Çok Elektrodlu Diziler (ÇÇA'lar) Kullanan İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilmiş Kardiyomiyositlerin (hPSC-CM'ler) Elektrofizyolojik Analizi

Bu prosedürün genel amacı, insan pluripotent kök hücrelerinden türetilen kardiyomiyositleri ayrıştırmak ve tipik elektriksel sinyalleri, diğer bir adıyla alan potansiyellerinin süresini ve frekansını ölçmek ve nicelleştirmek için çok elektrotlu dizilere ekmektir. Bu yöntem, mutasyon taşıyan kardiyomiyositler ile kontroller arasındaki elektrofizyolojik farkların neler olduğu gibi alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hasta hücrelerinden türetilen insan kardiyomiyositleri üzerinde ilaç taramasına olanak tanımasıdır.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır. Disosiyasyon ve ekim aşamaları, başarılı elektrik sinyali kaydı için esastır. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, iyi veya kötü kaliteli elektrik sinyallerinin ayırt edilmesinin basit olmaması ve serbest potansiyel analizinin deneyim gerektirmesi nedeniyle zorluk yaşayacaklardır.

Bu prosedüre başlamak için temiz çipleri standart 10 santimetre çapında plastik steril bir Petri kabına yerleştirin. Ardından, inkübatöre yerleştirildiğinde çip üzerindeki küçük hacimli kültür ortamının çekilmesini önleyecek nemlendirilmiş bir bölme oluşturmak için Petri kabına sekiz mililitre steril distile su ekleyin. Daha sonra, kardiyomiyositlerin, elektrot dizisinin bulunduğu çipin merkezine ekilmesini sağlamak için özel yapım PoliTetraFluoroEtilen halkalar kullanın.

Kültür kabininde halkaları etanolden çıkarın. Bunları kapaksız steril bir Petri kutusuna yerleştirin ve halkaların kabinde kurumasını bekleyin. Ardından, alevle sterilize edilmiş cımbızlar kullanarak kuru bir halkayı bir MEA çipinin içine yerleştirin.

Halkanın içine 50 µL 40 µg/mL fibronectin ekleyerek elektrotları kaplayın. Ardından Petri kabını kapağıyla kapatın ve MEA çipini içeren kabı dikkatlice bir inkübatöre aktarın. Sonrasında, MEA çipini içeren kabı hücre kültürü kabinine taşıyın.

MEA çipini kullanmadan önce, PTFE halkasını yerinden oynatmadan, P200 pipet veya davlumbazdaki vakum sistemi kullanarak 50 µL fibronectin aspire edin. Pipet ucunu açılı tutarak elektrotlara hiçbir katı nesnenin temas etmediğinden emin olun. Ardından, eşit şekilde dağıldığından ve halkanın yüzmediğinden emin olarak nazikçe 950 µL LI-BPEL medyumu ekleyin.

Ardından kabı inkübatöre geri yerleştirin. Bu, atan kardiyomiyositlerin başlangıç kültürüdür. Bir doku kültürü kabininde, hPSC-CM'ler kültür kuyusundaki besiyerini aspire edin.

Kültürü yıkamak için her kuyucuğa kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1 ila 2 mililitre PBS ekleyin ve PBS'yi aspire edin. Ardından her kuyucuğa 500 mikrolitre disosiyasyon enzimi ekleyin. Numuneyi 37 °C'de 5 dakika boyunca inkübe edin.

Beş dakika sonra, enzimi seyreltmek için her kuyucuğa bir mililitre LI-BPEL ekleyin. hPSC-CM'lerin tek tabakasını, P1000 pipetle nazikçe kazıyarak ayırın. Ardından hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe toplayın.

Ardından, geri kalan tüm hücreleri ve hücre kümelerini toplamak için kuyucuğu bir mililitre LI-BPEL ile durulayın. Final hacmi yaklaşık beş ila altı mililitreye ulaşacak şekilde iki ila üç mililitre daha LI-BPEL ekleyin ve hücre kümelerini ayrıştırmak için beş mililitrelik bir pipet ile üç ila beş kez nazikçe yukarı-aşağı pipetleyin. Bunu takiben, hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300 ×g'de santrifüjleyin.

Ardından, hücre peletini yerinden oynatmadan süpernatantı uzaklaştırın. Daha sonra hücre peletini 250 µL LI-BPEL içinde yeniden süspande edin. Sonrasında, hücre süspansiyonunu pipetleyerek doğrudan elektrot dizisinin üzerindeki PTFE halkasının merkezine, her MEA için 50 µL hücre süspansiyonu olacak şekilde dağıtın.

MEA'ları dikkatlice 37 degrees celsius sıcaklıktaki inkübatöre aktarın ve hücrelerin gece boyunca tutunmasını sağlayın. Ekimden bir gün sonra, steril bir ortamda steril cımbız kullanarak halkayı dikkatlice çıkarın. Halkayı %80 etanol ile durulayın.

Ve bunu %80 taze etanol içeren 50 milliliter tüpünde saklayın. Ardından, MEA çipinden nazikçe 500 micro liters besiyeri çıkarın. Ve buna 500 micro liters taze LI-BPEL ekleyin.

Bunlar, halka çıkarıldıktan sonraki atan kardiyomiyositlerdir. Ardından, MEA'ları 37 °C'deki inkübatöre aktarın. Daha sonra, halka çıkarılmasından bir gün sonra başlayarak bir haftaya kadar MEA'lar üzerindeki hPSC-CM'lerin elektriksel aktivitesini ölçün.

Şimdi MEA düzeneğine bağlı yazılım paketini başlatın. Ardından, ölçümleri kaydetmek için TCX-Control üzerinden sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın. Bundan sonra, MEA çipini içeren kabı inkübatörden çıkarın.

MEA çipini kaplamdan çıkarın ve kalan suyu emmesi için bir peçetenin üzerine yerleştirin. Plakanın dış yüzeyini dikkatlice bir peçeteyle silin ve sinyal gürültüsüne neden olabilecek tüm kalıntı suları veya debrisleri temizlemek için %100 etanol ile nemlendirilmiş bir pamuklu çubuk kullanın. Ardından, spontan aktiviteyi tespit etmek için MEA plakasını 37 °C sıcaklıktaki bir kayıt başlığı aşamasına transfer edin.

MC Rack'ı açın ve MEA donanımını yüklemek için edit'e tıklayın. Yeni bir protokol oluşturmak için, protokole farklı kaydedici ve görüntüleme pencereleri eklemek üzere edit açılır menüsünü kullanın. Ardından, oynat düğmesine tıklayarak protokolü oynatma modunda başlatın.

Sinyaller net bir şekilde görünür R pikleri ve T pikleri sergiliyorsa, adaptasyon aşamasını tamamlamak için 10 ila 15 dakika bekleyin. Deneyi başlatmak için "record" (kaydet) düğmesine tıklayın, ardından "play" (oynat) düğmesine basarak kararlı durumu belirlemek için baseline koşulları altında 10 dakika boyunca veri toplayın. En iyi sinyale sahip elektrotları, daha sonra analiz için kolayca tanımlanabilmeleri ve dışa aktarılabilmeleri için işaretleyin.

Bir ilaç yanıt değerlendirmesi için, her 10 dakikada bir artan konsantrasyonlarda ilaç ekleyin. Protokolün sonunda kaydı sonlandırmak için durdur düğmesine tıklayın. Burada, RQ ve T piklerinin yüksek sinyal-gürültü oranıyla net bir şekilde görüldüğü, kaliteli bir izleme sunan MEA ile kaydedilmiş temsili izler yer almaktadır.

RQ ve T piklerinin net olarak görülmediği düşük kaliteli bir iz ve RQ ile T piklerinin net olduğu ancak sinyal-gürültü oranının düşük olduğu gürültülü bir iz. Ve burada, hPSC-CM'ler kullanılarak MEA deneyleri sırasında kaydedilebilen, farklı morfolojilere sahip yüksek kaliteli alan potansiyeli izlerinin temsilci örnekleri yer almaktadır. Gölgeli alan, analiz sırasında ölçülen QT aralığını temsil eder.

MEA'daki alan potansiyeli, aksiyon potansiyelinin birinci türevine benzediği için, alan potansiyeli izlerinin integrali, tam aksiyon potansiyeli repolarizasyonlarına yakın olan T dalgalarının teorik gösterimleri olarak hesaplanmıştır. Bu prosedür uygulanırken, güvenilir ve tutarlı sinyaller sağlamak için mümkün olan en yüksek elektrot sayısının seçilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, elektriksel fenotip ile ilgili spesifik gen ekspresyonu veya spesifik iyon akım yoğunlukları gibi ek soruları yanıtlamak için kantitatif gerçek zamanlı PCR veya tek hücre yama kenetleme (patch clamp) gibi diğer yöntemler kullanılabilir.

Bu tekniğin geliştirilmesinin ardından, kök hücre alanındaki araştırmacıların insan pluripotent kök hücrelerinden türetilen kardiyomiyositleri kullanarakle kardiyak aritmileri ve in-vitro farmakolojiyi keşfetmelerinin önü açılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, elektrofizyolojik ölçümler ve ilaç taraması için insan pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositlerin MEA'lara nasıl disosiye edileceği ve ekileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İlaçlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken standart GLP gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.