Name: Cerrahi Ablasyon Tahlili Planaryalar Göz Rejenerasyon incelenmesi için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Öğrenin planaryalarda göz rejenerasyon mekanizmalarını incelemek için cerrahi ablasyon tekniğini. Bu yöntem, kök hücre biyolojisi ve nörobilim araştırmalarında göz dokusunun minimal hasarla çıkarılmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar işlevsel tahlil ile yardım için bu göz ablasyon tekniği, Taylor Birkholz mükemmelleştirmek için Michelle Deochand teşekkür etmek istiyorum, Peltier plakaları hakkında bilgi almak için, anti-arrestin antikoru Michael Levin ve Junji Morokuma. Bu çalışma WSB Batı Michigan Üniversitesi&#39;nden SFSA hibe ile desteklenmiştir.

1. Hayvan Kültür ve Taşıma NOT: Bu protokol Schmidtea mediterranea, yaygın rejenerasyon araştırma için kullanılan bir sıralı genomun 16, 17 ile diploit planarian türler kullanır. Bununla birlikte, deney gibi Girardia tigrina ve Girardia dorotocephala (ticari olarak temin edilebilir) gibi başka türler ile aynı başarılıdır. <ol><li> Ultra saf (ya da süzülmüş deiyonize edilmiş) su içinde 0.5 g / L deniz tuzu yapılan &quot;sonsuz su&quot; solucanlar koruyun. Sonsuz su tutmak için steril bir polipropilen ya da cam kaplar kullanın. Bkz <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55594/Supplementary_File_1.docx" target="_blank">Ek Dosya 1</a> solucan su hazırlama ile ilgili ayrıntılar için. Not: sabun gibi kaplar (ya da diğer malzemeleri) temizlemek için sabun kullanmayın solucan için toksiktir; yerine% 70 etanol ile silin ve kurumaya bırakın. &lt;ol&gt; <li> mikroplardan korunmak için Planarya çalışırken eldiven giyin. Not: Solucanlar sabun, ağartıcı, şampuan, saç kremi, ve el temizleme dahil olmak üzere çevresel toksinler ve kimyasallar, çok hassastır. </li></ol></li><li> Kapaklı polipropilen gıda kapları Ev koloniler, ~ 20 ° C (oda sıcaklığı) hava değişimi için kısmen açık bıraktı. Petri kutuları ya saklayın deney kurtlar (100 mm tabak için 20 solucanlar) veya non-muamele edilmiş doku kültürü plakaları (12 oyuklu plakalar için oyuk başına 1 solucan). Stresi azaltmak karanlıkta hem koloniler ve deneyleri tutmak. NOT: Koloniler solucan litre suya en fazla 500-1000 den solucanlar olmalıdır. Hava akımı bu yemeklerin içine tasarlanmıştır beri deneyler için, tam yerinde kapaklarını bırakın. </li><li> Bir transfer pipeti ile ilgili püresi bırakarak kap boyunca yiyecek damla yerleştirerek püre haline getirilmiş organik et ve tavuk karaciğer haftada bir deneysel olmayan solucanlar besleyin. içinde gıda tüketmek Worms 2 saat izin verkabını temizlemeden önce koyu (adım 1.4). Uzun süreli (ay) C, mağaza kısa süreli (haftalar) boyunca -20 ° C&#39;de püre ya da -80 Kullanımdan önce; (Bakteri çiçek ve solucanlar zarar verebilir gibi) yeniden kullanım için püresi dondurursam yoktur. Not: Karaciğer bir hormon veya antibiyotik içerir ve tercihen önceden dondurulmuş edilemez. Santrifüj, dondurmadan önce püresi (ya da teknolojide beslemeye) havanın çıkartılması ve yüzer gıda önlemek için kullanılırlar. Gıda kabın dibine batar gerekir. püresi 1 mL 500-1,000 solucanlar için yeterlidir. </li><li> Kolonilerin ve deneyler hem taze solucan su ile haftada bir kez Değişim su. Koloni kaplar da ağartılmamış kağıt havlu ile silinmiştir edilmelidir (mukus lekeleri çıkarmak için tuzak atıklar) (besleme ve tekrar 2 gün sonra 2 saat sonra), besleme solucanlar için haftada iki kez solucanlar açlıktan veya bir haftada bir kez. biyofilm muhafaza etmek için, kabın% 80&#39;den fazla silme yoktur. </li><li> Kaplarla (ya da cerrahi Setu arasında solucanlar taşıp) Bir transfer pipeti kullanarak. kap yüzeylerine yapışan serbest solucan için, yüzeyin serbest bırakmak için solucan / arkasında üzerinde su fışkırtma. pipet alt inç (tiner) kısmı içinde solucan tutmaya çalışırken Ardından, pipet içine solucan emmek. <ol><li> onları emmeye önce solucan küçük bir su miktarı ile Backload pipetler. </li><li> pipet ile dokunarak yumuşak bedenli solucanlar yırtılma önlemeye yardımcı olmak için, daha doğrusu solucan kendisinden daha, solucan etrafında su taşımak için deneyin. </li><li> solucanlar transfer veya su yerine sürece örtülü deneysel yemekler tutun. </li></ol></li></ol> 2. Hazırlık <ol><li> Deneylerden önce solucanlar az bir hafta beslenmesi durdurun. <ol><li> ≥1 hafta boyunca beslenirler ve uzunluk olarak en az 5-7 mm edilmemiş olan solucanlar seçin. solucan su dolu bir Petri kabı 2/3 solucan aktarın ve çanak altına bir cetvel kaydırarak solucan uzunluğunu onaylayın. w ölçünnormlar ise tamamen uzatılmış ve hareketli. NOT: Sonraki .bağışık ve in situ hibridizasyon analiz içinde, daha büyük solucanlar (8-10 mm) performans ile çalışmak daha kolay olduğunda daha küçük (5-7 mm) solucanlar daha iyi çalışırken - özellikle aşındırılması için öğrenme. </li><li> solucanlar, bütün hasarsız ve yakın zamanda yenileyici değildir emin olun. NOT: Normal solucanlar kıyasla rejenerasyon solucanlar, baş ve / veya arka bölgede daha hafif (veya hiç) pigment olacaktır. </li><li> solucanlar üzerinde RNAi&#39;yi veya farmakolojik tedaviler gerçekleştirmek, bu noktada bunu. kurtlar tedavisi (RNAi için gibi) bir parçası olarak beslenen olsaydı, 2.2 adıma devam etmeden önce en az 7 gün son beslenmeden sonra bekleyin. </li></ol></li><li> % 70 etanol ile çalışma alanı ve diseksiyon mikroskobu baz temizleyin ve tamamen kurumasına izin verin. Kapsamı solundaki seçilen solucanların koyunuz. Kapsamı sağında, 5/16 inç insülin iğne 1 ile 5. forseps bir çift, bir 31 G yerml şırınga ve temiz bir aktarım pipet. <ol><li> alet tezgah (kontaminasyona neden olabilir) dokunmasını tutulmasını sağlamak. temiz forseps, iğne ve pipet tutmak için (örneğin bir çubuk geri kalanı gibi) sert bir öğesini kullanın. Alternatif olarak, yeni bir kahverengi (ağartılmamış) ve kağıt havlu üstüne yer araçlar. NOT: Sağ elini bireyler ilgilendirmeyen Bu ve sonraki talimatlar yazılır. Solak bireyler sağ / sol yön ters olmalıdır. </li></ol></li><li> Sonraki bir çalışma alanı için ve lif içermeyen doku mendillerin bir kutu, taze sonsuz bir su kaynağı, ve (tezgah üstü korunmuş olarak) ilave bazı aktarım pipetler yerleştirin. yayma kolaylığı için bir plastik yıkama şişesinde yer solucanı su. Ayrıca ablasyona Hayvan toplam kapsamına sağındaki işaretlenmiş bir 12-kaynaklı plaka (veya 100 mm Petri kabı) yerleştirin. </li><li> Ismarlama bir Peltier plakası kullanılarak solucanlar hareketsiz hale getirmek için ise, t depresyon içine Peltier plakası pozisyonO mikroskop taban ve Peltier plakasının çalışma yüzeyi yeterince soğuk kadar DC güç kaynağı çıkış ayarlayabilirsiniz (tipik olarak ~ 5 V) .Alternatively, yarım su ile dolu bir 100 mm Petri kabı doldurarak soğuk plaka yapmak ve en az 24 saat süre ile dondurma. Kapağı atın ve kesici bir alan tabanındaki 100 mm tabak için alt tarafının, daha sonra buz (Şekil 1A) yüzeyine doğrudan baş aşağı bir 60 mm Petri kabı kapağını yerleştirin. <ol><li> Su, 100 mm tabak içinde dondurulur sonra, bir buz &quot;volkan&quot; plakasının merkezinde bir görünebilir. Bu durumda, yüzeyden herhangi bir düzensizlik kaldırmak için, buz düz kazımak için bir tıraş bıçağı kullanma. NOT: ameliyatları sırasında buz, erimeye çok daha zor ablasyon yapma olacaktır. önceden birkaç buz yemekleri hazırlayın, ve en kısa sürede 60 mm yemeğin kapak yüzen başlar başlamaz tahlil sırasında olanları eritmek için donmuş olanları değiştirin. </li></ol></li><li> hazırlamakcerrahi yüzeyi. Plastik parafin film bir 5 cm x 10 cm parça kesin (4 cm2 olursa petri soğuk plaka kullanılarak) ve hareketsiz hale getirme cihazının merkezi üzerine yerleştirin. Bir lifsiz bir doku Katlama bir kare yaklaşık 2 cm2 olarak mendil ve filmin üzerine yerleştirin. Beyaz filtre kağıdı 1.5-2 cm2 &#39;lik bir parça kesin ve mendilin üzerine yerleştirin. Şekil 1B-1E bakın. <ol><li> katlanmış tutun eldivenli parmak ile yerinde silin ve hafifçe katlanmış devam etmesini sağlamanın silin kırmak için solucan su kullanmayın. düz mendil rulo bir transfer pipeti kenarıyla. NOT: Soğuk sıcaklık hareket solucanlar tutmaya yardımcı olur. Çalışma &quot;kuru&quot; da hareketsiz hale yardımcı olur. Doku kurtlar (öldürücü olan) tamamen kurumasına izin vermeden, ameliyat sırasında nemli solucan tutarak, filtre kağıdı içinden su fitilleme eylemleri silin. </li></ol></li></ol> 3. Cerrahi Ablasyon <ol><li> Yerleştirmek üzere bir transfer pipet kullanınfiltre kağıdı üzerine, e solucan sırt tarafı yukarı. Işık kaynağını açın ve hafif solucan odaklanmış şekilde Goosenecks yönlendirmek. Gözleri (tüm solucan görünümünde olması gerekmez) açıkça görünecek şekilde diseksiyon kapsamı odağı ve büyütme ayarlayın; 5X büyütmede iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. Kafa (mikroskop ön tarafına doğru) araştırmacı doğru işaret şekilde sağa doğru, açılı 30-40 derece parafin filmi döndürerek solucan döndürün. <ol><li> Aşırı solucan hareket etmesini önlemek için parlak ışık kullanımından kaçının. Planaryalar olumsuz phototaxis görüntülemek ve parlak ışık kaçmasına dener. </li><li> Solucan (boğaz görünür açılış) yukarı bakacak şekilde ventral yana konumlandırılmış, yavaşça (gözleri görünür olan) sonsuz dorsal tarafına kadar yeniden konumlandırmak için forseps donuk tarafında kullanır. hayvan yeniden konumlandırma zaman yumuşak doku yoluyla yırtılma riskini en aza indirmek için forseps sivri ucu ile hayvanın yaklaşan kaçının. </li><li&gt; Gözler odakta açıkça böylece mikroskop odağı ayarlayın. Ayrıca gözleri ve çevresindeki kafa dokuları hem görünümde olmasını sağlamak. </li></ol></li><li> O (başparmak ve işaret parmağı arasında) kalem sanki sağ elinde taze bir iğne / şırınga tutun. Peltier plakasına (veya Petri kabı soğuk plaka) karşı sola başparmak Brace ve şırınganın alt kısmı dinlenme olan bir dayanak noktası (Şekil 2A) ve sol baş kullanımı. Mikroskopla Bak ve iğne konik görünür olmasını sağlamak. NOT: İğneler çok keskindir. Onları tutarken dikkatli olun. lateks veya nitril eldiven giyerek biraz koruma sunabilir. <ol><li> prosedürü boyunca sürekli iğne / şırınga tutun yardımcı ve tokalaşarak önlemek için sol baş parmağını kullanın. </li><li> Ameliyat yüzey stabil tutmak yardımcı olmak için sol başparmak ve (cerrahi yüzeyinde parmağı ile) sol işaret parmağı ile yaklaşık 40 ° &#39;lik bir açı olun. </li></ol></li><li> İle(Kaşık gibi) yukarı doğru bakacak şekilde iğne konik, göz (Şekil 2B) dik açılarda iğne yerleştirin. yavaşça sağdan sola scooping gözün optik fincan (beyaz, pigmentsiz bölge) üzerinde uzanan doku ince tabaka nüfuz iğne ucu kullanın. Çok nazikçe dibe delinme veya optik fincan sınırlarını yok etmek değil dikkat ederek optik fincan içinde yer alan herhangi bir pigmentli dokuyu. <ol><li> Sonsuz işlemi sırasında herhangi bir noktada&gt; 1-2 dakika için bir filtre kağıdı üzerinde kalmışsa, solucan rehidrate sonsuz bir su damla ekleyin. NOT: Dehidrasyon müthiş yaralanmalara solucanın duyarlılığını artıracaktır. </li></ol></li><li> Tekrar siyah pigmentli dokularda (pigment hücreleri) her kadar adım 3.3, hem de optik fincan (fotoreseptör hücrelerinin dendritler) beyaz dokuların her olarak çıkarılır. dikkatli bir doku temizleme ile silerek iğnenin ucuna yapışmış kesilmiş dokuları çıkarın. çift ​​göz abla isesiyon, istenen bu noktada ikinci gözü baskılamak edilir. Not: zarar görmesini önlemek için, iğneler daha sonra silme uzak başparmak ve işaret parmağı arasından yoluyla iğne çekmek için diğer elini kullanarak, başparmak ve işaret parmağı ile yapılan mendil temiz bir doku ile iğne kavranarak temizlenebilir. Seçenek olarak ise, iğne ıslak bir doku temizleme yüzeyi üzerine sürülmüştür ve temizlik için incelenebilir. </li><li> Tamamlandığında taze solucan su içeren bir etiketlenmiş çanak solucan taşımak için bir transfer pipet kullanın. Grup verileri analiz için, bir tek 100 mm Petri tabağına 20 solucanlar yerleştirebilir. Zamanla aynı bireylerde rejenerasyonu izleme Eğer bir 12 plaka her kuyuya 1 solucan yerleştirin. Tüm solucanlar transfer edildikten sonra, tabaklar / kuyu tüm solucan suyun çıkarılması ve daha fazla taze solucan su ile değiştirerek solucanlar yıkayın. <ol><li> filtreden solucanlar kaldırmak için, sonsuz küçük bir su miktarı ile pipet backload ve solucan üzerine su bırakın. Bu t kaldırması gerektiğinifiltre kağıdı kapalı o solucan, derhal transfer için pipet içine emilmesine. </li></ol></li><li> ışıktan korunmalıdır ~ 20 ° C (oda sıcaklığı) deneyleri inkübe edin ve rejeneratif süreci takip. NOT: Solucanlar sabit bir sıcaklıkta muhafaza etmek sıcaklık kontrollü inkübatör içinde saklanabilir, ancak bu kesinlikle gerekli değildir. Çoğu oda sıcaklıkları yeniden oluşturmak için solucan yeteneğini etkilemez 5 ° C, sadece değişir. </li><li> Arzu edildiği takdirde, imünohistokimya için solucan (Şekil 3-4) ve / ya da in situ hibridizasyon gen ekspresyonunun analiz düzeltmek. Farklı tespit yöntemleri planarian immünohistokimya 18, 19, 20 ve in situ melezleme 21, 22, 23 protokolleri bulunmaktadır. </li><li> Deneyler sonuçlandığı, sacrifice çanak sonsuz suyun çıkarılması ve% 70 etanol ile değiştirerek solucanlar canlı. parçalanması ve grimsi açmak için solucanlar için kontrol 3-5 dakika solucanlar inkübe edin. </li><li> bir kez kurban Normal atık olmayan tedavi solucanlar yerleştirin. çevre, özellikle yerli olmayan türlerin içine canlı solucanlar tanıtan kaçının. </li></ol>

<ol><li>Gentile, L., Cebria, F., Bartscherer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+planarian+flatworm%3A+an+in+vivo+model+for+stem+cell+biology+and+nervous+system+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The planarian flatworm: an in vivo model for stem cell biology and nervous system regeneration.</a> Dis Model Mech. 4 (1), 12-19 (2011).</li>
<li>Elliott, S. A., Sanchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+enduring+contributions+of+planarians+to+the+study+of+animal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The history and enduring contributions of planarians to the study of animal regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (3), 301-326 (2013).</li>
<li>Emili Saló, R. B. Chapter 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEmili+Sal%C3%B3%2C+RB+%22Animal+Models+in+Eye+Research%22">Animal Models in Eye Research</a>. Tsonis, P. A. , Academic Press. 15-26 (2008).</li>
<li>Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dlx+and+sp6-9+Control+optic+cup+regeneration+in+a+prototypic+eye%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">dlx and sp6-9 Control optic cup regeneration in a prototypic eye.</a> PLoS Genet. 7 (8), e1002226(2011).</li>
<li>Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+the+planarian+eye+identifies+ovo+as+a+specific+regulator+of+eye+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of the planarian eye identifies ovo as a specific regulator of eye regeneration.</a> Cell Rep. 2 (2), 294-307 (2012).</li>
<li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+recovery+of+the+planarian+photosensing+system+during+head+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional recovery of the planarian photosensing system during head regeneration.</a> Zoolog Sci. 21 (3), 275-283 (2004).</li>
<li>Pineda, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+network+of+prototypic+planarian+eye+regeneration+is+Pax6+independent%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The genetic network of prototypic planarian eye regeneration is Pax6 independent.</a> Development. 129 (6), 1423-1434 (2002).</li>
<li>Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+Phototactic+Assay+Reveals+Differential+Behavioral+Responses+Based+on+Wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength.</a> PLoS One. 9 (12), e114708(2014).</li>
<li>Raffa, R. B., Martley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine-induced+increase+in+planarian+locomotor+activity+and+block+by+UV+light%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Amphetamine-induced increase in planarian locomotor activity and block by UV light.</a> Brain Res. 1031 (1), 138-140 (2005).</li>
<li>Sandmann, T., Vogg, M. C., Owlarn, S., Boutros, M., Bartscherer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+head-regeneration+transcriptome+of+the+planarian+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">The head-regeneration transcriptome of the planarian Schmidtea mediterranea.</a> Genome Biol. 12 (8), R76(2011).</li>
<li>Vasquez-Doorman, C., Petersen, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NuRD+complex+component+p66+suppresses+photoreceptor+neuron+regeneration+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">The NuRD complex component p66 suppresses photoreceptor neuron regeneration in planarians.</a> Regeneration (Oxf). 3 (3), 168-178 (2016).</li>
<li>Deochand, M. E., Birkholz, T. R., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+regulation+of+planarian+eye+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Temporal regulation of planarian eye regeneration.</a> Regeneration. 3 (4), 209-221 (2016).</li>
<li>Sakai, F., Agata, K., Orii, H., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+regeneration+ability+of+spontaneous+supernumerary+eyes+in+planarians+-eye+regeneration+field+and+pathway+selection+by+optic+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">Organization and regeneration ability of spontaneous supernumerary eyes in planarians -eye regeneration field and pathway selection by optic nerves.</a> Zoolog Sci. 17 (3), 375-381 (2000).</li>
<li>Asano, Y., Nakamura, S., Ishida, S., Azuma, K., Shinozawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin-like+proteins+in+planarian+eye+and+auricle%3A+detection+and+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin-like proteins in planarian eye and auricle: detection and functional analysis.</a> J Exp Biol. 201 (Pt 9), 1263-1271 (1998).</li>
<li>Cross, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Maintenance+and+Regeneration+of+Planarian+Eyes+by+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Control of Maintenance and Regeneration of Planarian Eyes by ovo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7604-7610 (2015).</li>
<li>Robb, S. M., Gotting, K., Ross, E., Sanchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SmedGD+2.0%3A+The+Schmidtea+mediterranea+genome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">SmedGD 2.0: The Schmidtea mediterranea genome database.</a> Genesis. 53 (8), 535-546 (2015).</li>
<li>Robb, S. M., Ross, E., Sanchez Alvarado,, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SmedGD%3A+the+Schmidtea+mediterranea+genome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database.</a> Nucleic Acids Res. 36, D599-D606 (2008).</li>
<li>Beane, W. S., Tseng, A. S., Morokuma, J., Lemire, J. M., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+planar+cell+polarity+extends+neural+growth+during+regeneration%2C+homeostasis%2C+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Inhibition of planar cell polarity extends neural growth during regeneration, homeostasis, and development.</a> Stem Cells Dev. 21 (12), 2085-2094 (2012).</li>
<li>Forsthoefel, D. J., Waters, F. A., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cell+type-specific+monoclonal+antibodies+for+the+planarian+and+optimization+of+sample+processing+for+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of cell type-specific monoclonal antibodies for the planarian and optimization of sample processing for immunolabeling.</a> BMC Dev Biol. 14, 45(2014).</li>
<li>Ross, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+monoclonal+antibodies+to+study+tissue+regeneration+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel monoclonal antibodies to study tissue regeneration in planarians.</a> BMC Dev Biol. 15, 2(2015).</li>
<li>Cardona, A., Fernandez, J., Solana, J., Romero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+situ+hybridization+protocol+for+planarian+embryos%3A+monitoring+myosin+heavy+chain+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">An in situ hybridization protocol for planarian embryos: monitoring myosin heavy chain gene expression.</a> Dev Genes Evol. 215 (9), 482-488 (2005).</li>
<li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Dev Biol. 13, 8(2013).</li>
<li>Pearson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-based+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians.</a> Dev Dyn. 238 (2), 443-450 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu göz ablasyon tekniği beyin dokusu hariç ve göz dokuları için esas eksizyon kısıtlayarak (örneğin, delikli zımba gibi) mevcut yöntemlerle daha da iyileştirir. teknisyenler deneyimsiz ama vicdani lisans öğrencilerine microsurgeries yaşanan den uygulama ile, bu teknik, çoğu kişiler tarafından yapılabilir. Tekniğin önceki immünohistokimya ile ya da göz işaretçi (ler) 4, 5, 13 için in situ melezleme her göz dokuları tama...

Planaryalar yetişkin kök hücre aracılı yenilenmeyi incelerken için güçlü bir model organizma bulunmaktadır. Bu parazitik olmayan tatlı su yassı kurtların, merkezi sinir sistemi ve beyin 1 de dahil olmak üzere her türlü kayıp dokuları, yeniden yeteneği gösterirler. (In situ hibridizasyon, immünohistokimya, RNA interferans (RNAi), ve transkriptomik içinde, örneğin, bir sıralı genom olarak) kadar geri son 10-15 yılda planarian alanında 1700 2, teknolojik gelişmeler olarak ele bu tarihi organizma olduğu güncellenmiş . Özellikle, planarya geçenlerde göz araştırma 3 yükselen bir model olarak popülerlik kazanmıştır. Planaryalar iki doku tipleri, fotoreseptör nöronlar ve pigment hücreleri ile prototipik gözleri; Bu onun göz kök hücre popülasyonunun karakterizasyonu etkin ve aynı genlerin birçoğu omurgalı gözü DE düzenleyen olduğunu göstermiştirvelopment Planaryalar 4, 5 muhafaza edilir. Optik bardak dorsal olarak bulunur ve fotoreseptör nöronların beyaz, pigmentsiz dendrit ve yarım ay siyah pigment yapan hücrelerden, ve bunun üzerine kiyazmanın ile beyin innerve edilir. Yeniden yaratıcı süreçler, 6 açıklık için bir model olmasının yanı sıra, planarian göz görme mekanizmaları 7 evrim eğitimi için uygundur, davranışsal tepkileri ışığa 8 ve davranış 9 nörolojik temeli (planarya negatif phototaxis ekran). Planaryalar Göz rejenerasyon büyük ölçüde iki ana bağlamlarda incelenmiştir: Baş yenilenme parçası başının kesilmesini 4, 10 takip ve sadece göz dokularının 11 eksizyonu aşağıdaki gibi 12 </&gt; Sup. Basit ve anlaşılır olarak göz yenilenmesine En planarian çalışmalar decapitation yöntemini kullanmışlardır. Bazı çalışmalar, sadece göz (kısmi dekapitasyon) 15 arkasında amputasyon gerçekleştirilir rağmen bugüne kadar en yaygın planarian göz eksizyon yöntem olup, ince bir cam kılcal boru 13, 14 ile delik açma ile olmuştur. Bununla birlikte, bu yöntemlerin tüm potansiyel olarak, sonuçların yorumunu komplike (örneğin, beyin, bağırsak, ve nephridia gibi) sadece göz dışındaki birçok doku kaybını içermektedir. Burada sunulan göz ablasyon protokolü göze daha özeldir verilerin ortaya çıkmasına neden (özellikle beyinde hariç) göz dokularına, eksizyonu kısıtlar. Ayrıca, beslenme başlamak için 7-14 gün sürebilir kafası kesilmiş solucanlar aksine, göz kesilip solucanlar performe edilmesi (RNAi gıda ile teslim edilir) RNAi deneyleri izin ablasyon 12 24 saat içinde besleyecekeş zamanlı d. Göz ablasyon başarılı dekapitasyon daha gerçekleştirmek için teknik olarak zor olsa da, göz eksizyonu içeren güncel çalışmalar onların prosedürlerine ilişkin ayrıntılı talimatlar yer verilmemiştir. Bu video makalede amacı sürekli altta yatan beyin dokuları rahatsız ve mümkün olduğunca az diğer dokulara çıkarmadan planarian optik fincan kaldırmak için araştırmacılar sağlamaktır. Bu yöntem hem tek ve çift göz yakmakta ve araştırmaların geniş bir yelpazede uygulanabilir edilebilir. En yenilenmesi deneylerinde olduğu gibi, göz ablasyon farmakolojik ve genetik (RNAi) ekranlar, hem de davranışsal çalışmalar her iki kombinasyon için uygundur. Burada, solucan işlenmesi için yöntemler tarif bir planarian koloni bakımı ve göz ablasyon tekniği kendisi.

<table><tbody><tr><td>Anında Okyanus deniz tuzları</td><td>Spectrum Brands&nbsp;</td><td>SS15-10</td> <td>"10 Galon" kutusu&nbsp; (net ağırlık 3 lbs)</td></tr><tr><td>Kimwipes EX-L tüy bırakmayan mendil</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>4,5 x 8,5 inç&nbsp;</td></tr><tr><td>Whatman #2 filtre kağıdı</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>WHA1002125</td><td>Daireler, 125 mm çap, beyaz</td></tr><tr><td>Easy Touch İnsülin şırıngası (iğneli)</td><td>Pet Health Market</td><td>17175-04</td><td>&nbsp; U-100 1 cc şırınga, 31 G 5/16 inç iğne</td></tr><tr><td>100 mm Petri kabı</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>60 mm Petri kabı</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>60 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Dumont #5&nbsp; forseps&nbsp;</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>11254-20</td><td>Inox, düz uçlu, 11 cm</td></tr><tr><td>Transfer pipetleri&nbsp;</td><td>Samco Bilimsel&nbsp;</td><td>225</td><td>Dereceli, büyük ampul, 7.5 mL, non steril</td></tr><tr><td>Parafilm M parafin film</td><td>Markası&nbsp;</td><td>701606</td><td>&nbsp; 4 inç x 125 ft rulo</td></tr><tr><td>12 kuyulu işlenmemiş doku kültürü plakası</td><td>VWR</td><td>15705-059</td><td>İşlenmemiş, düz dipli, steril, Falcon marka</td></tr><tr><td>Plastik gıda kapları (koloni için)&nbsp;</td><td>Ziploc</td><td>Büyük dikdörtgen</td><td>2.25 qt (2.12 L), 10 "x 6 -3/4 " x 3 -3/16" &nbsp;</td></tr><tr><td>Planarya (Girardia tigrina)</td><td>Carolina Biological</td><td>132954</td><td>"kahverengi" planarya olarak satılır; en sık bunlar G. tigrina (diğer adıyla Dugesia tigrina), ancak bazen G. dorotocephala (diğer adıyla Dugesia dorotocephala); her ikisi de işe yarayacaktır.</td></tr><tr><td>Planarya (Schmidtea mediterranea)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>S. mediterranea ticari olarak mevcut değildir. Şu anda hayvanlar sadece onları kullanan ve fazladan hayvanları olan laboratuvarlardan temin edilebilir.</td></tr><tr><td>Kahverengi kağıt havlular&nbsp;</td><td>Grainger</td><td>2U229</td><td>9-3/16 x 9-3/8" 1 Katlı Çok Katlı Kağıt Havlu, AĞARTILMAMIŞ</td></tr><tr><td>Yıkama şişesi (solucan suyu için), isteğe bağlı</td><td>VWR</td><td>16650-275</td><td>Yıkama Şişeleri, Düşük Yoğunluklu Polietilen, Geniş Ağız, 500 mL</td></tr><tr><td>Anti-sinapsin antikoru, isteğe bağlı</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td>3C11</td><td>Süpernatant</td></tr><tr><td>Anti-arrestin antikoru, isteğe bağlı</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Ticari olarak mevcut değildir. Michael Levin, Tufts Üniversitesi</td></tr><tr><td>Nalgene Lowboy damacanadan musluklu (solucan suyu depolamak için) nazik hediye, isteğe bağlı</td><td>Nalge Nunc International Corporation</td><td>2324-0015</td><td>15 L,&nbsp; polipropilen, düşük profilli plastik koloni kaplarını doldurmayı kolaylaştırır&nbsp;</td></tr><tr><td>Özel Peltier plakası, isteğe bağlı</td><td>Williams Makinesi, Foxboro, MA&nbsp;</td><td>n / a</td><td>Tasarım özellikleri, Tufts Üniversitesi'nden Junji Morokuma'nın izniyle:&nbsp; Peltier plakası standart bir termoelektrik ısı pompasından yapılmıştır (örneğin, All Electronics Corp Katalog # PJT-1, 30 mm 2 ).&nbsp; Kare ısı pompası ince aynalı bir yüzeyle kaplanır, daha sonra dairesel bir pleksiglas formunda (~50 mm çapında) 30 mm2 kare bir deliğin içine yerleştirilir. Bu form, ısı pompasına benzer kalınlıktadır ve yuvarlak bir soğutucunun (~ 115 mm çapında) merkezinde iyi bir alete aynı hizada oturur. Form/ısı pompası&nbsp; Silikon bazlı ısı emici bileşiği ile lavaboya "ankrajlı". Uçlar, hem formdan hem de soğutucudan açılan deliklerden geçirilir. Soğutucunun alt yarısı, mikroskobunuzun taban plakasının açıklığına uyan bir "ayak" içine yerleştirilmiştir.</td></tr><tr><td>DC güç kaynağı (Peltier plakası için), isteğe bağlı</td><td>B & K Precision</td><td>1665</td><td>Ayarlı Alçak Gerilim DC Güç Kaynağı, 1-18 V (DC), 1-10 amper.</td></tr><tr><td>Diğer ortak malzemeler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eldiven</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tıraş bıçağı &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deveboynu aydınlatmalı</td><td></td><td></td><td></td>diseksiyon dürbünü</tr><tr><td>Çubuk dayanakları, isteğe bağlı</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cerrahi ablasyon tahlili planaryalar göz rejenerasyon incelenmesi için

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Yetişkin kök hücreleri ve rejeneratif mekanizmaların çalışmada planarya yassı kurtların vivo model sisteminde bir elyaf. Bu onların bol pluripotent kök hücre nüfus ve çoğu hayvanlar için felaket olacaktır yaralanmalar sonrasında tüm hücre ve doku tiplerini rejenere etme kabiliyetine büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Son zamanlarda, planarya göz rejenerasyon için bir model olarak popülerlik kazanmıştır. (Iki doku tiplerinin gibidir: pigment hücreleri ve fotoreseptör) tüm göz yeniden kabiliyetleri görme sistemi rejenerasyonunu düzenleyen mekanizmaların diseksiyon sağlar. Göz ablasyon rejenerasyon büyük ölçüde tek başına göz doku ile sınırlı olduğunu En önemli olan göz spesifik yolları ve mekanizmaları incelemek için (örneğin, başı kesilerek ya da delik açma gibi) diğer tekniklere göre çeşitli avantajlara sahiptir. Bu Video makalenin amacı güvenilir beyni rahatsız veya dokuları çevreleyen olmadan planarian optik fincan nasıl kaldırılacağını göstermektir.solucan ve kurulu bir koloninin bakım kullanımı da tarif edilmektedir. Bu teknik, cerrahi soğuk plaka üzerinde immobilize Planaryalar optik fincan oymak için bir 31 G, 5/16 inç insülin iğne kullanır. Bu yöntem geniş bir uygulama yelpazesi için izin 1-2 hafta içinde rejenere gözlü, tek ve çift göz ablasyon kapsar. Özel olarak, bu ablasyon tekniği kolayca rejeneratif mekanizmaları ve evrim, göz kök hücreleri ve bakım ve phototaxic davranışsal tepkileri ve nörolojik olarak daha iyi anlaşılması için farmakolojik ve genetik (RNA interferansı) ekranları ile birleştirilebilir.

ilk 1-2 saat sonra cerrahi, hayvanlar sağlam solucanlar (ancak yine de hareket edecek) ile karşılaştırıldığında hareket azalma gösterebilir. Arzu edildiği takdirde, solucanlar (RNAi beslenmesi için, örneğin) ameliyattan sonraki 24 saat içinde yiyeceklerdir. zamanla aynı bireylerde göz rejenerasyonu aşağıdaki, her iki ameliyat öncesi (bozulmamış) ve 1 saat sonrası ablasyon (HPA) her solucanın fotoğrafını çekmek için emin olun. 4 gün sonra ablasyonu (DPA) tarafından rejenere pigment hücrel...

Bu protokol sürekli çevredeki dokulara bozmadan planarian gözleri (optik bardak) çıkarılması için nasıl gösterir. ya bir ensülin iğne ve şırınga kullanılarak, ya da her iki gözü göz rejenerasyon, görsel yenilenme evrimi, ve ışık kaynaklı bir davranışın temel düzenleyici mekanizmalarının soruşturma kolaylaştırmak için kesilip edilebilir.

Cerrahi Ablasyon Tahlili Planaryalar Göz Rejenerasyon incelenmesi için

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Bu prosedürün genel amacı, planarya optik kubuğunun beyne veya çevre dokulara zarar vermeden güvenilir bir şekilde nasıl çıkarılacağını göstermek ve böylece tekniğin her eğitim seviyesindeki araştırmacılar ve öğrenciler tarafından uygulanabilmesini sağlamaktır. Bu yöntem, in vivo ortamda endojen göz kök hücrelerinin idamesini ve farklılaşmasını düzenleyen mekanizmaların belirlenmesi gibi rejenerasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların diğer dokulara minimum düzeyde müdahale ederek yalnızca göz dokularını çıkarmasına olanak tanımasıdır.Genel olarak, bu yöntemde yeni olan bireylerin, çevre dokuları ablate etmeden tüm gözü ablate ederek doğru miktarda dokuyu güvenilir bir şekilde çıkarabilmeleri için pratik yapmaları gerekir. Başlamak için, en az bir hafta boyunca beslenmemiş ve uzunluğu en az beş ila yedi milimetre olan solucanlar seçin. 15 ila 30 solucanı, üçte ikisi solucan suyu ile dolu 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve kapağı hemen kapatın.Solucanların hasarsız olduklarından ve yakın zamanda rejenerasyon geçirmediklerinden emin olmak için, beyaz başlar veya kuyruklar gibi eksik veya pigmentlenmemiş dokular olup olmadığını gözlemleyin. İlk olarak, çalışma alanını ve diseksiyon mikroskobu tabanını %70 etanol çözeltisi ile silin ve tamamen kurumaya bırakın. Seçilen solucanların bulunduğu kabı mikroskobun sol tarafına yerleştirin.Ardından, mikroskobun sağ tarafına bir çift beş numara pens, bir mililitrelik şırıngaya takılı 31 gauge 5/16 inçlik bir insülin iğnesi, temiz bir transfer pipeti ve ablate edilmiş solucanları toplamak için etiketlenmiş 12 kuyucuklu bir plaka yerleştirin. Hav bırakmayan doku mendillerinden oluşan bir kutuyu, taze solucan suyuyla doldurulmuş plastik bir yıkama şişesini ve cerrahi işlem sırasında kolayca erişilebilmesi için ek transfer pipetlerini yerleştirin. Bir Peltier plakasını diseksiyon mikroskobunun tabanının merkezine konumlandırın ve DC güç kaynağındaki çıkışı, Peltier plakasının yüzeyi solucanları hareketsiz kılacak kadar soğuk olacak şekilde ayarlayın.Alternatif olarak, Peltier plaka yerine buzla doldurulmuş bir Petri kabı kullanılabilir. Cerrahi yüzeyi hazırlamak için, önce beş santimetreye on santimetre boyutunda bir plastik parafin film parçası kesin ve bunu Peltier plakanın merkezine yerleştirin. Ardından, tüy bırakmayan bir doku mendilini yaklaşık iki santimetrelik bir kare şeklinde katlayın ve filmin üzerine yerleştirin.Ardından, katlanmış silme yerinde tutun, ılık suyla nemlendirin ve bir transfer pipeti yardımıyla silmeyi düz bir şekilde yuvarlayın. Son olarak, 1,5 ila iki santimetrekare boyutunda bir beyaz filtre kağıdı parçası kesin ve bunu silmenin üzerine yerleştirin. Cerrahi işleme başlamak için, transfer pipetini kullanarak bir solucanı sırt kısmı yukarı gelecek şekilde filtre kağıdının üzerine yerleştirin.Işığı açın ve ışını solucana odaklayın. Solucanın gözleri net bir şekilde görülecek şekilde diseksiyon mikroskobunun odağını ve büyütmesini ayarlayın. Solucanın başı araştırmacıya dönük olacak ve sağa doğru 30 ila 40 derece açılı duracak şekilde paraffin filmi döndürerek konumunu ayarlayın.Eğer solucan ventral tarafı yukarı bakacak şekilde konumlanmışsa ve faringeal açıklık görünür durumdaysa, solucanın konumunu gözler görünecek şekilde dorsal tarafı yukarı gelecek şekilde nazikçe değiştirmek için pensetin küt tarafını kullanın. Gözlerin net bir şekilde odaklanması için mikroskop ayarlarını yeniden düzenleyin. Ayrıca hem gözlerin hem de çevreleyen baş dokularının görüş alanında olduğundan emin olun.Temiz bir şırıngayı sağ elinizde başparmak ve işaret parmağı arasında tutun. Şırınganın alt kısmını, Peltier plakasına dayalı sol başparmağınızla destekleyin. İğne ucunun eğimli kısmının (bevel) göründüğünden emin olmak için mikroskoptan bakın.Prosedür sırasında yüzeyin sabit kalmasını sağlamak için sol işaret parmağını, sol başparmakla 40 derecelik bir açı oluşturacak şekilde cerrahi yüzeye yerleştirin. İğneyi, eğik ucu yukarı bakacak şekilde göze 90 derecelik bir açıyla konumlandırın. İğnenin ucuyla, gözün optik çukurunun üzerinde bulunan ve beyaz, pigmentsiz bölge olarak görünen ince doku tabakasını nazikçe delin.Sağdan sola doğru kepçe hareketi yaparak, optik çukur içerisinde bulunan tüm siyah pigmente dokuları ve tüm beyaz dokuları çok nazikçe temizleyin. Çift göz ablasyonu yapılıyorsa, ikinci gözü şimdi ablate edin. Cerrahi işlem tamamlandıktan sonra, pipete az miktarda solucan suyu çekin ve solucanı filtre kağıdından kaldırmak için suyu solucuğun üzerine bırakın.Solucanı hemen transfer pipetiyle çekin. Solucanı, üçte ikisi taze solucan suyu ile dolu olan etiketli 12 kuyucuklu bir plakaya taşıyın. Tüm solucanlar transfer edildikten sonra, kuyucuklardaki suyu taze solucan suyu ile değiştirerek onları yıkayın.Solucanları ışık korumalı olarak 20 derece Celsius'luk bir inkübatörde inkübe edin ve rejenerasyon sürecini izleyin. Canlı solucanları sakrifiye etmek için plakadaki solucan suyunu uzaklaştırın ve yerine %70 etanol ekleyin. Solucanları üç ila beş dakika boyunca inkübe edin ve solucanların liz olup grileşip grileşmediğini gözlemleyin.Burada, cerrahi işlemden önce, dört gün sonra ve iki hafta sonra çekilmiş, çift göz ablasyonu ve tek göz ablasyonu uygulanmış yassı solucanların fotoğrafları sunulmuştur. Görüntüler, zaman içinde gerçekleşen rejenerasyon ilerlemesini göstermektedir. Ablasyon uygulanan solucanlardaki göz rejenerasyonu, arrestin ve yeni gelişen fotoreseptör nöronların immünohistokimyasal boyaması ile de doğrulanmıştır.Yassı solucanlarda çift göz ablasyonu sonrası görme sisteminin iyileşmesi, yaban tipi ışık fobisi tepkisine dayalı fonksiyonel bir analizle de incelenmiştir. Ablasyondan 24 saat sonra, gözleri olmayan solucanlar ışıktan kaçınmazlar ve ışıklı bölgelerden geçerler. Fotofobi, işlemden yedi gün sonra yeniden sağlanmıştır; bu durum, rejenerasyon geçiren görme sisteminin fonksiyonel olduğunu göstermektedir.Yöntem kavrandıktan sonra, bir solucanın çift göz ablasyon prosedürü yaklaşık üç dakikada tamamlanabilir. Ablasyon işlemi sırasında, gözlerin arasındaki dokuya zarar vermemeye veya daha sonra gözün içine doğru dokuyu yırtmamaya dikkat ederek, gözün tüm pigmente ve pigmentsiz dokularının çıkarılması önemlidir. Bu prosedürün ardından, belirli genlerin rolünü ve rejenerasyon süreçlerini incelemek amacıyla immünohistokimya ve RNA interferansı gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Ek olarak, yeniden büyüme sonrası göz fonksiyonlarını test etmek için davranışsal analizler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, çevredeki dokulara zarar vermeden planarya gözlerinin nasıl çıkarılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İğnelerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın; eldiven giymek ve iğneyi kendinizden uzağa bakacak şekilde tutmak gibi önlemler alınmalıdır.

surgical-ablation-assay-for-studying-eye-regeneration-in-planarians

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Insanlarda akut böbrek hasarı (AKI), böbrek nefron oluşturan epitel hücrelerin zarar görmesine neden olduğu yaygın bir klinik sorundur ve AKI, yüksek ölüm oranları% 50-70 ile...

Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim

, Canlı hayvan içinde kök hücre farklılaşması çalışmak için cazip bir model planarian flatworm. Yenileme, temel laboratuvar kolayca yapılır basit amputasyon deneyleri ile çalışılmış ve farmakolojik ve genetik...

Farmakolojik ve Fonksiyonel Genetik Tahliller Planarian Rejenerasyon işleyin<emJaponica> Dugesia</em

Planaria arasında tanımlanmış ve tutarlı bir büyüklükte doku aşılama için etkili bir yöntem tarif edilmiştir. Ayrıca nakli için kullanılan immobilizasyon tekniği canlı hayvanların kısmi ışınlanması için kurşun kalkanlar, ile birlikte, nasıl uyarlanabileceğini bir açıklama dahildir.

Planarian İmmobilizasyon, Kısmi Işınlama, ve Doku Nakli

Kaynak: Volpe, B. A.,  et al. Zebra Balığı İnternöromast Hücrelerinde Konfokal Mikroskop Tabanlı Lazer Ablasyon ve Rejenerasyon Testi. J. Vis. Uzm. {{TAG_ 31}} (2020) Bu video, konfokal mikroskopi kullanarak zebra balıklarında internöromast hücre iyileşmesinin izlenmesini, hızlandırılmış floresan görüntüleme yoluyla hücre ölümünü ve onarımını izlemeyi göstermektedir.

Konfokal mikroskopi kullanılarak zebra balıklarında lazerle ablasyonlu internöromast hücrelerinin iyileşmesinin izlenmesi

Nörolojik ve non-nörolojik hastalıkların çok zebra balığı model yetişkin balık ziyade embriyo / larva incelenir için, erişkin zebrabalıkları hastalık modellerinde uygulanabilen bir nicel yan hat rejeneratif deneyi geliştirilmiştir. Deney 1) neuromast ve 2) tek tek saç hücre düzeyde çözünürlüğü dahil.

Yetişkin Zebra balığı Lateral Hat Rejenerasyon için bir Deneyi

Zebra balığı retina dejenerasyonu/rejenerasyon omurgalılarda mekanizmaları incelemek için popüler bir hayvan modelidir. Bu iletişim kuralı yerelleştirilmiş yaralanma dış retina iç retina en az hasar ile kesintiye neden yöntemi açıklanır. Daha sonra in vivo retina morfoloji ve Müller glia yanıt retina yeniden oluşturma işlemi boyunca izliyoruz.

Bir lazer kaynaklı retina dejenerasyonu, Zebra balığı rejenerasyon modelini Müller Glia hücre aktivasyonu

Planarian Schmidtea mediterranea kök hücre ve doku rejenerasyonu çalışmak için mükemmel bir modeldir. Bu yayın seçerek bir organ, yutak, kimyasal sodyum azid hayvanlara açarak kaldırın yöntemi açıklanır. Bu iletişim kuralı Ayrıca yutak rejenerasyon izlemek için yöntem açıklar.

Kimyasal amputasyon ve yeniden oluşturulmasını Planarian Schmidtea mediterranea yutak

Lazer ablasyon biyolojik sistemlerde rejenerasyon eğitimi için yaygın olarak uygulanan bir teknolojidir. Sunulan protokol, lazer ablasyon için standart bir lazer tarama konfokal mikroskobu ve zebrabalığı lateral hattında ki internöromast hücrelerinin yenilenmesinin daha sonra zaman atlamalı görüntülemesini açıklar.

Zebrabalığı İnternöromast Hücrelerinde Konfokal Mikroskop Tabanlı Lazer Ablasyon ve Rejenerasyon Tonu

Makale, retinal girdinin optik tektum büyümesini ve gelişimini nasıl etkilediğini araştırmaya yönelik ilk adım olarak canlı zebra balığı larvalarından gözlerin cerrahi olarak nasıl çıkarılacağını açıklamaktadır. Ek olarak, makale larva anesteziizasyonu, fiksasyon ve beyin diseksiyonu, ardından immünohistokimya ve konfokal görüntüleme hakkında bilgi vermektedir.

Görsel Sistemin Innervasyona Bağlı Büyümesini ve Gelişimini İncelemek için Canlı Zebra Balığı Larvalarında Göz Çıkarılması

Bu protokol, transgenik zebra balığı modeli kullanarak retinal pigment epitelini (RPE) genetik olarak ablate etme metodolojisini açıklamaktadır. Farmakolojik bileşikler kullanarak sinyal yolu modülasyonunu içerecek şekilde protokolün uyarlanması kapsamlı bir şekilde detaylandırılmıştır. Pigmentasyona dayalı RPE rejenerasyonunu ölçmek için bir MATLAB platformu geliştirildi ve sunuldu ve tartışıldı.

Zebra Balığı Retinal Pigment Epitelinin Rejenerasyonunu İncelemek için Nitroredüktaz / Metronidazol Aracılı Ablasyon ve Bir MATLAB Platformu (RpEGEN)

Burada, korneayı innerve eden duyu liflerine zarar vermek için üç farklı yöntem öneriyoruz. Bu yöntemler, farelerde akson rejenerasyonunun incelenmesini kolaylaştırır. Diğer hayvan modellerine uyarlanabilen bu üç yöntem, kornea innervasyon fizyolojisi ve rejenerasyonunun incelenmesi için idealdir.

Murin Korneasında Nörotrofik Keratit ve Sinir Rejenerasyonunu İndüklemek için Üç Strateji

Öğrenin planaryalarda göz rejenerasyon mekanizmalarını incelemek için cerrahi ablasyon tekniğini. Bu yöntem, kök hücre biyolojisi ve nörobilim araştırmalarında göz dokusunun minimal hasarla çıkarılmasını sağlar.

Cerrahi Ablasyon Tahlili Planaryalar Göz Rejenerasyon incelenmesi için

Daha fazla video keşfet