Name: Sinir Büyümesi Faktörü Kapsüllemesi için Yeni HDLyi taklit eden Nanopartiküllerin Hazırlanması ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Keşfedin sinir büyüme faktörü yüklü HDL taklit eden nanopartiküllerin hazırlanması ve karakterizasyonu. Basit homojenizasyon yöntemi ile yüksek kapsülleme verimliliği sağlanır ve nörolojik tedaviler için ölçeklenebilir bir ilaç taşıma sistemi geliştirilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH R03 NS087322-01 tarafından Dong, X&#39;e desteklenmiştir.

NOT: Bütün prosedürlere dahil edilen hayvan çalışmaları Kuzey Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi&#39;ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. NGF HDL&#39;yi taklit eden nanoparçacıkların hazırlanması <ol><li> 1 mg / mL&#39;de stok solüsyonları hazırlamak için etanol içinde yardımcı maddeler olan fosfatidilkolin (PC), sfingomiyelin (SM), fosfatidilserin (PS), kolesteril oleat (CO) ve D-α-tokoferil polietilen glikol süksinat (TPGS) çözündürülür. NOT: Stok çözeltileri aliquoted ve -20 ° C&#39;de saklanır. Kolesteril oleat koyu renk şişelerde saklandı. PC, SM, PS ve CO stok çözeltileri -20 ° C&#39;de sırasıyla 6, 3, 12 ve 12 ay boyunca sabit kalmıştır. TPGS çözeltisi -20 ° C&#39;de en az 12 ay boyunca stabildi. </li><li> 1.5 mL&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpünde 10 μL protamin USP (suda 1 mg / mL) ile NGF (su içerisinde 1 mg / mL) 10 μL karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.Kompleksi oluştur. NOT: NGF ve protamin stok solüsyonları aliquoted edildi ve -20 ° C&#39;de saklandı. NGF stokları için tekrarlanan donma ve çözme önerilmez. </li><li> Bir cam flakona 59 μL PC, 11 μL SM, 4 μL PS, 15 μL CO ve 45 μL TPGS ekleyin. Etanolü yaklaşık 5 dakika nazik azot akımı altında karıştırın ve buharlaştırın; Tüm eksipiyanlar, cam flakonun alt kısmında yağlı, ince bir film oluşturmalıdır. </li><li> Şişeye 1 mL ultrapure (tip 1) su ekleyin ve prototip NP&#39;leri oluşturmak için oda sıcaklığında 5 dakika 9,500 rpm&#39;de (8,600 xg) homojenize edin. </li><li> Adım 1.2&#39;de hazırlanan kompleksi prototip NP&#39;lere ekleyin ve cam flakon içerisinde küçük bir karıştırma çubuğu kullanarak karıştırarak 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. <ol><li> NP&#39;leri 30 dakika daha oda sıcaklığında karıştırarak soğutun. Bu soğumadan sonra, 106 uL Apo AI (1.49 mg / mL) ilave edin ve gece boyunca oda sıcaklığında karıştırarak nihaiNGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;ler. </li></ol></li></ol> 2. NGF HDL-taklit eden Nanopartiküllerin Karakterizasyonu <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre bir parçacık analizcisi kullanarak parçacık boyutunu ve zeta potansiyelini ölçün (Malzeme Tablosuna bakın). </li><li> NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;lerden boşaltılan NGF&#39;yi ayırmak ve NGF&#39;nin tuzaklanma verimliliğini belirlemek için çapraz bağlı bir agaroz jel filtrasyon kromatografısi sütunu kullanın. <ol><li> Kolon hazırlığı için, 15 mL Sepharose 4B-CL süspansiyonunu 50 mL&#39;lik bir behere aktarın. Boncuk süspansiyonunu bir cam çubuk yardımıyla karıştırın ve bazılarını bir sütuna (30 cm uzunluğunda × 1 cm çapında, alt kısmında cam frit ile birlikte) boşaltıp içine dökün. Kabarcıklardan kurtulmak için hafifçe dokunun. Çözücünün boşaltılmasına ve boncukların birkaç dakika çökelmesine izin verin. </li><li> Kalan süspansiyonu ilave etmeye devam edin. Boncukları temizlemek için kolonun iç cidarını durulayın. Solventi, solvent seviyesi hafifçeDurağan fazın üstünü kaldırın. Kolonu 20 mL 1x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 8 mM Na2HPO4 ve 2 mM KH2PO4 içeren) ile yıkayıp kondüsyonlayın. </li><li> Boşalan NGF içeren fraksiyonları belirlemek için, jel filtrasyon sütununa (25 cm uzunluk x 1 cm çap) 200 μL NGF solüsyonu (10 μg / mL) yükleyin ve 1x PBS ile elute edin. </li><li> Toplam 12 fraksiyon (her fraksiyon için 1 mL) toplayın ve NGF için bir Sandwich ELISA kiti kullanarak her bir fraksiyonda NGF konsantrasyonunu ölçün. </li><li> Sandwich ELISA kiti kullanılarak 6 ila 10 fraksiyonlarından NGF&#39;yi tespit edin. Sütun üzerine boşaltılan NGF&#39;nin bir kromatogramı elde edin. Kolonu 20 mL PBS ile yıkayın. </li><li> NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;leri içeren fraksiyonları belirlemek için kolona 200 uL NP yükleyin ve 1x PBS ile elute edin. Toplam 12 fraksiyon toplamak (her fraksiyon için 1 mL) ve her fraksiyondaki partiküllerin yoğunluğunu ölçün uParçacık boyutu analizörünü söyle. NGF NP&#39;lerini fraksiyonlar 2-4&#39;ten tespit edin. NOT: Yoğunluk, test çözeltisinde kaç nanopartikül bulunabileceğini belirten parçacık analizcisi tarafından ölçülen bir parametredir. Çözümde ne kadar çok NP var ise yoğunluk o kadar yüksek olur. Bu yaklaşımla, sütunun NGF NP&#39;lerini boşaltılan NGF&#39;den ayırt edebildiğini doğrulayabiliriz. </li><li> NGF&#39;nin tuzaklanma verimliliğini ölçmek için 200 μL NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;leri kolona yükleyin ve 1x PBS ile elute edin. Toplam 12 fraksiyon toplamak (her fraksiyon için 1 mL). </li><li> Sandwich ELISA kiti kullanılarak 6&#39;dan 10&#39;a kadar olan fraksiyonlardan boşaltılan NGF konsantrasyonunu ölçün. </li><li> Boşaltılan NGF olarak 6 ila 10 fraksiyonlarından ölçülen NGF miktarlarını ekleyin ve aşağıdaki denklem kullanılarak NGF&#39;nin yakalama verimliliğini hesaplayın. % EE = (1 - boşaltılan NGF / NP&#39;ye eklenen toplam NGF) x% 100 Denklem (1) </li></ol></li></ol> 3. In vitro NGF HDL salınımıKötüye Kullanan Nanopartiküller <ol><li> Serbest NGF (su içerisinde 10 μg / mL; n = 4) ve NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;leri (10 μg / mL; n = 4) paralel çalışın. </li><li> Üreticinin talimatlarına uyarak 8 diyaliz borusunu (molekül ağırlığı kesilmesi: 300 kDa) önceden muamele edin. </li><li> Serbest bırakma ortamı olarak PBS&#39;de% 5 bovin serum albümini (BSA) hazırlayın. 50 mL&#39;lik bir santrifüj tüpüne 30 mL serbest bırakma ortamı ekleyin ve 135 rpm&#39;de çalkalama hızı olan bir çalkalayıcıda 37 ° C&#39;ye kadar ısıtın. Değiştirilmek üzere çalkalayıcıya başka bir 50 mL boşaltma ortamı yerleştirin. </li><li> Diyaliz tüpüne 400 μL serbest bırakma ortamı ekleyin ve diyaliz için yeterli hacim elde etmek için hızlıca 200 μL test numunesini ekleyin. </li><li> Tüpü kapatın ve diyaliz borusunu serbest bırakma ortamına (santrifüj tüpü) hızlıca yerleştirin. Zaman 0 için numune olarak dış diyaliz borusundan 100 uL serbest bırakma ortamını hızla geri çekin. Sonradan analiz için numuneyi -20 ° C&#39;ye derhal koyun. 100 μL taze reGeri alınan numunenin yerini almak için orta santrifüj tüpüne koyun. Zamanlayıcıyı çalıştır. </li><li> 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 ve 72 saatte, 100 uL serbest bırakma ortamını geri çekin ve 100 uL taze ortam ile değiştirin. Geri alınan örnekleri derhal analiz için -20 ° C&#39;ye getirin. </li><li> 72 saat sonra, tüm numuneleri -20 ° C&#39;den çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün. Salınım numunelerinin NGF konsantrasyonlarını Sandwich ELISA kiti kullanarak ölçün. </li></ol> 4. NGF HDL-taklit eden Nanopartiküllerin Biyoaktivitesi (Nörit Gelişme Çalışması) <ol><li> % 10 ısı ile inaktive edilmiş at serumu,% 5 sığır fetüsü serumu, 100 ug / mL streptomisin ve 100 ünite / mL penisilin ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamında PC12 hücreleri kültür. 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 ile nemli bir kuluçka hücresinde hücreleri muhafaza edin. </li><li> Hücreler ~% 70-80 konfluansa ulaştığında, kültür ortamını çıkarın ve hücreleri 1x PBS ile yıkayın (yaklaşık 10 mL /Sup&gt; 2 kültür yüzey alanı). Yıkama çözeltisini çıkarın. Şişeye% 0.25 Trypsin-EDTA solüsyonu (0.25% tripsin ve 1 mM EDTA; 0.5 mL / 10 cm 2 kültür yüzeyi alanı) ilave ederek hücreleri Trypsinize edin ve çoğu hücre ayrılıncaya kadar 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Kültür ortamı iki hacim ekleyin ve 180 xg&#39;de 5 dakika aşağı doğru döndürün. Süpernatantı çıkarın ve hücre topağını 5 mL kültür ortamında tekrar süspanse edin. Hücre kümelerini kırmak için hücreleri 22 G, ½ inç iğne ile filtreleyin. </li><li> Hücreleri yeni bir hücre kültürü şişesi içine 1: 3 oranında bölün. Gecelik inkübe edildikten sonra, bağlanmamış PC12 hücrelerini çıkarın. Ekteki hücrelerin daha fazla büyüme için kalmasına izin verin. </li><li> Güçlü bir yapışma özelliğine sahip PC12&#39;nin altkültürünü seçmek için bu prosedürü 3 pasaj için tekrarlayın. 800 μL / kuyucuk sıçan kuyruğu kolajeni tip I (100 μg / mL) ile 6 oyuklu bir plakayı önceden kaplayın. </li><li> Seçilen PC12 hücrelerini aşama 4.2&#39;de açıklandığı gibi deneyin ve bunları birHücre kümelerini kırmak için 22 G, ½ inç iğne. Hemocytometer ile hücreleri sayın. Hücreleri, plakaya yapışmalarına izin vermek için adım 4.5&#39;te önceden kaplanmış 6 oyuklu plakada gece boyunca 10.000 hücre / oyuk yoğunluğunda tohumlandı. </li><li> 0.5, 1, 5, 10, 50 ve 100 ng / mL konsantrasyonlarını hazırlamak için kültür ortamı (adım 4.1&#39;de açıklandığı şekilde) ile serbest NGF (10 ug / mL) ve NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;leri (10 ug / mL) seyreltin. Her oyuktan 2 mL ortam çıkarın ve sulandırılmış serbest NGF veya NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;lerin 2 mL&#39;si ile değiştirin. Kültür 4 gün boyunca. </li><li> 4. günde, ortamı uygun tedaviyi içeren taze ortama (adım 4.1&#39;de açıklanmıştır) değiştirin ve tedaviyi 3 gün daha devam ettirin. </li><li> 7. günde hücreleri ters ışık mikroskopu ile görselleştirin ve her birinin 10X büyütme altında rasgele noktalar halinde görüntüsünü alın. </li></ol> 5. NGF HDL&#39;yi taklit eden nanoparçacıkların biyolojik dağılımı <ol><li> Yetişkin BALB / c farelerini (erkek, 25-30 g) to tNGF NP&#39;lerin doku dağılımı. Fareler, grup başına 3 fareden oluşan üç gruba rasgele bölünürler. Vazodilatasyon ve damarın görünürlüğünü desteklemek için bir fareyi kısıtlamak ve kuyrukluğunu etanol ile silmek için koni şekilli bir plastik tutucu ( örn. Dekapikon) kullanın. </li><li> Her bir fareye (3 grup) 100 μL salin, serbest NGF veya NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;leri 40 μg / kg NGF dozunda kuyruk damarları yoluyla enjekte edin. 1 mL&#39;lik şırıngaya bağlı 30½ G&#39;lik bir iğne kullanın. </li><li> Enjeksiyondan 30 dakika sonra,% 3 inhale izofluran (2 L / dakika akış oranında oksijen) kullanarak farelere anestezi uygulayın. Anestezi derinliğini belirlemek için bir kuyruk ve ayak parmakları tutturun. Kalp ponksiyonuyla kan toplayın. <ol><li> Kalpten yaklaşık 1 mL kan alın. Her fareyi servikal çıkıkla euthanize edin. </li></ol></li><li> Fare karkasını sırt sırta oturtun. Karnınızı cerrahi makas kullanarak açın ve yağ ve bağırsağı kenara çekin.Karaciğer, dalak ve böbrekleri açığa vurmak için pamuklu çubuk kullanarak. Bu dokuları hasat edin ve kanı temizlemek için 1x PBS içinde durulayın. </li><li> Plazmayı elde etmek için hemen kan örneklerini 3,400 xg&#39;de ve 4 ° C&#39;de 5 dakika santrifüjleyin. Analizler oluncaya kadar plazmayı ve dokuları -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Doku örneklerini analiz etmek için, numuneleri -80 ° C&#39;den 4 ° C&#39;ye hareket ettirin ve 100 mg doku örneğini 10x hacimlik bir ekstraksiyon tamponunda (0.05 M sodyum asetat, 1.0 M sodyum klorür,% 1 triton X-100, % 1 BSA, 0.2 mM fenilmetansülfonil fluorür ve 0.2 mM benzetonyum klorid) ile yıkandı. 10,000 rpm&#39;de ve 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca homojenize edin. </li><li> Adım 5.3 ve 5.4&#39;te açıklandığı gibi boş plazma ve dokuları toplamak için iki muamele edilmemiş fareyi kurban edin. Boş plazma veya boş doku homojenatları kullanarak NGF standart solüsyonları hazırlayın. </li><li> Plazma ve doku homojenatlarındaki NGF konsantrasyonlarını yukarıda tarif edildiği gibi Sandwich ELISA kiti kullanarak belirleyin. </li></ol>

<ol><li>Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basics+and+recent+advances+in+peptide+and+protein+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Deliv%22%5BJournal%5D)">Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery.</a> Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).</li>
<li>Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-density+lipoprotein-mediated+drug+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 106 (Pt A), 132-147 (2016).</li>
<li>Lacko, A. G., Sabnis, N. A., Nagarajan, B., McConathy, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+as+a+drug+and+nucleic+acid+delivery+vehicle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">HDL as a drug and nucleic acid delivery vehicle.</a> Front Pharmacol. 6, 247-252 (2015).</li>
<li>Vaishya, R., Khurana, V., Patel, S., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+delivery+of+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Long-term delivery of protein therapeutics.</a> Expert Opin Drug Deliv. 12 (3), 415-440 (2015).</li>
<li>Lasic, D. D., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLasic%2C+DD+%22Medical+application+of+liposomes%22">Medical application of liposomes</a>. , Elsevier. (1998).</li>
<li>Samad, A., Sultana, Y., Aqil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+drug+delivery+systems%3A+an+update+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Liposomal drug delivery systems: an update review.</a> Curr Drug Deliv. 4 (4), 297-305 (2007).</li>
<li>Bezemer, J. M., Radersma, R., Grijpma, D. W., Dijkstra, P. J., van Blitterswijk, C. A., Feijen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspheres+for+protein+delivery+prepared+from+amphiphilic+multiblock+copolymers%3A+2.+Modulation+of+release+rate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Microspheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers: 2. Modulation of release rate.</a> J Control Release. 67 (2-3), 249-260 (2000).</li>
<li>Patel, A., Patel, M., Yang, X., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+protein+and+peptide+drug+delivery%3A+a+special+emphasis+on+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept+lett%22%5BJournal%5D)">Recent advances in protein and peptide drug delivery: a special emphasis on polymeric nanoparticles.</a> Protein Pept lett. 21 (11), 1102-1120 (2014).</li>
<li>Kuai, R., Li, D., Chen, Y. E., Moon, J. J., Schwendeman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoproteins%3A+nature%27s+multifunctional+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">High-density lipoproteins: nature's multifunctional nanoparticles.</a> ACS Nano. 10 (3), 3015-3041 (2016).</li>
<li>Gursky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+stability+and+functional+remodeling+of+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Structural stability and functional remodeling of high-density lipoproteins.</a> FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2627-2639 (2015).</li>
<li>McMahon, K. M., Thaxton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoproteins+for+the+systemic+delivery+of+short+interfering+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">High-density lipoproteins for the systemic delivery of short interfering RNA.</a> Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 231-247 (2014).</li>
<li>McMahon, K. M., Foit, L., Angeloni, N. L., Giles, F. J., Gordon, L. I., Thaxton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+high-density+lipoprotein-like+nanoparticles+as+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles as cancer therapy.</a> Cancer Treat Res. 166, 129-150 (2015).</li>
<li>Lerch, P. G., Förtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+a+reconstituted+high+density+lipoprotein+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications.</a> Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).</li>
<li>Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-mimicking+peptide-lipid+nanoparticles+with+improved+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting.</a> Small. 6 (3), 430-437 (2010).</li>
<li>Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. J., Ma, M., Moore, K., Farokhzad, O. C., Fisher, E. A., Mulder, W. J., Langer, R., Fayad, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+step+reconstitution+of+multifunctional+high-density+lipoprotein-derived+nanomaterials+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Single step reconstitution of multifunctional high-density lipoprotein-derived nanomaterials using microfluidics.</a> ACS Nano. 7 (11), 9975-9983 (2013).</li>
<li>Prathipati, P., Zhu, J., Dong, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+novel+HDL-mimicking+%CE%B1-tocopherol-coated+nanoparticles+to+encapsulate+nerve+growth+factor+and+evaluation+of+biodistribution%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+and+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Development of novel HDL-mimicking α-tocopherol-coated nanoparticles to encapsulate nerve growth factor and evaluation of biodistribution.</a> Eur J Pharm and Biopharm. 108, 126-135 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu çalışmada, NGF kapsüllemesi için HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;leri hazırlamak için basit bir yöntem gösteriyoruz. Proteinleri vermek için çeşitli NP dağıtım sistemleri incelenmiştir. Günümüzde birçok NP preparatı diyaliz, çözücü çöktürme ve film hidrasyonunu içermektedir. Bu işlemler genellikle karmaşıktır ve büyütme konusunda zorlayıcıdır. Bu NP gelişiminde, lipidlerin konteynırın cam duvarı ile kuvvetli yapışması olduğu ve bunun ince filmin hidratasyonunda ve katkı maddelerinin etkili bir şekilde karıştırılmasında...

Proteinler, peptitler ve nükleik asitler gibi makromoleküller umut verici ilaçlar olarak ortaya çıkmakta ve son on yılda 1 , 2 önemli derecede ilgi görmüştür. Yüksek etkililiği ve spesifik hareket modları nedeniyle, kanser, bağışıklık sistemi hastalıkları, HIV ve ilgili koşullar 3 , 4&#39;ün tedavileri için mükemmel tedavi potansiyeline sahiptirler. Bununla birlikte, büyük molekül boyutu, üç boyutlu yapı, yüzey yükleri ve hidrofilik doğa gibi fizyokimyasal özellikler, bu makromoleküllerin in vivo dağıtılmasını zorlaştırmaktadır. Bu onların klinik kullanımını önemli ölçüde engeller 4 . Mikropartiküller, polimer nanopartikülleri (NP), lipozomlar ve lipid NP&#39;leri gibi ilaç dağıtım sistemlerinde son zamanlarda kaydedilen ilerlemeler, bu güçlükleri aştı ve makro moleküllerin in vivo teslimatını önemli ölçüde geliştirdi. HoDüşük ilaç yükleme kapasitesi, düşük tuzaklanma verimi, kısa yarılanma ömrü, biyoaktivite kaybı ve istenmeyen yan etkiler de dahil olmak üzere, bu teslim kargolarıyla ilgili bazı dezavantajlar ortaya çıkmıştır 5 , 6 , 7 , 8 . Etkili taşıyıcı sistemler, araştırma konusu olmaya devam etmektedir. Ayrıca, uyuşturucu yüklü NP&#39;leri karakterize etmek için analitik yöntemlerin geliştirilmesi makromoleküller için küçük moleküllerden ziyade daha zorlayıcıdır. Yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL), apolipoproteinler ve bir fosfolipid tek tabaka tarafından kaplanan bir lipid çekirdeğinden oluşan doğal bir NP&#39;dir. Endojen HDL, SR-BI, ABCAI ve ABCG1 gibi hedef reseptörlerle etkileşimi yoluyla lipidlerin, proteinlerin ve nükleik asitlerin taşınmasında kritik bir rol oynamaktadır. Farklı terapötik ajanların verilmesi için bir araç olarak araştırılmıştır 9, 10 , 11 , 12 . HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;leri hazırlamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Diyaliz, popüler bir yaklaşımdır. Bu yöntemde, NPs, bir lipid filmi sodyum klorür çözeltisi kullanarak hidratlayarak oluşturulur. Tuz 3 saatlik tamponlarla 2 günlük bir diyaliz vasıtasıyla uzaklaştırılır. Sonikasyon yöntemleri, lipid karışımını ısıtma koşullarında 60 dakika sonikleştirerek NP&#39;leri üretir; NP&#39;ler jel kromatografisiyle ( 14) daha da arıtılır. Mikroakışkanlar, odaklanma modelinde mikrovorteks yaratarak fosfolipidleri ve apolipoprotein AI (Apo AI) solüsyonlarını karıştıran bir mikroakışkan cihaz aracılığıyla NP üretir. Açıkçası, bu yöntemler, endüstriyel ölçeklendirme için zaman alıcı, sert ve zor olabilir. Bu yazıda, sinir için yeni HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;lerin hazırlanması ve karakterize edilmesiBüyüme faktörü (NGF) kapsülleme. NGF, iki 13.6-kDa polipeptid monomeri ihtiva eden bir disülfid bağlı polipeptid homodimeridir. NP&#39;leri homojenizasyon ile hazırlamaya yönelik yenilikçi bir prosedür, ardından NP&#39;ler içine NGF&#39;nin kapsüllenmesi geliştirildi. NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;ler parçacık boyutu, boyut dağılımı, zeta potansiyeli ve in vitro salım için karakterize edildi. Biyolojik aktiviteleri, PC12 hücrelerinde nörit büyümesi için değerlendirildi. NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;lerin biyolojik dağılımı, farelerde intravenöz enjeksiyondan sonra serbest NGF&#39;nin biyolojik dağılımı ile karşılaştırıldı.

<table><tbody><tr><td>Rekombinant İnsan Beta-NGF</td><td>Creative Biomart</td><td>NGF-05H</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilkolin (PC)</td><td>Avanti</td><td>131601P</td><td>%95, Yumurta, Tavuk</td></tr><tr><td>Sfingomyelin (SM)</td><td>Avanti</td><td>860062P</td><td>Beyin, Domuz</td></tr><tr><td>Fosfatidilserin (PS)</td><td>Avanti</td><td>840032P</td><td>Beyin, Domuz</td></tr><tr><td>Kolesterilil oleat (CO)</td><td>Sigma</td><td>C9253</td><td></td></tr><tr><td>D-&alfa;-Tokoferil polietilen glikol süksinat (TPGS)</td><td>BASF</td><td>9002-96-4</td><td>E Vitamini Polietilen Glikol Süksinat</td></tr><tr><td>Protamin sülfat</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>USP test spesifikasyonlarını karşılar</td></tr><tr><td>Apolipoprotein A1, İnsan plazması</td><td>Atina Araştırma & Teknoloji</td><td>16-16-120101</td><td>671 ve mikroda 1 mg; L 10 mM NH4HCO3, pH 7.4</td></tr><tr><td>Sefaroz 4B-CL</td><td>Sigma</td><td>CL4B200</td><td>Çapraz bağlı agaroz,&nbsp; jel filtrasyon kromatografisi kolonu dolgu malzemesi</td></tr><tr><td>NGF R& için Sandviç ELISA Kiti</td><td> D sistemi</td><td>DY008</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin Sigma</td><td></td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 orta</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>SH30096.02</td><td></td></tr><tr><td>At serumu</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>PC12 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-1721</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan kuyruğu kollajen tip I</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma</td><td>31414</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetansülfonil florür (PMSF)</td> <td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Benzonyum klorür</td><td>Sigma</td><td>B8879</td><td></td></tr><tr><td><güçlü> Adı</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homojenizatör</td><td>Tekmar</td><td>T 25-S1</td><td></td></tr><tr><td>Delsa Nano HC partikül analizörü</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Delsa Nano HC</td><td></td></tr><tr><td>Float-A-Lyzer G2 Diyaliz Cihazı</td><td>Spektrum Laboratuvarları</td><td>G235036</td><td>Molekül Kesme 300 kDa</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendoff</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Polytron homojenizatör</td><td>Kinematica</td><td>PT 1200C</td><td></td></tr><tr><td>DecapiCone</td><td>&nbsp; Braintree Bilimsel A.Ş.</td><td>DC-M200</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

sinir büyümesi faktörü kapsüllemesi için yeni hdl&#39;yi taklit eden nanopartiküllerin hazırlanması ve karakterizasyonu

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Bu makalenin amacı, sinir büyüme faktörü (NGF) yüklü, yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) -impek nanopartiküller (NP) için hazırlama ve karakterizasyon yöntemlerini tanıtmaktır. HDL&#39;ler endojen NP&#39;lerdir ve terapötik ajanlar verilmesi için araçlar olarak araştırılmıştır. HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;leri hazırlamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, genellikle karmaşıktır, zaman alıcıdır ve endüstriyel ölçeklendirme için zorlanmaktadır. Bu çalışmada, yardımcı maddeleri karıştırmak ve prototip NP&#39;ler oluşturmak için bir adımlı homojenleştirme kullanılmıştır. NGF, 26 kDa&#39;lık suda çözünür bir proteindir. NGF&#39;nin HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;lerin lipid ortamına kapsüllenmesini kolaylaştırmak için protamin USP, NGF yüzeyindeki yükleri nötralize etmek için NGF ile bir iyon-çift kompleksi oluşturmak için kullanıldı. Daha sonra NGF / protamin kompleksi, prototip NP&#39;lere sokuldu. Apolipoprotein AI nihayet NP yüzeyinde kaplandı. NGF HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;ler terimde tercih edilen özellikleri gösterdiBoyut dağılımı, tuzaklanma verimi, in vitro serbest bırakma, biyo-aktivite ve biyo-dağılım. HDL&#39;yi taklit eden NP&#39;lerde dikkatli bir tasarım ve homojenleştirme araştırması ile prosedürü büyük ölçüde basitleştirildi ve NP&#39;ler ölçeklenebilir hale getirildi. Üstelik boşaltılan NGF&#39;nin NP&#39;lerden ayrılması, güvenilir in vitro salınım çalışmaları yapılması ve NP&#39;lerin biyoaktivitesinin ölçülmesi gibi çeşitli zorluklar aşılmıştır.

Bir iyon çift stratejisi ile hazırlanan, HDL&#39;yi taklit eden α-tokoferol kaplı NGF NP&#39;lerin mühendislik şeması Şekil 1&#39;de gösterilmektedir. NGF&#39;nin yüzey yüklerini nötralize etmek için, protamin USP, NGF ile bir kompleks oluşturmak için bir iyon çift ajan olarak kullanılmıştır. Biyoaktiviteyi korumak için HDL&#39;yi taklit eden prototip NP&#39;ler ilk önce homojenleştirme kullanılarak üretildi; Daha sonra, NGF / protamin kompleksi, prototip NPS içine kapsü...

Basit homojenizasyon, sinir büyüme faktörünü kapsüllemek için yeni, yüksek yoğunluklu, lipoprotein-taklit nanoparçacıklar hazırlamak için kullanıldı. Bu makalede, nanoparçacık hazırlığı, in vitro karakterizasyon ve in vivo çalışmalar için zorluklar, ayrıntılı protokoller anlatılmıştır.

Sinir Büyümesi Faktörü Kapsüllemesi için Yeni HDL&#39;yi taklit eden Nanopartiküllerin Hazırlanması ve Karakterizasyonu

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

Bu makalenin genel amacı, sinir büyüme faktörü yüklü, yüksek yoğunluklu lipoprotein benzeri nanopartiküller için hazırlama ve karakterizasyon yöntemlerini tanıtmaktır. Normal, yüksek yoğunluklu lipoprotein benzeri nanopartikülleri hazırlamak için basit homogenizasyon kullanılmıştır. Prosedür basit ve ölçeklendirilebilir niteliktedir.Ayrıca, nanoparçacık hapsedilme verimliliğini, ayrıca nanoparçacıklardaki NGF ve APOA1'i önemli ölçüde artırmıştır. Yüklenmemiş NGF'nin NGF nanoparçacıklarından ayrılması, güvenilir in vitro yarıçap çalışmalarının yürütülmesi ve NGF nanoparçacıklarının biyoyararlanımı dahil olmak üzere, bir nanoparçacığın karakterizasyonuna yönelik çeşitli zorlukların üstesinden gelinmiştir. Başlamak için, 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpünde 10 mikrolitre NGF ile 10 mikrolitre protamin USP'yi karıştırın ve kompleksin oluşması için oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.Ardından, cam bir şişeye 59 µL fosfatidilkolin ve 11 µL sfingomiyelin ekleyin. Ayrıca dört µL fosfatidilserin, 15 µL kolesteril oleat ve 45 µL tokoferil polietilen glikol süksinat ekleyin. Karıştırın ve etanolü hafif bir nitrojen akımı altında yaklaşık beş dakika boyunca uçurun.Tüm eksipiyanlar cam şişenin

preparation-characterization-novel-hdl-mimicking-nanoparticles-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Kaynak: Rosenberg, M., et al. Sinir büyüme faktörünün taşıyıcıları olarak gözenekli silikon filmlerin tasarlanması. J. Vis. Uzm. (2019).Bu video, PC12 hücre farklılaşmasını desteklemek için sinir büyüme faktörünün (NGF) sürekli salınımı için parçalanabilir bir nanoyapılı gözenekli silikon (PSi) filmin kullanımını göstermektedir. NGF, elektrostatik etkileşimler yoluyla filmin gözeneklerine adsorbe edilir ve difüzyon ve iskele bozulması yoluyla yavaş yavaş ortama salınır. Bu kontrollü uygulama,...

Sıçan Feokromasitoma 12 Hücrelerinde Gözenekli Bir Silikon Film Kullanılarak Sinir Büyüme Faktörünün Sürekli Verilmesi

Kaynak: Zhu, J., et. al., Sinir Büyüme Faktörü Kapsüllemesi için Yeni HDL Taklit Eden Nanopartiküllerin Hazırlanması ve Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, potansiyel nörotrofik dağıtım uygulamaları için protamin destekli kapsülleme ve lipid bazlı kendi kendine montaj kullanarak NGF yüklü HDL'yi taklit eden nanopartiküllerin aşamalı montajını göstermektedir.

Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein Taklit Eden Nanopartiküllerde Kapsülleyici Sinir Büyüme Faktörü

Bu protokol, nöronları yönlendirmek için doku mühendisliği iskeleleri geliştirmek için elektrospinning ve mikroküreleri birleştirir. Sinir büyüme faktörü PLGA mikroküreleri içinde kapsüllendi ve Hyaluronik Asit (HA) fibröz iskelelere elektrospre edildi.  Protein biyoaktivitesi, iskelelerin birincil civciv Dorsal Kök Gangliyonları ile tohumlanması ve 4-6 gün boyunca kültürlenmesi ile test edildi.

Lifli iskelelerinin içine Microspheres ibra Elektroeğirme Büyüme Faktörü

Bu protokolün amacı, bir kök hücre hedef arama faktörü olan SDF-1α'yı dekstran sülfat-kitosan nanopartiküllerine dahil etmektir.  Elde edilen parçacıklar, boyutları ve zeta potansiyellerinin yanı sıra nanoparçacıklardan SDF-1α'nın içeriği, aktivitesi ve in vitro salım hızı için ölçülür.

SDF-1α-Kitosan-Dekstran Sülfat nano partiküllerin hazırlanması ve Karakterizasyonu

Bir sıvı kristal nanopartikül (LCNP) nanocarrier canlı hücrelerin plazma zarına bir hidrofobik yük sürekli verilme için uygun bir araç olarak kullanılarak.

Sıvı Kristal Nanopartikül Carrier bir Hidrofobik Kargo Encapsulated, hedeflenen Plazma Zarı Teslimat

Burada, tasarım ve parçalanabilir taşıyıcıları için sinir büyüme faktörü (NGF) olarak nanostructured gözenekli silisyum (PSI) filmleri imal için bir protokol mevcut. Nöronal farklılaşma ve PC12 hücreleri ve fareler dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar akıbet üzerine tedavi NGF yüklü PSi taşıyıcıları ile karakterizedir.

Gözenekli silisyum filmleri sinir büyüme faktörü taşıyıcı olarak tasarlama

Bu makalede falcarindiol lipid kaplı 74 nm nano tanecikleri encapsulation. Nano tanecikleri lipid damlacıkları içine insan kök hücreleri tarafından hücresel alımını floresan ve confocal görüntüleme tarafından izlenir. Nano tanecikleri değişen solvent hızlı enjeksiyon yöntemiyle cihazlarında ve büyüklükleri dinamik ışık saçılma tekniği ile ölçülür.

Falcarindiol tarafından insan mezenkimal kök hücre içeren yeni Lipid kaplı nano tanecikleri alımını

Bu çalışmada nanopartikül karakterizasyonu takip nanoliposome hazırlık için ince lipid film yöntemi kullanılarak klasik hidrasyon açıklanır. A 47 kDa-hidrofilik ve küresel protein, tarin, başarıyla istikrarı artırmak için bir strateji olarak kapsüllenir, hızlı açıklık önlemek, ve kontrollü salınımı teşvik. Bu yöntem hidrofobik moleküllerkapsülasyonuna adapte edilebilir.

Biyoaktif Hidrofilik Globüler Proteinlerin Tuzakları Için Nanoliposomes Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Lipid nanopartikülleri mRNA ve DNA kapsülleme için mikroakışkan karıştırma platformu yaklaşımı kullanılarak geliştirilmiştir.

Mikroakışkan Karıştırma Platformu Kullanarak Gen Teslimatı için Lipid Nanopartiküllerinin Formülei ve Karakterizasyonsu

Burada, nanodiskler içeren biyoaktif ajanların üretimini ve karakterizasyonunu açıklıyoruz. Amfoterisin B nanodiskleri, protokolü aşamalı olarak tanımlamak için örnek olarak alınmıştır.

Nanodisk İçeren Biyoaktif Ajanın Formülasyonu ve Karakterizasyonu

Keşfedin sinir büyüme faktörü yüklü HDL taklit eden nanopartiküllerin hazırlanması ve karakterizasyonu. Basit homojenizasyon yöntemi ile yüksek kapsülleme verimliliği sağlanır ve nörolojik tedaviler için ölçeklenebilir bir ilaç taşıma sistemi geliştirilir.

Sinir Büyümesi Faktörü Kapsüllemesi için Yeni HDL'yi taklit eden Nanopartiküllerin Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet