Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Kantitatif kütle spektrometrisi için lipid damlacıklarını izole etmenin genel amacı, bu organellerin örneğin hepatit C virüsü gibi patojenlerin replikasyonundaki işlevini anlamaktır. Bu yöntem, enfeksiyöz hastalıklar alanında patojenlerin replikasyon için neden damlacıklara bağlandığı gibi temel sorulara cevap verebilir. Lipid damlacıklarının izolasyonu altı ila yedi saat içinde gerçekleştirilebilir.

Bu prosedür sırasında keratin kontaminasyonundan kaçınmak önemlidir. Başlamak için, DMEM ortamının her şişesinden 50 mililitre çıkarın ve 50 mililitrele diyalize edilmiş fetal calf serum ekleyin. Ardından, 50 miligram karbon 13 işaretli lizin ve 50 miligram karbon 13 işaretli arjiniyi bir mililitre ortamda çözün.

İyice karıştırın ve amino asitleri FCS içeren DMEM besiyerine ekleyin. Ardından PenStrep ve glutamin ikamesini ekleyin. Besiyerini 0,45 mikronluk bir filtre kullanarak steril filtreleyin ve şişeyi ağır SILAC besiyeri olarak etiketleyin.

Hafif besiyerini hazırlamak için, 50 miligram arjinin ve 50 miligram lizin kullanarak bu adımları tekrarlayın. Şişeyi hafif SILAC besiyeri olarak etiketleyin. Hücreleri tripsinizleyin ve altı kuyucuklu bir kültür plağının iki kuyucuğuna bölün.

Bir kuyucuk iki mililitre ağır SILAC ortamı, diğeri ise iki mililitre hafif SILAC ortamı içermelidir. Hücreleri en az altı pasaj boyunca kültüre edin. Altı pasajdan sonra, ağır amino asitlerin inkorporasyonu %95'in üzerinde olmalıdır. İnkorporasyon etkinliğini analiz etmek için ağır ve hafif etiketli hücre popülasyonlarından bir milyon hücre hasat edin.

Hücreleri 1X PBS ile yıkadıktan sonra, 160 ×g'de ve dört °C'de beş dakika boyunca santrifüjleyerek peletleyin. Hücre peletlerini 150 µL MS-tamponu içinde yeniden süspande edin. Ardından, hücreleri 30 dakika boyunca buz üzerinde inkube edin.

Ardından, hücreleri dört santigrat derecede sonikasyonla lizleyin. Hücre kalıntılarını, 11.000 x g'de ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj ederek uzaklaştırın. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve protein konsantrasyonunu deterjanla uyumlu bir protein analizi ile belirleyin.

Ardından, 75 µg proteini altı x örnek tamponu ile karıştırın. 95 °C'de beş dakika kaynattıktan sonra, proteinleri SDS yürütme tamponu içinde 180 V'ta yaklaşık bir saat boyunca SDS-PAGE ile ayırın. Coomassie boyamasının ardından, aynı protein bandını kesin ve MS analizi ile inklüzyon etkinliğini analiz edin.

Hafif hücre popülasyonunu, fibröz stoklarla 37 °C'de dört saat boyunca inkübe ederek hepatit C raporlayıcı virüsü ile enfekte edin. HCV enfekte hafif hücreleri ve enfekte olmamış ağır hücreleri metin protokolünde açıklandığı şekilde genişletin. Blastisidin direnç geni taşıyan bir HCV suşu kullanılıyorsa, HCV pozitif hücreleri seçmek için hafif ortama mililitre başına 10 µg blastisidin S ekleyin.

Lipid damlacığı izolasyonundan bir gün önce, hücreleri PBS ile yıkayın, tripsinizle ayırın ve uygun hafif veya ağır besiyerinde yeniden süspanse edin. Hücreleri bir Neubauer sayım odası kullanarak sayın. Ardından, her popülasyondan yedi milyon hücreyi 150 santimetrekarelik bir hücre kültürü kabına ekleyin.

Hafif ve ağır hücre popülasyonunun her biri için en az beş plak hazırlayın. Hücreleri her plakta 30 milliliters ortamda gece boyunca kültüre edin. Ertesi gün, ortamı uzaklaştırın ve hücreleri 1X PBS ile yıkayın.

Hücreleri bir hücre kazıyıcı kullanarak 1X PBS içinde ayırın. Her iki hücre popülasyonu daha önce yapıldığı gibi sayıldıktan sonra, 50 mililitrelik santrifüj tüplerine eşit sayıda hücre alın. Hücreleri 160 times g'de ve dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün.

PBS'yi uzaklaştırın ve hücre peletini bir mililitre sükroz tamponunda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu sıkıca oturan bir Ounce homogenizöre aktarın ve hücreleri buz üzerinde 200 darbeyle lizleyin. Ardından, lizatı 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve çekirdekler ile hücre kalıntılarını 1.000 ×g'de ve dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca çöktürün.

Santrifüjden sonra, girdi kontrolü olarak post-nükleer fraksiyonun (PNS) 25 µL'lik bir alikotunu -20 °C'de saklayın. PNS fraksiyonunun geri kalanını santrifüj tüpünün dibine yerleştirin ve üzerine yaklaşık 3 mL lipid damlacığı yıkama tamponu ekleyin. 4 °C'de ve 100,000 ×g hızında iki saat boyunca santrifüjleyin.

Santrifüj işleminin ardından, tüpün üst kısmındaki yüzen lipid damlacığı fraksiyonunu eğimli küt uçlu bir kanül kullanarak toplayın. Ardından, lipid damlacığı fraksiyonunu bir santrifüj tüpüne yerleştirin, üzerine lipid damlacığı yıkama tamponu ekleyin ve santrifüj adımını tekrarlayın. Lipid damlacıklarının gradyanın üst kısmından toplanması deneyim gerektirir.

Kesir ne kadar büyükse bu işlem o kadar kolaylaşır. Pratik yapmak için yağ hücrelerini kullanabilirsiniz. Ya da lipid damlacıklarının miktarını artırmak için hücrelerinizi oleat ile besleyebilirsiniz.

Yüzen lipid damlacığı fraksiyonunu, tüpün üst kısmından eğimli küt uçlu bir kanül kullanarak tekrar toplayın. Lipid damlacıklarını yeni bir 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 500 mikrolitre lipid damlacığı yıkama tamponu ekleyin. Ardından, örneği 21.000 ×g hızda ve dört santigrat derecede 20 dakika boyunca santrifüjleyin.

Alttaki yıkama tamponunu bir jel yükleme pipeti ucuyla uzaklaştırın ve yıkama adımını üç kez tekrarlayın. Yıkama tamponunun son kez uzaklaştırılmasının ardından, protein içeriğinin belirlenmesi için 5 µL lipid damlacığı fraksiyonunu 10 µL NP 40 lizis tamponu ile karıştırın. Enfeksiyöz materyalle çalışılıyorsa, virüsü inaktive etmek için örneği buz üzerinde bir saat boyunca inkübe edin.

Bu aşamada, lipid damlacığı fraksiyonları -20 °C'de saklanabilir. Ardından, en az 35 µg proteine karşılık gelen hacmi 4x yükleme boyası ile karıştırın. Enfeksiyöz materyallerle çalışılıyorsa, virüsü inaktive etmek için karışımı buz üzerinde bir saat boyunca inkübe edin.

Numuneyi 95 °C'de beş dakika boyunca kaynatın. Ardından, metin protokolünde açıklandığı şekilde, numuneyi tandem kütle spektrometrisi ile eşleştirilmiş sıvı kromatografisine hazırlamak için SDS-PAGE ve ardından Coomassie boyaması gerçekleştirin. Lipid damlacığı saflığını analiz etmek için, bir ila iki lipid damlacığı fraksiyonu alikotunu NP 40 liziz tamponu ile seyreltin.

Giriş kontrol fraksiyonlarını aynı tamponla bire on oranında seyreltin. Enfeksiyöz materyallerle çalışılıyorsa, virüsü inaktive etmek için örnekleri buz üzerinde bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, deterjanla uyumlu bir protein analizi ile protein seviyesini belirleyin.

Ardından, eşit miktarda protein ile 6x örnek tamponu karıştırın ve enfeksiyöz materyalle çalışılıyorsa virüsü inaktive etmek için örnekleri bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. Son olarak SDS-PAGE işlemine geçin ve proteinleri, 80 volt ile 90 dakika boyunca tank blotting yöntemiyle bir nitroselüloz membrana aktarın. Burada, çekirdek sonrası ve lipid damlacığı fraksiyonlarının temsili bir western blot analizi gösterilmektedir.

Western blot, lipid damlacığı fraksiyonlarında lipid damlacığı belirteç proteinleri perilipin iki ve perilipin üçün zenginleştiğini ve diğer hücresel kompartman belirteçlerinin azaldığını açıkça göstermektedir. Post-nükleer ve lipid damlacığı fraksiyonları ayrıca Coomassie blue ve gümüş boyama ile analiz edilebilir. Bu ısı haritası, analiz edilen hücrelerin lipid damlacığı fraksiyonlarında tanımlanan proteinlerin peptit sayısını ve protein kapsama yüzdesini göstermektedir.

Son ısı haritası, HCV enfeksiyonunun lipid damlacıklarını günlük olarak nasıl değiştirdiğini göstermektedir. Zenginleşmiş lipid damlacığıyla ilişkili proteinler kırmızıyla, azalmış lipid damlacığıyla ilişkili proteinler ise maviyle belirtilmiştir. Bu yöntemin temel avantajı, hücreleri izolasyon öncesinde ve lipid damlacığı izolasyonu öncesinde karıştırmamızdır; böylece hücre lizisi ve izolasyon basamakları sırasında meydana gelebilecek hataları minimize edebiliriz.