Cerrahi Ablasyon Tahlili Planaryalar Göz Rejenerasyon incelenmesi için

Bu protokol sürekli çevredeki dokulara bozmadan planarian gözleri (optik bardak) çıkarılması için nasıl gösterir. ya bir ensülin iğne ve şırınga kullanılarak, ya da her iki gözü göz rejenerasyon, görsel yenilenme evrimi, ve ışık kaynaklı bir davranışın temel düzenleyici mekanizmalarının soruşturma kolaylaştırmak için kesilip edilebilir.

Bu prosedürün genel amacı, tekniğin tüm eğitim seviyelerindeki araştırmacılar ve öğrenciler tarafından uygulanabilmesi için beyni veya çevresindeki dokuları rahatsız etmeden düzlemsel optik kabın nasıl güvenilir bir şekilde çıkarılacağını göstermektir. Bu yöntem, endojen göz kök hücre bakımını ve farklılaşmasını in vivo olarak düzenleyen mekanizmaların belirlenmesi gibi rejeneratif alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların diğer dokuları en az şekilde rahatsız ederek sadece göz dokularını çıkarmasına izin vermesidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişilerin, çevredeki dokuların ablasyonundan kaçınırken tüm gözü ablasyon yaparak doğru miktarda dokuyu güvenilir bir şekilde çıkarabilmesi için pratik yapılması gerekir. Başlamak için, en az bir hafta boyunca beslenmemiş ve en az beş ila yedi milimetre uzunluğunda olan solucanları seçin. 15 ila 30 solucanı, üçte ikisi solucan suyuyla dolu 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve hemen kapağı değiştirin.

Solucanları, hasar görmediklerinden ve yakın zamanda yenilenmediklerinden emin olmak için beyaz başlar veya kuyruklar gibi eksik veya pigmentsiz dokular açısından gözlemleyin. İlk olarak, çalışma alanını ve diseksiyon mikroskobu tabanını %70 etanol solüsyonu ile silin ve tamamen kurumasını bekleyin. Seçilen solucanlarla birlikte çanağı mikroskobun sol tarafına yerleştirin.

Daha sonra, mikroskobun sağ tarafına, bir çift beş numaralı forseps, bir mililitrelik şırınga ile 31 gauge 5/16 inçlik bir insülin iğnesi, temiz bir transfer pipeti ve ablasyonlu solucanları toplamak için etiketli 12 oyuklu bir plaka yerleştirin. Ameliyat sırasında kolayca erişilebilecek şekilde bir kutu tüy bırakmayan mendil, taze solucan suyuyla doldurulmuş plastik bir yıkama şişesi ve ek transfer pipetleri yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu tabanının ortasına bir Peltier plakası yerleştirin ve çıkışı, Peltier plakasının yüzeyi solucanları hareketsiz hale getirmek için yeterince soğuk olacak şekilde DC güç kaynağına ayarlayın.

Alternatif olarak, bir Peltier plakası yerine buzla doldurulmuş bir Petri kabı kullanılabilir. Ameliyat yüzeyini hazırlamak için önce beş santimetreye on santimetrelik bir plastik parafin filmi parçası kesin ve Peltier plakasının ortasına yerleştirin. Ardından, tüy bırakmayan bir mendili yaklaşık iki santimetrelik bir kareye katlayın ve filmin üzerine yerleştirin.

Ardından, katlanmış mendili yerinde tutun, solucan suyuyla nemlendirin ve mendili bir transfer pipeti ile düz bir şekilde yuvarlayın. Son olarak, 1,5 ila iki santimetre karelik bir parça beyaz filtre kağıdı kesin ve mendilin üzerine koyun. Ameliyata başlamak için, transfer pipetini kullanarak bir solucan sırt tarafı yukarı bakacak şekilde filtre kağıdına yerleştirin.

Işığı açın ve huzmesini solucanın üzerine odaklayın. Diseksiyon mikroskobu odağını ve büyütmesini, solucanın gözleri net bir şekilde görülebilecek şekilde ayarlayın. Solucanın konumunu, başı araştırmacıya doğru bakacak ve 30 ila 40 derece sağa açılı olacak şekilde ayarlamak için parafin filmini döndürün.

Solucan ventral tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırılmışsa ve faringeal açıklık görünüyorsa, solucanın pozisyonunu gözler görünür olacak şekilde sırt tarafı yukarı bakacak şekilde nazikçe değiştirmek için forsepsin donuk tarafını kullanın. Mikroskop ayarlarını, gözler net bir şekilde odaklanacak şekilde yeniden ayarlayın. Ayrıca hem gözlerin hem de çevresindeki kafa dokularının görüş alanında olduğundan emin olun.

Sağ elinizde başparmak ve işaret parmağı arasında temiz bir şırınga tutun. Şırınganın alt kısmını sol başparmağın üzerinde, Peltier plakasına karşı desteklenmiş olarak destekleyin. İğnenin eğiminin görünür olduğundan emin olmak için mikroskoptan bakın.

İşlem sırasında yüzeyin sabit kalmasını sağlamak için sol işaret parmağını sol başparmakla 40 derecelik bir açı yapacak şekilde ameliyat yüzeyine yerleştirin. İğneyi, iğnenin eğimi yukarı bakacak şekilde göze 90 derecelik bir açıyla yerleştirin. İğnenin ucuyla, beyaz, pigmentsiz bölge olarak görünen gözün optik kabının üzerindeki ince doku tabakasına nazikçe nüfuz edin.

Sağdan sola doğru kepçeyle, optik kap içinde bulunan siyah pigmentli dokuyu ve tüm beyaz dokuları çok nazikçe çıkarın. Çift göz ablasyonu yapıyorsanız, ikinci gözü şimdi ablate edin. Ameliyatı tamamladıktan sonra, pipeti az miktarda solucan suyu ile geri yükleyin ve filtre kağıdından kaldırmak için suyu solucanın üzerine bırakın.

Solucanı hemen transfer pipetine çekin. Solucanı, üçte ikisi taze solucan suyuyla dolu etiketli 12 oyuklu bir plakaya taşıyın. Tüm solucanlar transfer edildikten sonra, kuyulardaki suyu taze solucan suyu ile değiştirerek yıkayın.

Işıktan korunan solucanları 20 derecelik bir inkübatörde inkübe edin ve yenilenme sürecini izleyin. Canlı solucanları feda etmek için, solucan suyunu plakadan çıkarın ve% 70 etanol ile değiştirin. Solucanları üç ila beş dakika kuluçkaya yatırın ve solucanların parçalanıp grileşmediğini gözlemleyin.

Burada, cerrahi işlemden önce, dört gün sonra ve iki hafta sonra çekilmiş, çift göz ablasyonu ve tek göz ablasyonuna tabi tutulan yassı kurtların fotoğrafları sunulmaktadır. Görüntüler, zaman içindeki yenilenme ilerlemesini göstermektedir. Ablasyonlu solucanlarda göz rejenerasyonu, arrestin ve yeni geliştirilen fotoreseptör nöronlarının immünohistokimyasal boyanması ile de doğrulandı.

Çift göz ablasyonunu takiben yassı solucanlarda görsel sistemin geri kazanılması, ışığa vahşi tip fotofobik tepkiye dayanan fonksiyonel bir tahlilde de incelenmiştir. Ablasyondan 24 saat sonra, gözsüz solucanlar ışıktan kaçmazlar ve hafif lekelerden geçerler. Fotofobi, işlemden yedi gün sonra geri yüklenir, bu da yenilenen görme sisteminin işlevsel olduğunu gösterir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bir solucanın çift göz ablasyonu prosedürü yaklaşık üç dakika yapılabilir. Ablasyon yaparken, gözün tüm pigmentli ve pigmentsiz dokularını eksize etmek, gözler arasındaki dokuya zarar vermemek veya dokuyu daha sonra göze yırtmamak için emin olmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, spesifik genlerin rolünü ve rejeneratif süreçlerini incelemek için immünohistokimya ve RNA interferansı gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Ek olarak, yeniden büyümeyi takiben göz fonksiyonunu test etmek için davranışsal testler yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, çevredeki dokuları rahatsız etmeden planaryal gözleri nasıl eksize edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. İğnelerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve eldiven giymek ve iğneyi sizden uzağa bakacak şekilde tutmak gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.