Çok Elektrodlu Diziler (ÇÇA'lar) Kullanan İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilmiş Kardiyomiyositlerin (hPSC-CM'ler) Elektrofizyolojik Analizi
12 Mayıs 2017
İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden (hPSC-CM) türeyen kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik karakterizasyonu, kardiyak hastalık modellemesi ve ilaç yanıtlarının belirlenmesi için çok önemlidir. Bu protokol, hPSC-CM'lerin çok elektrotlu diziler üzerinde ayrılması ve plakalanması, alan potansiyelinin ölçülmesi ve QT ve RR aralıklarının analiz edilmesi için gerekli olan bilgileri sağlar.
Bu prosedürün genel amacı, insan pluripotent kök hücrelerinden türetilen kardiyomiyositleri ayırmak ve alan potansiyeli olarak da adlandırılan tipik elektrik sinyallerinin süresini ve frekansını ölçmek ve ölçmek için bunları çok elektrotlu diziler üzerine yerleştirmektir. Bu yöntem, mutasyon taşıyan kardiyomiyositler ve kontroller arasındaki elektrofizyolojik farklılıkların neler olduğu gibi alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hasta hücrelerinden türetilen insan kardiyomiyositleri üzerinde ilaç taramasına izin vermesidir.
Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Başarılı elektrik sinyali kaydı için ayrışma ve kaplama adımları çok önemlidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edeceklerdir, çünkü iyi veya kötü kaliteli elektrik sinyallerinin tanımlanması önemsiz değildir ve serbest potansiyelin analizi deneyim gerektirir.
Bu işleme başlamak için, temiz talaşları standart 10 santimetre çapında plastik steril bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra, inkübatöre yerleştirildiğinde çip üzerindeki küçük hacimli kültür ortamının çekilmesini önleyecek nemlendirilmiş bir oda oluşturmak için Petri kabına sekiz mililitre steril damıtılmış su ekleyin. Ardından, elektrot dizisinin bulunduğu çipin merkezinde kardiyomiyositlerin kaplanmasını sağlamak için özel yapım PoliTetraFloroEtilen halkaları kullanın.
Kültür davlumbazında halkaları etanolden çıkarın. Bunları kapaksız steril bir Petri kabına koyun ve halkaların davlumbazda kurumasını bekleyin. Ardından, alevle sterilize edilmiş cımbız kullanarak bir MEA çipinin içine kuru bir halka yerleştirin.
Halkanın içine mililitre fibronektin başına 50 mikrolitre 40 mikrogram ekleyerek elektrotları kaplayın. Bundan sonra, Petri kabını kapakla örtün ve MEA çipini içeren çanağı dikkatlice bir inkübatöre aktarın. Bunu takiben, MEA çipini içeren çanağı hücre kültürü başlığına aktarın.
MEA çipini kullanmadan önce, PTFE halkasını yerinden çıkarmadan bir P200 pipeti veya davlumbazda bir vakum sistemi kullanarak 50 mikrolitre fibronektin aspire edin. Ucu açılı tutarak elektrotlara katı nesnelerin temas etmediğinden emin olun. Ardından, eşit şekilde dağıldığından ve halkanın yüzmediğinden emin olmak için yavaşça 950 mikrolitre LI-BPEL ortamı ekleyin.
Daha sonra, çanağı inkübatöre geri koyun. Bu, atan kardiyomiyositlerin ilk kültürüdür. Bir doku kültürü davlumbazında, ortamı hPSC-CMs kültüründen iyi bir şekilde aspire edin.
Kültürü yıkamak ve PBS'yi aspire etmek için her bir oyuğa kalsiyum ve magnezyum içermeyen bir ila iki mililitre PBS ekleyin. Daha sonra her bir kuyucuğa 500 mikro litre ayrışma enzimi ekleyin. Numuneyi 37 santigrat derecede 5 dakika inkübe edin.
Beş dakika sonra, enzimi seyreltmek için her oyuğa bir mililitre LI-BPEL ekleyin. hPSC-CM'lerin tek katmanını bir P1000 pipetiyle hafifçe çizerek ayırın. Daha sonra hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpte toplayın.
Daha sonra, kalan tüm hücreleri ve hücre kümelerini toplamak için kuyuyu bir mililitre LI-BPEL ile durulayın. Yaklaşık beş ila altı milimetrelik bir nihai hacme ulaşmak için iki ila üç mililitre daha LI-BPEL ekleyin ve hücre kümelerini ayırmak için beş mililitrelik bir pipetle üç ila beş kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Bunu takiben, hücreleri oda sıcaklığında 300 kez g'de üç dakika santrifüjleyin.
Bundan sonra, hücre peletini yerinden çıkarmadan süpernatanı çıkarın. Daha sonra hücre peletini 250 mikrolitre LI-BPEL içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu doğrudan elektrot dizisinin üstündeki PTFE halkasının merkezine pipetleyerek MEA başına 50 mikrolitre hücre süspansiyonu dağıtın.
MEA'ları dikkatlice 37 santigrat derecede inkübatöre aktarın ve hücrelerin gece boyunca bağlanmasına izin verin. Kaplamadan bir gün sonra, halkayı steril bir ortamda steril cımbız kullanarak dikkatlice çıkarın. Halkayı yüzde 80 etanol ile durulayın.
Ve yüzde 80 taze etanol içeren 50 mililitrelik bir tüpte saklayın. Ardından, MEA çipinden 500 mikro litre ortamı yavaşça çıkarın. Ve buna 500 mikro litre taze LI-BPEL ekleyin.
Bunlar, yüzük çıkarıldıktan sonra atan kardiyomiyositlerdir. Daha sonra MEA'ları 37 santigrat derecede inkübatöre aktarın. Ardından, halkanın çıkarılmasından bir gün sonra başlayarak bir haftaya kadar MEA'lar üzerindeki hPSC-CM'lerin elektriksel aktivitesini ölçün.
Şimdi MEA kurulumuna bağlı yazılım paketini başlatın. Ardından, ölçümleri kaydetmek için TCX-Control'de sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın. Bundan sonra, MEA çipini içeren tabağı inkübatörden çıkarın.
MEA çipini tabaktan çıkarın ve kalan suyu emmek için bir mendilin üzerine yerleştirin. Plakanın dış bağlamını bir mendille dikkatlice silin ve sinyal gürültüsüne neden olabilecek kalıntı su veya kalıntıları temizlemek için yüzde 100 etanol ile nemlendirilmiş bir pamuklu çubuk kullanarak temizleyin. Ardından, spontan aktiviteyi tespit etmek için MEA plakasını 37 santigrat derece kayıt kafası aşamasına aktarın.
MC Rack'i açın ve MEA donanımını yüklemek için düzenle'ye tıklayın. Yeni bir protokol oluşturmak için, protokole farklı kaydedici ve ekran pencereleri eklemek için açılır menü düzenlemesini kullanın. Ardından, oynat düğmesine tıklayarak protokolü oynatma modunda başlatın.
Sinyaller görünür R tepe noktaları ve T tepe noktaları net bir şekilde gösteriyorsa, adaptasyon aşamasını tamamlamak için 10 ila 15 dakika bekleyin. Denemeyi başlatmak için kaydet'e tıklayın ve ardından kararlı durumu belirlemek için temel koşullar altında 10 dakika boyunca verileri oynatın ve alın. En iyi sinyale sahip elektrotlara açıklama ekleyin, böylece kolayca tanımlanabilir ve daha sonra analiz için dışa aktarılabilirler.
Bir ilaç yanıt değerlendirmesi için, her 10 dakikada bir artan konsantrasyonlarda ilaç ekleyin. Protokolün sonunda kaydı sonlandırmak için durdur'a tıklayın. Burada, yüksek sinyal-gürültü oranı ile açıkça görülebilen RQ ve T tepe noktaları ile iyi kalitede bir iz gösteren bir MEA ile kaydedilen temsili izler verilmiştir.
Açıkça görülebilen RQ ve T tepe noktaları olmayan kötü kaliteli bir iz Ve RQ ve T tepe noktaları net bir şekilde görülebilen ancak düşük sinyal-gürültü oranına sahip gürültülü bir iz. Ve burada, hPSC-CM'ler kullanılarak MEA deneyleri sırasında kaydedilebilecek farklı morfolojilere sahip kaliteli alan potansiyel izlerinin temsili örnekleri verilmiştir. Gölgeli alan, analiz sırasında ölçülen QT aralığını temsil eder.
MEA'daki alan potansiyeli, aksiyon potansiyelinin ilk türevine benzediğinden, alan potansiyeli izlerinin integrali, tam aksiyon potansiyeli yeniden polarizasyonlarına yakın olan T dalgalarının teorik gösterimleri olarak hesaplanmıştır. Bu prosedürü denerken, güvenilir ve tutarlı sinyaller sağlamak için en yüksek sayıda elektrot seçmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, elektriksel fenotip veya spesifik iyon akımı yoğunlukları ile ilgili spesifik gen ekspresyonu gibi ek soruları yanıtlamak için quanto tibial time PCR veya tek hücreli yama klempi gibi diğer yöntemler kullanılabilir.
Geliştirilmesinden sonra bu teknik, kök hücreler alanındaki araştırmacıların, insan pluripotent kök hücrelerinden türetilen kardiyomiyositleri kullanarak kardiyak aritmileri ve in vitro farmakolojiyi keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, elektrofizyolojik ölçümler ve ilaç taraması için insan pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyositlerin MEA'lar üzerinde nasıl ayrıştırılacağını ve plakalanacağını iyi anlamış olmalısınız. İlaçlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman standart GLP gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.
Genel Bakış
Bu protokol, elektrofizyolojik karakterizasyon için çok elektrotlu diziler (MEAs) üzerinde insan pluripotent kök hücrelerden (hPSC-CMs) türetilen kardiyomiyositlerin ayrıştırılmasını ve yerleştirilmesini ana hatlarıyla belirtir. Alan potansiyeli ölçümünü ve kalp hastalığı modelleme ve ilaç yanıtı değerlendirmesi için gerekli olan QT ve RR aralıklarının analizini ölçme yöntemlerini ayrıntılı olarak açıklar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyak Elektrofizyoloji
- Kök Hücre Biyolojisi
- İlaç Tarama
Arka Plan
- hPSC-CM'lerin elektrofizyolojik özelliklerini anlamak, kalp araştırmaları için hayati öneme sahiptir.
- Bu yöntem, insan kardiyomiyositleri üzerindeki ilaç yanıtlarının değerlendirilmesini sağlar.
- Alan potansiyeli ölçümleri, hücresel elektriksel aktiviteye dair içgörüler sağlar.
- Protokolün görsel gösterimi, başarılı uygulama için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- hPSC-CM'lerin elektriksel sinyallerini karakterize etmek.
- Mutasyonlu ve kontrol kardiyomiyositleri arasındaki elektrofizyolojik farklılıkları karşılaştırmak.
- Hasta türevi hücreler kullanılarak ilaç taramasına olanak sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Bir ayrıştırma enzimi kullanarak hPSC-CM'lerin ayrıştırılması.
- Fibronektin kaplaması olan MEA'lar üzerinde hücrelerin yerleştirilmesi.
- Özel yazılım kullanarak elektriksel aktivitenin ölçülmesi.
- Kayıtlar sırasında değişen ilaç konsantrasyonlarıyla ilaç yanıtlarının değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- MEA'lar üzerinde hPSC-CM'lerin başarılı bir şekilde ayrıştırılması ve yerleştirilmesi.
- Alan potansiyellerinin net ölçümü ve R ve T tepelerininin tanımlanması.
- Gerçek zamanlı olarak ilaç yanıtlarını değerlendirme kabiliyeti.
- Deneysel koşullara göre değişen sinyal kalitesinin gösterimi.
Sonuçlar
- Bu protokol, hPSC-CM'leri incelemek için güvenilir bir yöntem sağlar.
- Elektrofizyolojik karakterizasyon, kalp hastalıklarını anlamak için hayati öneme sahiptir.
- Bu yöntem, kişiselleştirilmiş tıpta ilaç taraması çabalarını destekler.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Electrophysiological profiling of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) using multi-electrode arrays (MEAs) enables medium- to high-throughput assessment of cardiac ion channel function and drug-induced electrophysiological changes. This approach supports early detection of cardiotoxic liabilities and mechanistic de-risking of arrhythmogenic compounds in discovery-stage screening. By providing quantitative field potential parameters such as QT and RR intervals, the method enhances predictive confidence in translational cardiovascular research and safety pharmacology workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by comparing electrophysiological phenotypes between mutant and control hPSC-CMs to clarify ion channel dysfunction mechanisms.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional validation of cardiac ion channel targets using human-relevant cellular models.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying compounds that prolong QT interval or alter field potential morphology, indicating pro-arrhythmic risk.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated hPSC-CM monolayers on MEAs for consistent, reproducible field potential recording across multiple electrodes.
- Quantitative Output: Enables extraction of interval-based metrics (QT, RR) and waveform morphology as dependable readouts for compound effect assessment.
- Scalability & Reuse: Supports medium-throughput drug response profiling with dose-response capability, enabling reuse across screening campaigns and compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Uses hPSC-CMs derived from patients with arrhythmia syndromes to model human cardiac electrophysiology in a disease-relevant system.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase electrophenotyping with preclinical validation by providing human-derived data predictive of in vivo drug responses.
- Mechanistic De-risking: Allows detection of ion channel-mediated effects early, reducing late-stage attrition due to cardiac safety findings.
Pipeline & Workflow Integration
The MEA-based electrophysiological assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical safety assessment, enabling data-driven decisions at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of ion channel involvement in arrhythmia mechanisms by measuring field potential changes in genetically defined hPSC-CMs.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible electrophysiological readouts with temperature-controlled, automated signal acquisition for compound library profiling.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (QT, RR intervals, waveform morphology) that enable objective comparison of electrophysiological states across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro electrophenotyping to clinical relevance by modeling human cardiac electrophysiology and drug response in a scalable format.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform applicable across multiple projects, targets, and therapeutic areas in cardiovascular research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cardiac electrophysiology through direct human cell-based measurement.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via controlled plating, coating, and environmental conditions, minimizing inter-lab variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling early detection of cardiotoxic compounds, thereby reducing late-stage biological risk and capital inefficiency.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying electrophysiological liabilities early, informing resource allocation toward safer candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, cardiac differentiation, and electrophysiological signal interpretation to ensure data quality.
- Dependent on MEA-compatible instrumentation, temperature control units, and signal acquisition software for reliable field potential recording.
- Necessitates cross-team standardization of cell preparation, plating density, and analysis protocols to ensure comparability across studies.
- Involves adaptation considerations when extending to 3D cultures or alternative maturation states of hPSC-CMs to maintain signal fidelity.
- Limited by the need for optimization of dissociation and plating conditions to avoid cellular stress that could confound electrophysiological readouts.
