Sinir Büyümesi Faktörü Kapsüllemesi için Yeni HDL'yi taklit eden Nanopartiküllerin Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Bu makalenin genel amacı, sinir büyüme faktörü yüklü, yüksek yoğunluklu lipoprotein benzeri nanopartiküller için hazırlama ve karakterizasyon yöntemlerini tanıtmaktır. Normal, yüksek yoğunluklu lipoprotein benzeri nanopartikülleri hazırlamak için basit homogenizasyon kullanılmıştır. Prosedür basit ve ölçeklendirilebilir niteliktedir.

Ayrıca, nanoparçacık hapsedilme verimliliğini, ayrıca nanoparçacıklardaki NGF ve APOA1'i önemli ölçüde artırmıştır. Yüklenmemiş NGF'nin NGF nanoparçacıklarından ayrılması, güvenilir in vitro yarıçap çalışmalarının yürütülmesi ve NGF nanoparçacıklarının biyoyararlanımı dahil olmak üzere, bir nanoparçacığın karakterizasyonuna yönelik çeşitli zorlukların üstesinden gelinmiştir. Başlamak için, 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpünde 10 mikrolitre NGF ile 10 mikrolitre protamin USP'yi karıştırın ve kompleksin oluşması için oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.

Ardından, cam bir şişeye 59 µL fosfatidilkolin ve 11 µL sfingomiyelin ekleyin. Ayrıca dört µL fosfatidilserin, 15 µL kolesteril oleat ve 45 µL tokoferil polietilen glikol süksinat ekleyin. Karıştırın ve etanolü hafif bir nitrojen akımı altında yaklaşık beş dakika boyunca uçurun.

Tüm eksipiyanlar cam şişenin dibinde yağlı ince bir film tabakası oluşturmalıdır. Prototip nanoparçacıkları veya NP'leri oluşturmak için şişeye bir mililitre ultrapure su ekleyin ve oda sıcaklığında 9.500 rpm hızda beş dakika boyunca homojenize edin. Ardından, hazırlanan kompleksi prototip NP'lere ekleyin.

Süspansiyonu, cam şişe içerisindeki küçük bir manyetik karıştırıcı çubuk kullanarak 37 °C'de 30 dakika boyunca karıştırarak inkübe edin. NP'leri oda sıcaklığında 30 dakika daha karıştırarak soğutun. Soğutmanın ardından, 106 µL apolipoprotein A-1 ekleyin ve nihai NGF HDL-benzeri NP'leri oluşturmak için oda sıcaklığında gece boyunca karıştırın.

Üretici talimatlarına uygun olarak, bir partikül analizörü kullanarak partikül boyutunu ve zeta potansiyelini ölçün. Yüklenmemiş NGF'yi, NGF HDL-taklit eden nanopartiküllerden ayırmak ve NGF'nin hapsedilme verimliliğini belirlemek için çapraz bağlı bir jel filtrasyon kromatografi kolonu kullanılır. Kolon hazırlığı için, 15 mililitre sepharose 4B CL süspansiyonunu 50 mililitrelik bir behere aktarın.

Boncuk süspansiyonunu karıştırın ve bir miktarını kolona dökün. Kabarcıkları gidermek için kolona hafifçe vurun. Çözücünün süzülmesi ve boncukların çökelmesi için birkaç dakika bekleyin.

Kalan süspansiyonu eklemeye devam edin. Boncukları temizlemek için kolonun iç duvarını durulayın. Çözücü seviyesi sabit fazın üst kısmının biraz üzerine çıkana kadar çözücüyü süzün.

Ardından, kolonu 20 milliliters 1X fosfat tamponlu salin ile yıkayın ve koşullandırın. NGF'nin hapsolma verimliliğini ölçmek için, kolona 200 microliters NGF HDL-taklit eden NP'ler yükleyin ve 1X PBS ile elüe edin. Daha önce olduğu gibi, toplamda 12 adet bir mililitrelik fraksiyon toplayın.

Üretici talimatlarını izleyerek sekiz diyaliz tüpünü ön işlemden geçirin. 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 30 mL salım ortamı ekleyin. Ardından, bu ortamı 135 rpm çalkalama hızına sahip bir çalkalayıcıda 37 °C'ye kadar ısıtın.

Diyaliz tüpünü kapatın ve salım ortamına yerleştirin. Zaman sıfır örneği olarak diyaliz tüpünün dışından hızlıca 100 µL salım ortamı çekin. Örneği, daha sonra analiz etmek üzere derhal -20 °C'ye koyun.

Çekilen örneğin yerine koymak için santrifüj tüpüne 100 µL taze salım medyumu ekleyin. Ardından zamanlayıcıyı başlatın. 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 ve 72. saatlerde, salım medyumundan 100 µL çekin ve bunu 100 µL taze medyum ile değiştirin.

Çekilen örnekleri, daha sonraki analizler için derhal -20 °C'ye yerleştirin. Üç dakikalık homojenizasyon sonrası, prototip nanopartiküller için tutarlı partikül boyutları elde edilmiştir. Nihai NGF nanopartikülleri, dar ve monodispers bir boyut dağılımı ile 170 nanometre partikül boyutuna sahipti.

Yüklenmemiş NGF ve nanopartiküller jel filtrasyon kolonunda tamamen ayrılmıştır. Nanopartiküller iki ila dört numaralı fraksiyonlarda elüe edilmiştir. ELISA ölçümü, serbest NGF'nin 7. fraksiyondan 10. fraksiyona kadar elüe olduğunu göstermiştir.

NGF'nin hesaplanan hapsolma verimliliği yaklaşık %66 idi. NGF nanopartiküllerinin in vitro salınımı burada gösterilmiştir. Salım ortamına PBS ve BSA eklenerek, serbest NGF %85'in üzerinde bir geri kazanım ile diyaliz membranından geçmiştir. Buna karşın, NGF nanopartikülleri, 72 saat boyunca nanopartiküllerden yaklaşık %10 NGF salınımıyla yavaş bir salım profili göstermiştir. NGF nanopartikülleri, PC12 hücrelerinde serbest NGF ile benzer ölçüde nörit çıkışını stimüle etmiştir.

Her iki grup için de 50 nanograms per milliliter dozunda, mikroskop altında nörit çıkışı net bir şekilde gözlemlenmiştir. NGF nanopartikülleri, farelerin karaciğer, böbrek ve dalak dokularında plazma konsantrasyonunu önemli ölçüde artırmış ve NGF alımını azaltmıştır. HDL-taklitçi nanopartiküller NGF'ye yardımcı olarak in vivo stabilitesinde uzun bir yarılanma ömrü sağlanmasına imkan tanımıştır.

Yöntem bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde homojenizasyon yöntemi kullanılarak üç dakika içinde monodispers nanoparçacıklar hazırlanabilir. Bu prosedürü uygularken, çözücüyü buharlaştırmak için hafif bir nitrojen akışı kullanmayı ve homojenizasyondan sonra kabın çeperine yapışmış herhangi bir lipid kalıntısı kalmadığından emin olmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, homojenizasyon yöntemiyle HDL-taklitçi nanoparçacıkların nasıl hazırlanacağı ve NGF yüklü nanoparçacıkların nasıl karakterize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.