Birliğin Rekombinant Protein Ekspresyonu, Kristalleştirilmesi ve Biyofiziksel Araştırmaları Bacillus - Konserve Nükleotid Pyrophosphorylase, BcMazG

Bu prosedürün genel amacı, protein x-ışını kristalografisi veya enzimatik kinetik gibi biyofiziksel kimyasal çalışmaları kolaylaştırmak için patojenik olmayan bakterilerden rekombinant protein hazırlamaktır. Bu yöntem, ön biyofiziksel karakterizasyon için patojenik olmayan bakteriler kullanılarak ilgilenilen rekombinant proteinin nasıl hazırlanacağına dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilgilenilen protein için biyofiziksel karakterizasyonun, hücre kültürü inkübatörleri ve spektrofotometreler gibi yaygın cihazlarla donatılmış herhangi bir laboratuvarda yapılabilmesidir.

Bu prosedüre başlamak için, ligasyon reaksiyonunu metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın. Hazırlanan ligasyon reaksiyonunun üç mikrolitresini 50 mikrolitre kimyasal olarak yetkin E.coli DH5 alfa hücresi içeren bir tüpe pipetleyin. Bir pipet kullanarak çözeltiyi yavaşça karıştırın.

Çözeltiyi 30 dakika boyunca buzlayın. Ardından, 42 santigrat derecede 45 saniye boyunca ısı şoku. Bundan sonra, bir mililitre LB ortamı ekleyin ve hücreleri dakikada 250 dönüşte, 37 santigrat derecede 45 dakika boyunca kuvvetlice çalkalarken büyütün.

100 mikrolitre dönüştürülmüş hücreyi, mililitre kanamisin başına 100 mikrogram ile desteklenmiş bir LB burgu plakasına yayın. 37 santigrat derecede 18 saat inkübe edin. Steril bir uç kullanarak, plakadan kolonileri toplayın.

Hücreleri, 18 saat boyunca 18 santigrat derecede dakikada 250 dönüşte kuvvetli çalkalama ile üç mililitre takviye edilmiş LB ortamında büyütün. Ardından, plazma DNA'sını hazırlayın ve metin protokolünde belirtildiği gibi nükleotid dizisini onaylayın. E.coli BL21 suşunu yeniden dönüştürdükten sonra, steril bir uç kullanarak bir koloni seçin ve mililitre kanamisin başına 150 mikrogram içeren 10 mililitre LB ortamını aşılayın.

Dakikada 250 dönüşte kuvvetli çalkalama ile 18 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, 10 mililitre gece kültürünü bir litre LB ve kanamisin ortamına aktarın. 600 nanometredeki optik yoğunluk 0,7'ye ulaşana kadar 37 santigrat derecede büyütün.

Daha sonra kültürü 15 dakika buz gibi soğuk suya batırın. Kültüre IPTG ekleyin, böylece son konsantrasyon bir milimolar olur. 18 santigrat derecede 16 ila 18 saat daha inkübe edin.

Bundan sonra, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 5.000 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın. Hücreleri, 10 milimolar imidazol içeren 50 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin.

Daha sonra, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi hücreleri buz üzerinde iki kez parçalayın. Hücre lizatını temizlemek için dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 25.000 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, 50 mililitrelik konik bir tüpte üç mililitre nikel boncuk ve 10 milimolar imidazol içeren 47 mililitre PBS'yi karıştırın.

Yerçekimi, dengelenmiş boncukları 2,5 x 10 santimetrelik bir cam kromatografi kolonuna yerleştirmek için ekstra tamponu akıtar. Bir pipet kullanarak, süpernatanı kolona aktarın. Dakikada 20 dönüşte çıkrık üzerinde iki saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Bundan sonra, süpernatantın yerçekimi ile boşalmasına izin verin. Nikel boncukları, her yıkama için 10 milimolar imidazol içeren 100 mililitre PBS kullanarak üç kez yıkayın. Ardından, RBC 1531 proteinini elüte etmek için 250 milimolar imidazol içeren beş mililitre PBS uygulayın.

Metin protokolünde belirtildiği gibi SDS Sayfası aracılığıyla 15 mikrolitre elüsyonu analiz edin. Toplanan fraksiyonları bir diyaliz tüpüne pipetleyin. Tüpü, gece boyunca dört santigrat derecede dört litre trombin bölünme uyumlu tampon içeren bir behere yerleştirin.

Ertesi gün, fraksiyonları 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için bir pipet kullanın. Metin protokolünde belirtildiği gibi protein konsantrasyonunu tahmin etmek için absorbansı 280 nanometrede ölçün. Daha sonra 50 mikrolitre RBC 1531 proteinini birkaç tüpe aktarın.

Her tüpe farklı miktarda trombin ekleyin ve üç saat boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Gereken en az trombin miktarını belirledikten sonra, 15 mililitrelik bir tüpe 10 miligram protein ve 60 ünite trombin ekleyin. Üç saat boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, trombin ile sindirilmiş proteini bir santrifüj filtre tüpüne aktarın. Hacmi beş mililitrenin altına düşürmek için dört santigrat derecede 3.000 kez G'de santrifüjleyin. Bundan sonra, konsantre proteini hazırlanmış bir boyut dışlama kromatografi kolonuna uygulayın.

Tüp başına 0,5 mililitre ile 60 elute fraksiyonu toplayın. Metin protokolünde belirtildiği gibi% 15'lik bir SDS Page jeli üzerinde her fraksiyondan 15 mikrolitre çalıştırın. Daha sonra RBC 1531 proteinini içeren fraksiyonları birleştirin.

Başlamak için, birleşik fraksiyonları bir santrifüj filtre tüpüne aktarın. Proteini mililitre başına yaklaşık 18.5 miligrama konsantre etmek için dört santigrat derecede 3.000 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, her bir kristalizasyon eleme çözeltisinden 50 mikrolitreyi, 96 kuyulu bir damla kristalizasyon plakasının kuyucuklarına ekleyin.

Bir oturma yatağına 0,5 mikrolitre konsantre protein çözeltisi ekleyin. Protein çözeltisini ayrı ayrı 0.5 mikrolitre kuyu çözeltisi ile karıştırın. Plakayı şeffaf yapışkan film ile örtün.

18 santigrat derecede inkübe edin ve buhar difüzyonuna izin verin. Bir ışık mikroskobu kullanarak, iki ila üç hafta boyunca günlük kristal oluşumunu izlemek için damlaları 20 ila 40 kat büyütmede tarayın. NTP substratlarını hazırladıktan sonra, her birini 96 oyuklu bir plakaya ekleyin.

Karıştırmak için bir pipet kullanarak her kuyucuğa 20 mikrogram RBC 1531 proteini ekleyin. Plakayı kapağıyla kapatın ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Bundan sonra, RBC 1531 aracılı katalitik reaksiyonları durdurmak için plakayı 15 dakika boyunca 70 santigrat derece su banyosuna aktarın.

Daha sonra, her oyuğa bir mikrolitre S.cerevisiae inorganik pirofosfataz ekleyin. 20 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra rengi geliştirmek için reaksiyon plakasına 16 mikrolitre molibdat asit çözeltisi ekleyin.

15 dakika sonra, optik yoğunluğu 690 nanometrede okuyun. Bu çalışmada, B ciddi BC1531 geninin protein ürünü moleküler düzeyde karakterize edilmiştir. Nikel afinite kromatografisi ile saflaştırmadan sonra, bir trombin sindirim izi gerçekleştirilir.

0.3 ünite trombinin, afinite etiketini RBC 1531'den tamamen çıkarmak için gereken en düşük miktar olduğu görülmektedir. Sindirimden sonra etiketsiz protein, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak yaklaşık %99 saflığa kadar saflaştırılır. Daha sonra, oligomerik durum, boyut dışlama kromatografisi ile tahmin edilir.

RBC 1531 yaklaşık 84 mililitrede ayrıştırıldığından, moleküler ağırlığının 55 kilodalton olduğu tahmin edilmektedir. Monomerin hesaplanan moleküler ağırlığı yaklaşık 13 kilodaltondur. Bu nedenle, RBC 1531 bir tetramer olarak toplanır.

Kristalizasyon taraması daha sonra bir oturma damlası buhar difüzyon yöntemi kullanılarak gerçekleştirilir. Kristaller iki gün sonra bir molar sodyum sitrat ve% 20 polietilen glikol 3.000 ve 0.1 molar sodyum kakodilat ve bir molar sodyum sitrat ile görülür. Bundan sonra NTPaz aktivitesi belirlenir.

RBC 1531 aracılı hidroliz reaksiyonuna molibdat eklendikten sonra gözle görülür bir renk değişikliği görülmez. Bununla birlikte, pirofosfataz eklendiğinde rengin koyu maviye dönüştüğü görülür. 690 nanometredeki optik yoğunluk ve NTP konsantrasyonu daha sonra doğrusal olmayan regresyon kullanılarak analiz edilir.

RBC 1531 enziminin 0.75'te maksimum hıza ve 10 mikromolar Michaelis sabitine sahip olduğu belirlenmiştir. Bu prosedürü denerken, protein numunelerini gecikmeden hazırlamak ve protein kristalleşmesini engelleyen veya enzimatik tahlillerde hatalara neden olan herhangi bir safsızlık içeren fraksiyonları atmak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, enzimoloji alanındaki araştırmacıların ve diğer protein bilimlerinin, çoğu laboratuvarda dekore edilmiş spektrofotometrelerle ilgilenilen proteinleri karakterize etmelerinin yolunu açtı.

Bu yöntem, rekombinant protein hazırlama, kristalizasyon ekranları ve enzimatik kinetik ile ilgili genel fikirler hakkında bilgi sağlayabilse de, ilgilendiğimiz diğer proteinler için biyofiziksel kimyasal analizlere de uygulanabilir. Proteinlerle çalışırken dikkatli olmayı unutmayın çünkü son derece kararsız olabilirler. Numunelerin buz üzerinde bırakılması ve uzun süreli depolama için 80 derecede soğutulması gibi önlemler istenecektir.

Bu videoyu izledikten sonra, x-ışını kristalografisi ile bir yapı tayini için protein kristalleri elde etmek üzere patojenik olmayan bakterilerden rekombinant proteinin nasıl hazırlanacağını ve kolorimetrik bir yöntem kullanılarak enzimatik aktivitenin nasıl karakterize edileceğini iyi anlamış olmalısınız.