Eyeball Dokusunda Efektif Hafıza T Hücrelerini Artıran Kronik Otoimmün Kuru Göz Fare Modeli

Bu prosedürün genel amacı, otoimmün kuru gözde tedavilerin değerlendirilmesi için subkutan immünizasyon ve subkonjonktival ve intralakrimal bez ekstraktlarının enjeksiyonu kullanılarak sıçanlarda gözyaşı disfonksiyonu ve lakrimal bez iltihabının klinik özelliklerini indüklemektir. Bu yöntem, otoimmün hastalıkta T hücrelerini baskılayan ilaçların etkili olup olmadığı gibi kuru gözdeki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, insan kuru gözüne benzer oküler hastalık belirtileri üretmesi ve ayrıca gözyaşı bezine ve göze sızan T hücrelerini ölçmesidir.

Bu hayvan modelinin sonuçları, dalak ve lenf düğümleri incelenebildiği için lenfosit kaçakçılığını anlamaya kadar uzanır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişi, küçük sıçan gözündeki değişiklikleri belgelemek için uygun enstrümantasyonun olmaması nedeniyle mücadele edecektir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü sıçan gözünün hızlı kuruması ve anesteziden sonra göz kırpma eksikliği nedeniyle bazı adımların öğrenilmesi zordur.

Metin protokolüne göre dişi bir Sprague Dawley faresine ötenazi yaptıktan sonra, hayvanı bir kulağı masaya ve diğeri yukarı bakacak şekilde düz bir şekilde yerleştirin. Bir makasla, açıkta kalan kulağın altında üst-alt 10 milimetrelik bir kesi yapın. Daha sonra lakrimal bezi çevredeki bağ dokusundan ve drenaj kanalından diseke ederek çıkarın.

Daha sonra, makas kullanarak, dokuyu buz üzerinde mümkün olduğunca ince kıyın. Ardından, gözyaşı bezi başına 1X proteaz inhibitörü ile 150 mikrolitre PBS ekleyin. Sonikatör 10 saniye açık, 10 saniye kapalı ve% 30 genliğe ayarlandığında, numuneleri beş dakika boyunca 20 kilohertz'de buz üzerinde sonikasyona tabi tutun.

Daha sonra, sonikasyonlu örnekleri 20 dakika boyunca 13.000 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Ardından, süpernatanı 1,5 mililitrelik tüplere ayırın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Mycobacterium tuberculosis H37Ra'nın mililitresinde beş miligram içeren tam Freund adjuvanını veya eksik Freund adjuvanını 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve antijen karışımına adjuvan hacminin bire bir oranında olduğundan emin olun. Mililitre ovalbümin başına iki miligram ve mililitre başına 10 miligram lakrimal bez özü içeren antijen karışımını adjuvan çözeltiye damla damla eklerken, dökülmeye neden olmayan en yüksek hızda girdap yapın. Tüm antijenler eklendikten sonra beş dakika boyunca girdaba devam edin.

Emülsiyonu beş mililitrelik bir şırıngaya aktarın ve başka bir beş mililitrelik şırıngaya bağlamak için bir şırınga konektörü kullanın. Ardından, karıştırmak için emülsiyonu bir şırıngadan diğerine itin. Sıfırıncı günde, tam Freund adjuvanında bir miligram lakrimal bez özütü ve 200 mikrogram ovalbümin içeren 200 mikrolitre emülsiyonu bir mililitre Luer kilit şırıngalarına dağıtın ve şırıngaları 27 gauge iğne ile donatın.

Anestezi kullanmadan, emülsiyonu sıçan kuyruklarının tabanına deri altına enjekte edin. Daha sonra, 14. günde, benzer şekilde, eksik Freund'un adjuvanına aynı antijenden 200 mikrolitre enjekte edin. Aynı gün, intraperitoneal olarak 100 mikrolitre PBS'ye 300 nanogram boğmaca toksini enjekte edin.

48. günde, gerekli miktarda ovalbümini tartın ve PBS'de çözün. Daha sonra, ovalbümini bu videoda daha önce hazırlanan çözülmüş lakrimal bez özü ile birleştirin ve mililitre ovalbümin başına bir miligram ve mililitre gözyaşı bezi özütü başına bir miligram içeren antijen çözeltisi yapın. Sıçanı uyuşturduktan sonra, gözün forniceal subkonjonktivasına beş mikrolitre antijen enjekte edin.

Ardından, lakrimal beze 20 mikrolitre antijen enjekte edin. Metin protokolüne göre anestezi uygulanmış bir sıçanı tutarken, fenol kırmızı iplikle gözyaşı hacmini ölçmek için, ipliği tutmak için bir çift forseps ve sıçanın alt göz kapağını çekmek için başka bir forseps kullanın. İpliği bir dakika boyunca alt forniksin proksimal köşesine yerleştirin ve ardından ipliği çıkarın.

Ardından, ipliği milimetre işaretli bir cetvelin yanına yerleştirin ve ipliğin ıslanan kısmının uzunluğunun bir görüntüsünü alın. Kornea yırtılmasının düzgünlüğünü ölçmek için, fareyi bir halka aydınlatıcı ve bir kamera ile donatılmış bir stereo mikroskop altına yerleştirin. Ardından, sıçan korneasına beş mikrolitre salin uygulayın.

Eldivenli parmaklarla, salini yaymak için üst ve alt göz kapaklarını yaklaşık beş kez hareket ettirerek pasif olarak göz kırpın. 1,6 kat büyütme altında, halka aydınlatıcıyı kornea yüzeyinin ortasına odaklayın. Ardından, 10 saniye sonra fotoğrafik görüntüler elde edin.

Sıçan korneasına iki mikrolitre %0.2 floresein ekleyerek kornea hasarını ölçmek için floresein taraması kullanın. Eldivenli bir parmakla, floresein boyasını göz yüzeyine yaymak için sıçan göz kapaklarını üç kez pasif olarak açın ve kapatın. Bir dakika sonra, bir mililitre salin çekmek için üç mililitrelik bir şırınga kullanın.

Ardından, şırıngayı korneanın yaklaşık iki ila üç milimetre önüne yerleştirin ve göze nazikçe salin uygulayın. Arka plan ışığı kapalıyken, oküler görüntüleme mikroskobunun kobalt mavisi filtresi altında görüntüler elde edin. Fareyi metin protokolüne göre ötenazi yaptıktan sonra, üst ve alt göz kapaklarını çıkarmak için makas kullanın.

Ekstraoküler kasları, optik siniri ve forniceal konjonktivayı keserek dünyayı serbest bırakın. Göz küresini açmak için bir kesi yapın. Vitreus içindeki lensi çıkarın.

Ardından, disseke edilen gözbebeklerini buz üzerinde 1,5 mililitrelik tüplere koyun. Son olarak, bu videoda daha önce anlatıldığı gibi gözyaşı bezlerini toplayın. Bu şekil, kontrol ve DED sıçanından fenol kırmızı ipliklerinin temsili görüntülerini göstermektedir.

DED grubundaki fenol kırmızı ipliklerinin uzunluğu kontrol grubundan daha kısadır, bu da daha az yırtılma hacmini gösterir. Floresein hasarlı kornea epiteline bağlanır ve bu nedenle hasarın derecesini ölçmek için kullanılır. Bu deneyde, DED sıçanlarının kornea yüzeyindeki floresein lekeleri sıfırdan ikiye derecelendirildi ve kontrol sıçanlarıyla karşılaştırıldı.

DED'li sıçanlar, kontrol sıçanlarından daha fazla floresein lekelenmesine sahiptir, bu da kornea hasarını düşündürür. Burada görüldüğü gibi kornea yüzeyi pürüzsüz ve yırtılma stabilitesi yüksek ise oküler yüzeydeki aydınlatıcı halkanın görüntüsü yuvarlak ve kusursuzdur. Görüntünün bozulması, DED grubunda daha yüksek bir bozulma derecesinde gözlemlendiği gibi, kornea düzgünlüğünün azaldığını ve kararsız bir gözyaşı filmini gösterir.

Bu akış sitometrisi analizi, normal sıçan göz küresi dokularındaki baskın T hücresi alt kümesinin efektör bellek T hücreleri olduğunu göstermektedir. DED sıçanlarının gözbebeklerinde, CD3 pozitif T hücrelerinin yaklaşık% 70'i efektör bellek T hücreleri iken, kontrol sıçanlarında bu sayı yaklaşık% 50'dir. Bu prosedürü takiben, ek soruları cevaplamak için diğer bağışıklık hücreleri için boyama yapılabilir.

Örneğin, doğuştan gelen bağışıklık hücreleri veya B lenfositleri için boyama yapabilirsiniz. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik araştırmacıların oküler yüzey immünolojisini anlamalarının ve ayrıca insanlarda kuru göz ve Sjögren sendromunu incelemelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, sıçanlarda otoimmün kuru gözün nasıl indükleneceğini ve sonuçların sağlam bir şekilde belgelenmesini iyi anlamış olmalısınız.