miktarı ve zararlı kontaminasyon gibi doğal protein kaynaklarıyla ilişkili problemlerin üstesinden gelmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, patojenik genler ve protein araştırmalarında ilave güvenlik önlemleri gerektirmeyen alternatif bir laboratuvar suşu kullanılabilir. Örneğin, Bacillus cereus , yakın evrimsel ilişkileri nedeniyle Bacillus anthracis&#39;i incelemek için faydalı bir modeldir 1 . B. anthracis , insanlarda ve hayvanlarda ölümcül inhalasyon şarbonuna neden olan zorunlu bir patojendir ve potansiyel olarak bir biyolojik silah olarak kullanılabilir 2 . Dolayısıyla, B. anthracis ile ilgili laboratuvar çalışmaları, ABD Hastalık Kontrol Merkezleri tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir ve laboratuar alanının negatif oda basıncıyla ayrılması zorunluluğu getiren biyogüvenlik seviyesi 3 (BSL-3) uygulamaları gerektirir. B. anthracis&#39;in aksine </eM&gt;, B. cereus bir BSL-1 ajan olarak kategorize edilir ve bu nedenle en az güvenlik kaygısı vardır. B. cereus , enfeksiyon sırasında gıda zehirlenmesine neden olan ve tıbbi yardım almadan tedavi edilebilen, fırsatçı bir patojendir. Bununla birlikte, B. cereus B. anthracis ile birçok kritik geni paylaştığı için, B. anthracis proteinlerinin fonksiyonları B. cereus 1&#39;in ilgili homologları kullanılarak incelenebilir. B. anthracis&#39;in ba1554 - ba1558 gen kümesi, bc1531 - bc1535 kümesi ile oldukça korunmuştur B. cereus&#39;un yanı sıra Bacillus thuringiensis&#39;in bt1364-bt1368 kümesiyle , gen organizasyonu ve sekansı açısından. Dahası, ilgili kümelerin ilk genleri ( ba1554 , bc1531 ve bt1364 ) tamamen korunmuştur ( yani, % 100 nükleotid sekansı özdeşliği)Bacillus türündeki gen ürününün kritik bir rolü. Bu gen kümelerindeki konumu nedeniyle ba1554 , varsayılan bir transkripsiyon regülatörü 3 olarak yanlış tanımlandı. Bununla birlikte, ba1554 ürününün amino asit sekansı analizi, nükleotid pirofosfohidrolaz aktivitesine sahip olan ve transkripsiyon faktörü aktivitesi 4 , 5 ile ilişkili olmayan MazG ailesine ait olduğunu gösterir. MazG ailesine ait proteinler genel dizi ve uzunluk bakımından çeşitlilik göstermesine rağmen, bir EXXE 12-28 EXXD motifiyle (&quot;X&quot; herhangi bir amino asit artığı anlamına gelir) karakterize edilen yaygın bir ~ 100 kalıntı MazG alanını paylaşırlar ve sayı X kalıntılarının sayısını belirtir). MazG alanı belli bir katalitik etkinliği her zaman doğrudan doğruya açıklamaz. Escherichia coli&#39;den bir MazG üyesi (EcMazG), iki MazG alanına sahiptir, ancakC-terminal MazG alanı enzimatik olarak aktif 6 . Dahası, MazG enzimlerinin substrat özgüllüğü spesifik olmayan nükleozid trifosfatlardan (EcMazG için) belirli dCTP / dATP&#39;ye (integrin ile ilişkili MazG için) ve dUTP&#39;ye (dUTPazlar için) 6 , 7 , 8 , 9 arasında değişir. Bu nedenle, BA1554 proteininin biyofizyokimyasal analizleri, NTPaz etkinliğini teyit etmek ve substrat özgüllüğünü deşifre etmek için gereklidir. Burada, B. anthracis ba1554&#39;ün bir ortologu olan B. cereus bc1531 geninin protein ürününü moleküler düzeyde karakterize etmek için bir BSL-3 tesisi olmayan çoğu laboratuvarın izleyebileceği adım adım bir protokol sunuyoruz. Kısaca, rekombinant BC1531 (rBC1531), E. coli&#39;de eksprese edildi ve bir afınite etiketi kullanılarak arıtıldı. X-ışını kristalografik deneyleri için, kristalRBC1531 proteininin zation koşulları tarandı ve optimize edildi. RBC1531&#39;in enzimatik aktivitesini değerlendirmek için, geleneksel olarak kullanılan radyoaktif olarak işaretlenmiş nükleotidlerden kaçınmak için NTPaz etkinliği kolorimetrik olarak izlenmiştir. Son olarak, elde edilen biyofizikokimyasal verilerin analizi, rBC1531&#39;in oligomerleşme durumunu ve katalitik parametrelerini belirlememize ve rBC1531 kristalinden X-ışını kırınım verilerini elde etmemize olanak sağladı.

<table><tbody><tr><td>Bacillus cereus ATCC14579</td><td>Doku Kültürü için Kore Koleksiyonu</td><td>3624</td><td></td></tr><tr><td>Genomik DNA hazırlık kiti</td><td>GeneAll</td><td>106-101</td><td>Genomik DNA hazırlama</td></tr><tr><td>İleri astar</td><td>Macrogen</td><td>GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA</td><<td>em>BamHI sitesinin altı çizili</td></tr><tr><td>Ters astar</td><td>Macrogen</td><td>CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG</td><td>SalI sitesinin altı çizili</td></tr><tr><td>nPfu-Forte</td><td>Enzimomik</td><td>P410</td><td>PCR polimeraz</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>Enzimatik</td><td>R003S</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>Enzimonomik</td><td>R009S</td><td></td></tr><tr><td>pET49b ekspresyon vektörü</td><td>Novagen</td><td>71463</td><td>İfade vektörü, benzeşim etiketleri ve BamHI/SalI siteleri eklemek için değiştirildi10</td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>Enzimatik</td><td>M001S</td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz memebran</td><td>Thermofisher</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>Kuru blok ısıtıcı</td><td>JSR</td><td>JSBL-02T</td><td></td></tr><tr><td>LB et suyu (Luria-Bertani)</td><td>LPS çözeltisi</td><td>LB-05</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Becton, Dickinson ve Şirketi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>LPS çözeltisi</td><td>KAN025</td><td></td></tr><tr><td>Mini hazırlık kiti</td><td>Favorgen</td><td>FAPDE300</td><td>Plazmid DNA hazırlığı</td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Yetkili hücre</td><td>Novagen</td><td>69450-3CN</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil ve beta;-D-1-tiyokalaktopiranosit (IPTG)</td> <td>Fisher BioReaktifler</td><td>50-213-378</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Daejung</td><td>7548-4100</td><td>PBS malzemesi</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Daejung</td><td>6566-4405</td><td>PBS malzemesi</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat</td><td>Bio Basic Inc</td><td>PB0445</td><td>PBS malzemesi</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat</td><td>Bio Basic Inc</td><td>S0404</td><td>PBS malzemesi</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Bio Basic Inc</td><td>IB0277</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agaros</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>Nikel boncuk</td></tr><tr><td>Döndürücü</td><td>Finepcr</td><td>AG</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Çift Renk Standartları</td><td>Bio-rad</td><td>1610374</td><td>SDS-PAGE protein standardı</td></tr><tr><td>Coonmassie Brilliant Blue R-250</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP101-25</td><td>Coomassie boyama çözeltisi</td></tr><tr><td>Metil alkol</td><td>Samchun kimyasal</td><td>M0585</td><td>Coomassie boyama çözeltisi</td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Daejung</td><td>1002-4105</td><td>Coomassie boyama çözeltisi</td></tr><tr><td>Diyaliz memebrane</td><td>Thermofisher</td><td>68035</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Merckmillipore</td><td>605157-1KUCN</td><td>20 &mu'luk alikotlar hazırlayın; L (&mu başına 1 Birim; L) ve 70 ° C'de saklayın; Kullanmadan önce C ve çözdürün</td></tr><tr><td>Superdex 200 16/600</td><td>General Electric</td><td>28989335</td><td>Boyut dışlama kromatografisi</td></tr><tr><td>Jel filtrasyon standardı</td><td>Bio-rad</td><td>151-1901</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj filtre</td><td>Amicon</td><td>UFC800396</td><td></td></tr><tr><td>Kristralizasyon plakaları</td><td>Hampton araştırması</td><td>HR3-083</td><td>96 kuyucuklu oturma damla plakası</td></tr><tr><td>JCSG çekirdek takımı I-IV</td><td>Qiagen</td><td>130924-130927</td><td>Kristalleşme secreening çözeltisi</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Cryschem plakaları</td><td>Hampton araştırması</td><td>HR3-158</td><td>24 kuyulu oturma damla plakası</td></tr><tr><td>İnorganik pirofosfataz</td><td>Sigma</td><td>10108987001</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum molibdat çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>13106-76-8</td><td></td></tr><tr><td>L-askorbik asit</td><td>Sigma</td><td>50-81-7</td><td></td></tr><tr><td>NTP substrat</td><td>Startagene</td><td>200415-51</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Biotek</td><td>SynergyH1</td><td>mikroplaka okuyucu</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5</td><td></td><td>Pencere için GraphPad</td><td></td> Prism 5</tr></tbody></table>

birliğin rekombinant protein ekspresyonu, kristalleştirilmesi ve biyofiziksel araştırmaları<em&gt; bacillus</em&gt; - konserve nükleotid pyrophosphorylase, bcmazg

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Gerçek patojenlerden genleri ve proteinleri incelerken emniyet kısıtlamalarını ve yönetmelikleri aşmak için bunların homologları incelenebilir. Bacillus anthracis ölümcül inhalasyon şarbonuna neden olan zorunlu bir patojendir. Bacillus cereus , yakın evrimsel ilişkisi nedeniyle B. anthracis&#39;i incelemek için faydalı bir model olarak düşünülür. B. anthracis&#39;in ba1554 - ba1558 gen kümesi B. cereus&#39;daki bc1531 - bc1535 kümesi ile Bacillus thuringiensis&#39;deki bt1364 - bt1368 kümesi ile yüksek oranda korunmuştur, bu da Bacillus cinsindeki ilişkili genlerin kritik rolünü göstermektedir. Bu el yazması, B. anthracis&#39;teki gen kümesinden birinci gen ( ba1554 ) &#39;ün bir protein ürününü B. cereus , bc1531&#39;deki ortologunun rekombinant bir proteinini kullanarak hazırlamak ve karakterize etmek için kullanılan yöntemleri açıklamaktadır.

Bu çalışmada ilgilenilen proteinin karakterizasyonu, tercihen birkaç miligramdan daha fazla rekombinant B. cereus bc1531 (rBC1531) proteininin yeterli bir miktarının hazırlanmasıyla başlamıştır. BC1531 proteinini kodlayan DNA parçası, ba1554&#39;e özdeş ortolog genler içerdiği için B. cereus&#39;un genomik DNA&#39;sını şablon olarak kullanarak PCR ile hazırlandı . RBC1531, E. coli hücrelerinde çözünür bir protein olarak aşırı eksprese edildi. RBC1531 p...

Bacillus anthracis ölümcül inhalasyon şarbonunun zorunlu patojendir, bu nedenle genleri ve proteinleri üzerine yapılan çalışmalar kesinlikle düzenlenmiştir. Alternatif bir yaklaşım, ortolog genleri incelemektir. B. cereus , bc1531&#39;de B. antrasis ortologunun biyofizikokimyasal çalışmalarını, minimal deney ekipmanı gerektiren ve ciddi güvenlik endişeleri içermeyen çalışmalarını anlattık.

Birliğin Rekombinant Protein Ekspresyonu, Kristalleştirilmesi ve Biyofiziksel Araştırmaları<em&gt; Bacillus</em&gt; - Konserve Nükleotid Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Bu prosedürün genel amacı, protein x-ışını kristalografisi veya enzimatik kinetik gibi biyofiziksel kimyasal çalışmaları kolaylaştırmak için patojen olmayan bakterilerden rekombinant protein hazırlamaktır. Bu yöntem, ön biyofiziksel karakterizasyon için patojen olmayan bakteriler kullanılarak ilgili rekombinant proteinin nasıl hazırlanacağına dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilgili proteinin biyofiziksel karakterizasyonunun, hücre kültürü inkübatörleri ve spektrofotometreler gibi yaygın cihazlarla donatılmış herhangi bir laboratuvarda gerçekleştirilebilmesidir.Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği şekilde ligasyon reaksiyonunu hazırlayın. Hazırlanan ligasyon reaksiyonundan 3 µL miktarını, 50 µL kimyasal kompetan E.coli DH5 alpha hücreleri içeren bir tüpe pipetleyin. Bir pipet kullanarak çözeltiyi nazikçe karıştırın.Çözeltiyi 30 dakika boyunca buzda bekletin. Ardından, 42 °C'de 45 saniye boyunca ısı şoku uygulayın. Bunun ardından, bir mililitre LB besiyeri ekleyin ve hücreleri 37 °C'de, dakikada 250 devirle şiddetli şekilde çalkalayarak 45 dakika boyunca büyütün.Transform edilmiş hücrelerin 100 µL'sini, mililitre başına 100 µg kanamisin eklenmiş bir LB agar plağına yayın. 37 °C'de 18 saat boyunca inkübe edin. Steril bir uç kullanarak plaktaki kolonileri seçin.Hücreleri, 18 °C'de, dakikada 250 rotasyonla şiddetli çalkalamayla, takviye edilmiş 3 ml LB besiyerinde 18 saat boyunca büyütün. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi plazmid DNA'sını hazırlayın ve nükleotid dizilimini doğrulayın. E.coli BL21 suşunu yeniden transforme ettikten sonra, steril bir uç kullanarak bir koloni seçin ve 150 µg/ml kanamisin içeren 10 ml LB besiyerine inoküle edin.250 devir/dakika hızında güçlü çalkalama ile 37 °C'de 18 saat boyunca inkübe edin. Ardından, 10 mL gece boyu kültürü, bir litre LB ve kanamisinli ortama aktarın. 600 nanometredeki optik yoğunluk 0,7'ye ulaşana kadar 37 °C'de büyütün.Ardından kültürü 15 dakika boyunca buzlu suya daldırın. Kültüre, final konsantrasyonu 1 mM olacak şekilde IPTG ekleyin. 18 °C'de 16 ila 18 saat daha inkübe edin.Bundan sonra, 4 °C'de 30 dakika boyunca 5.000 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın. Hücreleri 10 mM imidazol içeren 50 µL PBS içinde yeniden süspanse edin.Ardından, metin protokolünde detaylandırıldığı üzere hücreleri buz üzerinde iki kez lize edin. Hücre lizatını temizlemek için 4 °C'de 30 dakika boyunca 25,000 ×g'de santrifüjleyin. Daha sonra, 50 mL'lik konik bir tüpte üç mL nikel boncuk ve 10 mM imidazol içeren 47 mL PBS'yi karıştırın.2,5 x 10 cm'lik bir cam kromatografi kolonuna yerleştirilen dengelenmiş boncukların çökmesi için yerçekimi akışıyla ekstra tampon çözelti ekleyin. Süpernatantı bir pipet kullanarak kolona aktarın. 20 rpm hızındaki bir döner çark üzerinde, dört °C'de iki saat boyunca inkübe edin.Bundan sonra, süpernatanın yer çekimi ile süzülmesini bekleyin. Nikel boncukları, her yıkama için 10 millimolar imidazol içeren 100 mililitre PBS kullanarak üç kez yıkayın. Ardından, RBC 1531 proteinini elüe etmek için 250 millimolar imidazol içeren beş mililitre PBS uygulayın.Metin protokolünde belirtildiği şekilde, elüsyonun 15 µL'sini SDS Page ile analiz edin. Toplanan fraksiyonları bir diyaliz tüpüne pipetleyin. Tüpü, dört °C'de, dört litre trombin kesimi uyumlu tampon içeren bir behere gece boyunca yerleştirin.Ertesi gün, fraksiyonları 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için bir pipet kullanın. Metin protokolünde belirtildiği şekilde, protein konsantrasyonunu tahmin etmek için 280 nanometrede absorbansı ölçün. Ardından, 50 mikrolitre RBC 1531 proteinini birkaç tüpe aktarın.Her tüpe farklı miktarlarda trombin ekleyin ve 20 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Gerekli olan en düşük trombin miktarı belirlendikten sonra, 15 mL'lik bir tüpe 10 mg protein ve 60 ünite trombin ekleyin. 20 °C'de üç saat boyunca inkübe edin.Ardından, trombin ile sindirilmiş proteini bir santrifüj filtre tüpüne aktarın. Hacmi beş mililitrenin altına düşürmek için dört santigrat derecede 3,000 ×g hızında santrifüjleyin. Bundan sonra, konsantre edilen proteini hazırlanmış bir boyut dışlama kromatografisi kolonuna uygulayın.Tüp başına 0.5 mililitre olacak şekilde 60 elüsat fraksiyonu toplayın. Metin protokolünde belirtildiği üzere, her fraksiyondan 15 mikrolitreyi %15'lik bir SDS Page jelinde yürütün. Ardından, RBC 1531 proteinini içeren fraksiyonları birleştirin.Başlamak için birleştirilmiş fraksiyonları bir santrifüj filtre tüpüne aktarın. Proteini yaklaşık 18.5 mg/mL konsantrasyona getirmek için 4 °C'de 3,000 ×g'de santrifüjleyin. Ardından, 96 kuyucuklu bir oturan damla kristalizasyon plakasının kuyucuklarına her bir kristalizasyon tarama solüsyonundan 50 µL ekleyin.Oturtma tabanına 0.5 µL konsantre protein çözeltisi ekleyin. Protein çözeltisini 0.5 µL kuyucuk çözeltisi ile ayrı olarak karıştırın. Plakayı şeffaf yapışkan filmle kapatın.18 °C'de inkübe edin ve buhar difüzyonuna izin verin. Kristal oluşumunu iki ila üç hafta boyunca günlük olarak izlemek için damlaları bir ışık mikroskobu kullanarak 20 ila 40 kat büyütmede tarayın. NTP substratlarını hazırladıktan sonra her birini 96 kuyucuklu bir plakaya ekleyin.Karıştırmak için bir pipet kullanarak her kuyucuğa 20 µg RBC 1531 proteini ekleyin. Plakanın kapağını kapatın ve 30 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin. Ardından, RBC 1531 aracılı katalitik reaksiyonları durdurmak için plakayı 15 dakika boyunca 70 °C'lik bir su banyosuna aktarın.Ardından, her bir kuyucuğa bir microliter S.cerevisiae inorganik pirofosfataz ekleyin. 20 degrees Celsius'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, rengin gelişmesi için reaksiyon plakasına 16 microliter molibdat asit çözeltisi ekleyin.15 dakika sonra, 690 nanometredeki optik yoğunluğu okuyun. Bu çalışmada, B serisi BC1531 geninin protein ürünü moleküler düzeyde karakterize edilmektedir. Nikel afinite kromatografisi ile saflaştırmanın ardından bir trombin sindirim deneyi gerçekleştirilir.RBC 1531'den afinite etiketini tamamen uzaklaştırmak için gereken en düşük miktarın 0,3 ünite trombin olduğu görülmüştür. Sindirim sonrası, etiketten arındırılmış protein, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak yaklaşık %99 saflıkta saflaştırılır. Ardından, oligomerik durum boyut dışlama kromatografisi ile tahmin edilir.RBC 1531 yaklaşık 84 mililitrede elüye olduğu için moleküler ağırlığının 55 kilodalton olduğu tahmin edilmektedir. Monomerin hesaplanan moleküler ağırlığı yaklaşık 13 kilodaltondur. Bu nedenle, RBC 1531 bir tetramer olarak birleşmektedir.Ardından, oturan damla buhar difüzyon yöntemi kullanılarak kristalleşme taraması gerçekleştirilir. Bir molar sodyum sitrat ve %20 polietilen glikol 3.000 ile ayrıca 0,1 molar sodyum kakodilat ve bir molar sodyum sitrat ile iki gün sonra kristaller görülür. Bunun ardından NTPaz aktivitesi belirlenir.RBC 1531 aracılı hidroliz reaksiyonuna molibdat eklendikten sonra görünür bir renk değişimi gözlemlenmez. Ancak, pirofosfataz eklendiğinde rengin koyu maviye döndüğü görülür. Ardından, 690 nanometredeki optik yoğunluk ve NTP konsantrasyonu doğrusal olmayan regresyon kullanılarak analiz edilir.RBC 1531 enziminin maksimum hızının 0,75 ve Michaelis sabitinin 10 micromolar olduğu belirlenmiştir. Bu prosedür uygulanırken, protein örneklerinin gecikmeksizin hazırlanması ve protein kristalleşmesini engelleyen veya enzimatik analizlerde hatalara yol açan herhangi bir safsızlık içeren fraksiyonların atılması önemlidir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, enzimoloji ve diğer protein bilimi alanındaki araştırmacıların, çoğu laboratuvarda bulunan spektrofotometreler ile ilgilendikleri proteinleri karakterize etmelerinin yolunu açmıştır.Bu yöntem, rekombinant protein hazırlama, kristalizasyon taramaları ve enzimatik kinetik hakkındaki genel fikirler konusunda bilgi sağlayabilse de, ilgilendiğimiz diğer proteinlerin biyofiziksel kimyasal analizlerine de uygulanabilir. Proteinler son derece kararsız olabileceğinden, onlarla çalışırken dikkatli olmayı unutmayın. Numuneleri buz üzerinde tutmak ve uzun süreli saklama için -80 derecede dondurmak gibi önlemler gereklidir.Bu videoyu izledikten sonra, X-ışını kristalografisi ile yapı tayini için protein kristalleri elde etmek amacıyla patojenik olmayan bakterilerden rekombinant proteinin nasıl hazırlandığını ve kolorimetrik bir yöntem kullanılarak enzimatik aktivitenin nasıl karakterize edileceğini iyi bir şekilde kavramış olmanız gerekir.

recombinant-protein-expression-crystallization-biophysical-studies

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Protein transdüksiyon biyolojik olarak aktif proteinler hücre içine doğrudan teslim sağlar. DNA transfeksiyon veya viral transdüksiyon gibi geleneksel yöntemler yerine, aksine bu non-invaziv bir paradigma hücresel toksisite ve kalıcı genetik modifikasyon onkojenik transformasyon riskini engellemeyi titrasyon bir şekilde yüksek verimli hücresel manipülasyon sağlar.

Mühendislik Hücre geçirgen Protein

Yapı-esaslı ecza tasarımı ilaç gelişmesinde önemli bir rol oynar. Paralel olarak birden çok hedef edinerek büyük ölçüde kurşun keşfi için başarı şansını artırır. Aşağıdaki makale Enfeksiyon Hastalıkları için Seattle Yapısal Genomik Merkezi PB2 influenza A alt birimi gen-için-yapı tayini için bir çoklu hedef yaklaşım kullanır nasıl vurgulamaktadır.

Grip Polimeraz Gen-to-yapı belirlenmesi PB2 alt birimi için çoklu hedef Paralel İşleme Yaklaşımı

Protein kompleksleri önemli hücre fonksiyonlarını katalize eder. Birçok temel komplekslerinin detaylı fonksiyonel ve yapısal karakterizasyonu rekombinant üretimi gerektirir. MultiBac özellikle ökaryotik protein ve kompleksleri ifade etmek için özel bir bakülovirüs / böcek hücre sistemidir. MultiBac açık erişim platformu ve faydayı maksimize için geliştirilmiş standart çalışma prosedürleri olarak uygulanmıştır.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Memeli sistemleri tarafından rekombinant proteinlerin ekspresyonu, yapısal biyoloji için protein kompleksleri üretmek için çekici bir yöntem haline geliyor. Burada, yapısal çalışmalar için protein komplekslerini saflaştırmak için süspansiyonda yetiştirilen memeli hücrelerini kullanan basit ama oldukça verimli bir ekspresyon sistemi sunuyoruz.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

Bu, salgılanan, glikosile edilmiş memeli proteinlerinin üretimi ve ardından X-ışını kristalografisi ve diğer biyofiziksel çalışmalar için yeterli homojen protein verimi ile tek aşamalı saflaştırma için hızlı, uygun maliyetli bir protokoldür.

Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Prolin-prolin endopeptidaz-1 (PPEP-1), insan patojeni Clostridium difficile'den salgılanan bir metalloprotaz ve umut verici ilaç hedefidir. Burada, bu proteinin üretimi ve yapısının belirlenmesi için gerekli tüm yöntemleri açıklıyoruz.

Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 mikro-tohumlama ve Çinko-SAD aracılığıyla

Burada, bitki salgılanan proteinler için protein kristalizasyon büyük miktarlarda üretmek için böcek hücre ve baculovirus protein ifade sistemi kullanan iletişim kurallarını mevcut. Bir baculovirus ifade vektör GP67 ya da böcek hemolin sinyal peptid bitki protein salgılanması ifade böcek hücrelerinde ile değiştirildi.

Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Baculovirüs ekspresyon vektör sistemi (BEVS), biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalarda kullanılacak protein arginin metiltransfenazlarının (PRMT) ekspresyon taraması ve üretimi için sağlam bir platformdur. Milligram miktarda malzeme, ökaryotik bir ifade platformu gerektiren PRMT'lerin ve diğer ilgi proteinlerinin çoğunluğu için üretilebilir.

Baculovirüs Ekspresyon Vektör Sistemi Kullanılarak Rekombinant PRMT Proteinlerinin Üretimi

Bu protokol, sterol taşıyıcı ABCG5/G8'in kristalizasyonu için bir kurulumu açıklar. ABCG5/G8, asılı damla kristalizasyonu için iki seliler halinde yeniden oluşturulur. Protokol, özel malzemeler veya substratlar gerektirmez, bu da X-ışını kristalografisi yoluyla protein yapısını belirlemek için herhangi bir laboratuvarda erişilebilir ve uyarlanmasını kolaylaştırır.

ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme

Öğrenin, patojen olmayan bakterilerden rekombinant protein hazırlama ve biyofiziksel karakterizasyon yöntemlerini. Bacillus cereus kullanarak güvenli protein kristalizasyonu ve enzimatik kinetik çalışmaları yapın.

Birliğin Rekombinant Protein Ekspresyonu, Kristalleştirilmesi ve Biyofiziksel Araştırmaları Bacillus - Konserve Nükleotid Pyrophosphorylase, BcMazG (Video) | JoVE Journal

Birliğin Rekombinant Protein Ekspresyonu, Kristalleştirilmesi ve Biyofiziksel Araştırmaları

Daha fazla video keşfet