Voltaj kelepçesi florometrisi

Bu prosedürün genel amacı, Xenopus oositlerinde eksprese edilen bir membran proteinine floresan bir doğal olmayan amino asit yerleştirmek ve voltaj-klamp florometrisi kullanarak proteinin fonksiyonunu ve yapısal yeniden düzenlenmesini eş zamanlı olarak belirlemektir. Bu teknik, membran proteinlerinin yapı-fonksiyon ilişkileri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Voltaj-klamp florometrisi kullanarak, yapısal yeniden düzenlenmeleri doğrudan protein fonksiyonu ile ilişkilendirebiliriz.

Buna floresan doğal olmayan amino asit etiketlemesinin eklenmesi, etiketlemeye yönelik önceki kısıtlamaların aşılmasına yardımcı olmuştur. Bunlar, etiketleme bölgelerinin erişilebilirliğinin yanı sıra endojen bağlanma bölgelerinden kaynaklanan arka plan etiketlemesiydi. Bu tekniğin önemi, artık geleneksel voltaj-klemp florometrisi ile daha önce erişilemeyen bölgeleri inceleyebildiğiniz için membran proteinlerinin biyofiziksel olarak daha iyi anlaşılmasına kadar uzanmaktadır.

Xenopus oositlerinin cerrahi olarak çıkarılmasının ardından, oositleri SOS çözeltisi ile üç kez yıkayın. Büyük ve sağlıklı oositleri tek tek seçin ve enjeksiyondan önce antibiyotikler ve %5 at serumu ile desteklenmiş Barth çözeltisi içinde 18 °C'de en az dört saat inkübe edin. DNA'nın nükleer enjeksiyonu için, oositlere zarar vermeden çekirdeğe ulaşabilecek uzun ve ince bir enjeksiyon ucu hazırlayın.

Ardından, enjeksiyon ucunu yağ ile doldurun ve enjeksiyon ucunu nanoinjektör cihazına monte edin. Sonra, nanoinjektörü bir stereo mikroskop altına yerleştirin ve ucun ucunu penset ile kırın. Bundan sonra, ucun uç kısmında hapsolmuş hava kabarcığı kalmayana kadar yağı dışarı itin.

Ardından, stereoskop altında bir parça Parafilm üzerine nükleaz içermeyen su içinde 0.1 µg/µL pAnap'tan bir mikrolitre yerleştirin ve enjeksiyon ucunu DNA ile doldurun. Daha sonra oositleri, antibiyotiklerle takviye edilmiş Barth çözeltisi içeren, ağ şeklinde bir enjeksiyon kabına aktarın. Oosit çekirdeği animal kutupta yer aldığı için, enjeksiyon ucunu animal kutbun merkezine yönlendirin ve uç animal hemisferin merkezine yakın bir noktaya ulaşacak şekilde batırın.

Ardından, her bir oositin çekirdeğine 9.2 nanolitre pAnap çözeltisi enjekte edin. Sonrasında, Anap-spesifik tRNA'ların ve tRNA sentetazların güçlü ekspresyonuna izin vermek için oositleri; antibiyotikler ve %5 at serumu ile takviye edilmiş iki mililitre Barth çözeltisi içinde, 18 °C'de altı ila 24 saat boyunca inkübe edin. Şimdi, nanoinjektörü tekrar hazırlayın; ancak bu kez, enjeksiyon ucunun DNA enjeksiyonunda kullanılan kadar ince olmasına gerek yoktur.

Anap'ın fotobeyazlamasını önlemek için bu noktadan itibaren yalnızca kırmızı ışık altında çalışın. Bir mikrolitre 1 mM Anap'ı, bir mikrolitre 1-2 µg/µL mRNA ile doğrudan bir Parafilm parçası üzerinde karıştırın ve enjeksiyon ucunu karışım çözeltiyle doldurun. Ucu, membranının hemen altındaki vejetal kutba batırın ve her bir pAnap enjekte edilmiş oosite 46 nL karışım çözeltisi enjekte edin.

Ardından, oositleri ışık sızdırmayan bir kutuya yerleştirerek veya flaskı alüminyum folyo ile sararak ışıktan koruyun. Antibiyotikler ve %5 at serumu ile desteklenmiş Barth çözeltisi içerisinde, 18 °C'de iki ila üç gün inkübe edin. Çözeltiyi her gün taze Barth çözeltisi ile değiştirin ve kontaminasyonu önlemek için ölü oositleri uzaklaştırın.

Bu düzenekte, kesik-açık voltaj-clamp ekipmanı bir floresan mikroskopi düzeneğine entegre edilmiştir. Kayıt odası, oositin yerleştirilmesi için kullanılan standart stereoskop ile floresan ölçümlerinin gerçekleştirildiği mikroskop arasında hareket etmesini sağlayan bir sürgü üzerine kurulmuştur. Bir fotodiyot tespit sistemi, floresan mikroskobun C-mount çıkış portuna bağlanmış olup, fotoakım çıktısı dijital sinyal işlemcisindeki ikinci giriş kanalına bağlanmıştır.

Floresans eksitasyonu için ışık kaynağı olarak 100 watt, 12 voltluk bir halojen lamba kullanılır. Eksitasyon, eksitasyon ışık kaynağı ile mikroskop arasında bulunan mekanik bir shutter (perde) tarafından kontrol edilir. Aktivasyon, kayıt yazılımında zamanlanmış olan ve shutter'ın kaydın başlamasından yaklaşık 100 milisaniye önce açılmasını sağlayan dijital sinyal işlemciden gelen bir TTL sinyali ile tetiklenir; ayrıca filtre küpü taretinde uygun bir filtre küpü bulunmalıdır.

İki renkli VCF için, kayıt işleminden hemen önce hazırlanan oositleri, etiketleme solüsyonu içindeki beş mikromolar TMR maleimid ile 15 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, kayıt öncesinde fazla boyayı uzaklaştırmak için oositleri etiketleme solüsyonu ile üç kez yıkayın. Bu noktada protein, iki farklı florofor ile spesifik olarak etiketlenmiş olur.

Oosit montajından sonra, hayvan kutbu yukarı bakacak şekilde ve permeabilize edilmiş haldeyken, hazneyi mikroskoba kaydırın ve 4X objektif kullanarak oosite odaklanın. Ardından, oositi voltaj duyarlı bir V1 elektrodu ile delin. Son olarak, 40X su daldırma objektife geçiş yapın.

Yukarı bakan hayvan kutbuna odaklanın. Ardından kırmızı ışığı kapatın. Filtre küpü taretini çevirerek Anap filtre küpünü ve fotodiyoda bağlı optik çıkış portunu seçin.

Ardından, halojen lambayı en yüksek yoğunlukta açın ve oositten kaynaklanan arka plan floresans yoğunluğunu okumak için dekapanşörü iki ila beş saniye boyunca açık tutun. Sonrasında, klempi açın, banyo/koruma anahtarını aktif konuma getirin ve kafa ünitesindeki düğmeyi çevirerek membran potansiyelini komut potansiyeline ayarlayın. Daha sonra, kayıt yazılımında tutma potansiyelini, basamak protokolünü, puls sayısını ve uzunluğunu seçin.

Ardından, voltaj bağımlı akımları ve Anap floresans yoğunluklarını kaydedin. İki renkli VCF için, küp taretini çevirerek TMR filtre küpünü seçin. Anap için açıklandığı gibi TMR için arka plan floresansını okuyun ve voltaj bağımlı akımları ve TMR floresans yoğunluğunu eş zamanlı olarak kaydedin.

Bu şekil, Shaker mutantı eksprese eden aynı oositinden elde edilen basamak protokollerini kullanarak Anap ve TMR floresan sinyallerini göstermektedir. L382 stop W434F arka planına, harici solüsyonla erişilebilen bir sistein ekleyip bunu TMR maleimid ile etiketleyerek, aynı proteinin farklı bölgelerindeki gerçek zamanlı hareketleri eş zamanlı olarak incelemek mümkündür. Floresan voltaj ilişkisi, kararlı durum floresan yoğunluğunun voltaja karşı grafiği çizilerek elde edilir.

Bu videoyu izledikten sonra, floresan doğal olmayan amino asitlerin Xenopus oositlerine nasıl ifade ettirileceği ve tek renkli veya iki renkli voltaj-clamp florometrisi işleminin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Tekniğe hakim olduğunuzda, işlem kabaca geleneksel elektrofizyoloji deneyleriyle aynı kadar zaman alacaktır; tek fark, oosit çekirdeğine DNA enjekte etme şeklindeki ek adımdır. Bu prosedürü uygularken, doğal olmayan amino asit yokluğunda sızıntı ekspresyonu (leak expression) olup olmadığını kontrol etmeyi hatırlamak önemlidir.

Sızıntı ekspresyon miktarı, stop kodonunun protein içindeki yerleşim yerine bağlı olduğundan, bu işlemin her mutasyon için tekrarlanması gerekir. Bu teknik, artık araştırmacıların, birçok düzenleyici mekanizmanın gerçekleştiği proteinin sitozolik bölgesindeki konformasyonel değişiklikleri incelemesine olanak tanımaktadır.