CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

Bu tekniğin genel amacı, CRISPR/Cas9 ile indüklenen insersiyon-delesyon mutant klonlarının yüksek kapasiteli bir şekilde genotiplendirmesini yapmaktır. Bu yöntem, seçilen bir SAIL modelinde belirli bir genin nakavt edilmesinin fenotipik etkisi gibi genetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çok yönlü ve minimumdan yüksek kapasiteye kadar tarama imkanı sunmasıdır.

Bu yöntem insan kanser genetiği hakkında içgörü sağlayabilse de; insan, kök ve primer hücreler veya insan dışı kaynaklı hücreler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, kısa tandem tekrarlar veya STR tipleme analizleri gerçekleştirdiğimizde edindik. Prosedüre başlamak için, seçilen hücreleri floresan işaretli cas9 ve tek kılavuz RNA'yı birlikte eksprese eden bir plazmid ile transfekte edin.

Hücreleri tripsinizleyin ve yaklaşık 3.500 floresan işaretli klon seçin. Klonları 500, 1.000 ve 2.000 hücrelik porsiyonlar halinde, sekiz mililitre penisilin streptomisin takviyeli büyüme ortamı içeren 10 santimetrelik kaplara ekin. Hücreleri %5 CO2 atmosferinde 37 °C'de, tek hücreli koloniler çıplak gözle görülebilir hale gelene kadar her beş günde bir ortamı yenileyerek inkübe edin.

Ardından, bireysel kolonileri yaklaşık beş mikrolitre büyüme ortamı ile 200 mikrolitrelik bir pipete aspire edin. Her bir koloniyi, 200 mikrolitre büyüme ortamı içeren ayrı bir kuyucuğa aktarın. Hücreleri yeniden süspansiyona getirmek için her bir karışımı defalarca pipetleyerek yukarı-aşağı karıştırın.

Hücreleri, %50 ila %90 konfluens düzeyine ulaşana kadar daha önce açıklanan koşullar altında inkübe edin. Kuyucuklardaki fazla kültür ortamını uzaklaştırın ve her kuyucuğa 25 µL fenol kırmızısı içermeyen %0,05 trypsin EDTA ekleyin. Hücreleri 37 °C'de 7 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, tripsinizlenmiş hücreleri yeniden süspansiyona getirmek için karışımları tekrar tekrar pipetleyerek karıştırın. Hücrelerin kuyu duvarlarından ayrıldığını doğrulamak için kuyuları bir mikroskop altında inceleyin. Bireysel klonların replikalarını hazırlamak için, her bir hücre süspansiyonundan beş mikrolitre boş bir 96 kuyucuklu kültür plakasına aktarın.

Her bir kuyucuğa 200 µL büyüme besiyeri ekleyin. Ardından, boş bir 96 kuyucuklu PCR plağının kuyucuklarına 10 µL lizis tamponu yükleyin. Her bir hücre süspansiyonundan beş µL daha bu 96 kuyucuklu plağa aktarın.

Sıvı, kuyucukların dibine çökecek kadar plakayı kısaca santrifüjleyin. Her bir hücre süspansiyonunun kalan 15 mikrolitresine 200 mikrolitre büyüme ortamı ekleyin. Klonların knockout durumunun daha sonra doğrulanması için orijinal süspansiyonu ve replikaları inkübasyon koşulları altında saklayın.

Ardından, hücreleri liziz tamponu içerisinde tamamen liz etmek için termal döngü uygulayın. Lizatları kısaca santrifüj edin. Lizatları 40 µL nükleaz içermeyen su ile seyreltin.

Seyreltilmiş lizatları vorteksleyin ve kısa süreliğine santrifüjleyin. Floresan PCR gerçekleştirmeden önce, lizlemiş yabani tip hücreler üzerinde birkaç çift işaretlenmemiş primerin özgüllüğünü tasarlayın ve test edin. Optimal primer çiftini belirleyin ve florofor ile işaretlenmiş ileri primerler ile işaretlenmemiş geri primeri temin edin.

Sonuçlar saflaştırılmış genomik DNA kullanmaya göre farklılık gösterebileceğinden, primerlerin özgüllüğünü vorteksli hücreleri kullanarak ve ev yapımı lizis tamponu ile liz yaparak test ettiğinizden emin olun. Hedef bölgeleri çoğaltmak için etiketli primerleri kullanarak, seyreltilmiş lizatlardan üç mikrolitre ile 20 mikrolitrelik floresan PCR reaksiyonları gerçekleştirin. PCR amplikonlarının beş mikrolitresini %1'lik agaroz jele yükleyerek amplikonların boyutunu ve göreceli miktarlarını değerlendirin.

Numune hazırlığına başlamak için, vahşi tip ve CRISPR/Cas9 hedefli DNA amplikonlarını nükleaz içermeyen su kullanarak yaklaşık 2,5 nanograms per microliter konsantrasyona seyreltin. Seyreltilmiş vahşi tip ve hedefli DNA numunelerinden eşit hacimlerde karıştırın. 96 kuyucuklu bir PCR plakası kuyucuklarına, 29'a bir oranında deiyonize formamid ve boya işaretli boyut standardı karışımından dokuz mikrolitre ve karıştırdığınız amplikonlardan bir mikrolitre yükleyin.

Plakayı sıkıca kapatın ve örnekleri bir PCR termosiklatör ile 95 °C'de üç dakika boyunca ısıtın. Isıtma işleminin hemen ardından, plağı üç dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Bir genetik analizör ile kapiler jel elektroforezi gerçekleştirin.

Elektroforez tamamlandıktan sonra, verileri analiz yazılımına aktarın ve verilerin grafiğini çizin. Uygun boya kanalındaki verileri inceleyerek boyut standardının kalitesini doğrulayın. Ardından, hedeflenmemiş vahşi tip kontrolleri ve hedeflenmiş klonlar için boya kanalı değerlerini txt formatında dışa aktarın.

Bu dosyadan boya kimliklerini, örnek dosya adlarını, fragman boyutlarını ve pik yüksekliği değerlerini hesap tablosu yazılımına aktarın. Her örnekte, hedeflenen klon ile hedeflenmemiş vahşi tip kontrol arasındaki fragman boyutu farkını hesaplayın. Üç baz çiftinin katı olmayan indel mutasyonlarına sahip klonları belirleyin.

Saklanan replikalardan seçilen klonları seri olarak genişletin. Klon genotiplerini belirlemek ve klonların nakavt durumunu doğrulamak için Sanger dizileme ve western blot analizi gerçekleştirin. Hepatoselüler karsinom hücre hattı HEPG2, Nap1L1 genine karşı bir CRISPR/Cas9 konstrüktü ile hedeflenmiştir.

Hedeflenmemiş vahşi tip aleller ve CRISPR/Cas9 ile hedeflenmiş aleller, sırasıyla yeşil ve mavi floroforlarla işaretlenmiş primerler kullanılarak PCR ile amplifiye edildi. Özel olarak optimize edilmiş bir floresan PCR protokolü kullanılarak, hedeflenen klonların amplikonları yüksek verimle elde edildi. Münferit klon örneklerinde yeşil ve mavi floresan boyalar arasında herhangi bir girişim gözlenmedi.

Kılcal jel elektroforezi ile belirlenen fragman boyutlarının analizi, burada gösterilen iki klondan birinde 1 ve diğerinde 10 baz çiftinin silindiğini ortaya koymuştur. Sanger sekanslama sonuçları, kılcal jel elektroforezi analizi ile tutarlılık göstermiştir. Western blot analizi, seçilen klonların NAP1L1 eksprese etmediğini doğrulamıştır.

Bu prosedürü uygularken, çok sayıda örnek söz konusu olduğu için örneklerinizi dikkatle etiketlemeyi ve ışığa duyarlı oldukları için florofor işaretli amplikonların maruziyet süresini minimuma indirmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, ilgi duyulan genlerin tamamen nakavt edilip edilmediği gibi ek soruları yanıtlamak için kantitatif RT PCR, western blot analizi ve Sanger dizileme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kapiler jel elektroforezi ile eşleştirilmiş floresan PCR kullanarak CRISPR/Cas9 kaynaklı mutant klonların yüksek kapasiteli bir şekilde nasıl genotiplendirileceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.