Voltaj kelepçesi florometrisi Xenopus

Bu makale, iyon kanallarındaki yapısal yeniden düzenlenmeleri araştırmak için maleimid boyaları yerine Floresan Doğal olmayan Amino Asitlerin (fUAA) kullanıldığı klasik Voltaj-Kelepçe Florometrisinin (VCF) geliştirilmesini anlatıyor. Prosedür, Xenopus oosit DNA enjeksiyonu, RNA / fUAA koinjeksiyon ve eşzamanlı akım ve flüoresans ölçümlerini içerir.

Bu prosedürün genel amacı, Xenopus oositlerinde eksprese edilen bir zar proteinine floresan doğal olmayan bir amino asit eklemek ve voltaj kelepçesi florometrisi kullanarak proteinin işlevini ve yapısal yeniden düzenlemesini aynı anda belirlemektir. Bu teknik, zar proteinlerinin yapı fonksiyon ilişkileri alanındaki temel soruların cevaplanmasına yardımcı olacaktır. Voltaj kelepçesi florometrisi kullanarak, yapısal yeniden düzenlemeleri protein fonksiyonu ile doğrudan ilişkilendirebiliriz.

Buna floresan doğal olmayan amino asit etiketlemesi eklemek, etiketlemedeki önceki sınırlamaların üstesinden gelmeye yardımcı olur. Bu, bir zamanlar etiketleme bölgelerinin erişilebilirliğinin yanı sıra endojen bağlanma bölgeleri nedeniyle arka plan etiketlemesiydi. Bu tekniğin anlamı, zar proteinlerinin daha iyi bir biyofiziksel anlayışına doğru uzanır, çünkü artık daha önce geleneksel voltaj kelepçesi florometrisi ile erişilemeyen alanları araştırabilirsiniz.

Xenopus oositlerinin cerrahi olarak çıkarılmasından sonra, oositleri SOS solüsyonu ile üç kez yıkayın. Büyük ve sağlıklı oositleri tek tek seçin ve enjeksiyondan önce antibiyotik ve% 5 at serumu ile desteklenmiş Barth solüsyonunda en az dört saat boyunca 18 santigrat derecede inkübe edin. DNA'nın nükleer enjeksiyonu için, oositlere zarar vermeden çekirdeğe ulaşmak için uzun ve ince bir enjeksiyon ucu hazırlayın.

Ardından enjeksiyon ucunu yağ ile doldurun ve enjeksiyon ucunu nanoenjektör cihazına monte edin. Daha sonra, nanoenjektörü bir stereo mikroskop altına yerleştirin ve ucun ucunu forseps ile kırın. Bundan sonra, ucun ucunda sıkışmış hava kabarcığı kalmayana kadar yağı çıkarın.

Bunu takiben, stereoskopun altındaki bir Parafilm parçası üzerine nükleaz içermeyen suya mikrolitre başına 0.1 mikrogram pAnap yerleştirin ve enjeksiyon ucunu DNA ile doldurun. Daha sonra, oositleri antibiyotiklerle takviye edilmiş Barth solüsyonu içeren ağ içeren bir enjeksiyon kabına aktarın. Oosit çekirdeği hayvan direğinde bulunduğundan, enjeksiyon ucunu hayvan direğinin ortasına doğrultun ve uç hayvan yarım küresinin merkezine yakın bir yere ulaşacak şekilde kazığa oturtun.

Daha sonra, her oositin çekirdeğine 9.2 nanolitre pAnap çözeltisi enjekte edin. Daha sonra, Anap'a özgü tRNA'ların ve tRNA sentetazlarının sağlam bir şekilde ekspresyonunu sağlamak için oositleri antibiyotikler ve% 5 at serumu ile desteklenmiş iki mililitre Barth solüsyonunda 18 santigrat derecede altı ila 24 saat inkübe edin. Şimdi, nanoenjektörü tekrar hazırlayın, ancak bu sefer enjeksiyon ucunun DNA enjeksiyonu için olan kadar ince olmasına gerek yok.

Anap'ın foto-ağartılmasını önlemek için bu noktadan sadece kırmızı ışıkta çalışın. Bir mikrolitre bir milimolar Anap'ı mikrolitre mRNA başına bir ila iki mikrogram ile doğrudan bir parça Parafilm üzerinde karıştırın ve enjeksiyon ucunu karışım çözeltisiyle doldurun. Ucu zarın hemen altındaki bitkisel direğe batırın ve pAnap enjekte edilen her oosite 46 nanolitre karışım çözeltisi enjekte edin.

Daha sonra yumurtaları ışık geçirmez bir kutuya koyarak veya şişeyi alüminyum folyoya sararak ışıktan koruyun. Onları iki ila üç gün boyunca antibiyotikler ve% 5 at serumu ile desteklenmiş 18 santigrat derecede Barth solüsyonunda inkübe edin. Her gün taze Barth solüsyonu ile değiştirin ve kontaminasyonu önlemek için ölü oositleri çıkarın.

Bu kurulumda, kesme voltajı kelepçesi ekipmanı bir floresan mikroskobu kurulumuna entegre edilmiştir. Kayıt odası, oositi yerleştirmek için standart stereoskop ile floresan ölçümleri yapmak için mikroskop arasında hareket etmesine izin veren bir kaydırıcı üzerine monte edilmiştir. Floresan mikroskobunun C montajlı çıkış portuna bir fotodiyot algılama sistemi bağlanır ve fotoakım okuması, dijital sinyal işlemcisindeki ikinci bir giriş kanalına bağlanır.

Floresan uyarımı için bir ışık kaynağı olarak 100 watt, 12 voltluk bir halojen lamba kullanılır. Uyarma, uyarma ışık kaynağı ile mikroskop arasındaki mekanik bir deklanşör tarafından kontrol edilir. Aktivasyon, kayıt yazılımında zamanlanan dijital sinyal işlemcisinden gelen bir TTL darbesi ile tetiklenir, böylece deklanşör kaydın başlamasından yaklaşık 100 milisaniye önce açılır ve filtre küpü taretinde uygun bir filtre küpü gereklidir.

İki renkli VCF için, hazırlanan oositleri kayıttan hemen önce 15 dakika boyunca etiketleme çözeltisinde beş mikromolar TMR maleimid içinde inkübe edin. Ardından, kayıttan önce fazla boyayı çıkarmak için oositleri etiketleme solüsyonu ile üç kez yıkayın. Bu noktada, protein özel olarak iki farklı florofor ile etiketlenir.

Oosit montajından sonra, hayvan direği yukarı bakacak ve geçirgen olacak şekilde, odayı mikroskoba kaydırın ve 4X objektif kullanarak oosit üzerine odaklanın. Ardından, oositi voltaj algılayıcı bir V1 elektrot ile kazın. Ardından, 40X suya daldırma hedefine geçin.

Yukarı bakan hayvan direğine odaklanın. Bundan sonra kırmızı ışığı kapatın. Filtre küpü taretini ve fotodiyota bağlı optik çıkış portunu çevirerek Anap filtre küpünü seçin.

Bunu takiben, halojen lambayı en yüksek yoğunlukta açın ve oositten kaynaklanan arka plan floresan yoğunluğunu okumak için deklanşörü iki ila beş saniye açın. Daha sonra, cl'yi açınamp, banyo/koruma anahtarını aktif konuma getirin ve başlıktaki düğmeyi çevirerek membran potansiyelini komut potansiyeline ayarlayın.tage. Ardından, kayıt yazılımında tutma potansiyelini, adım protokolünü, darbelerin sayısını ve uzunluğunu seçin.

Ardından, voltaja bağlı akımları ve Anap floresan yoğunluklarını kaydedin. İki renkli VCF için, küp taretini çevirerek TMR filtre küpünü seçin. Anap için açıklandığı gibi TMR için arka plan floresansını okuyun ve voltaja bağlı akımları ve TMR floresan yoğunluğunu aynı anda kaydedin.

Bu şekil, bir Shaker mutantını ifade eden aynı oositten elde edilen adım protokollerini kullanarak Anap ve TMR floresan sinyallerini gösterir. L382 durdurucu W434F arka planına harici çözeltiden erişilebilen bir sistein ekleyerek ve bunu TMR maleimid ile etiketleyerek, aynı proteinin farklı bölgelerindeki gerçek zamanlı hareketleri aynı anda araştırmak mümkündür. Floresan voltaj ilişkisi, voltaja karşı kararlı durum floresan yoğunluğunun çizilmesiyle elde edilir.

Bu videoyu izledikten sonra, floresan doğal olmayan amino asitlerin Xenopus oositlerine nasıl eksprese edileceğini ve tek renkli veya iki renkli voltaj kelepçesi florometrisinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Tekniğe hakim olduktan sonra, kabaca geleneksel elektrofizyoloji deneyleriyle aynı miktarda zaman almalıdır, sadece oositin çekirdeğine DNA enjekte etmek için fazladan bir adımınız vardır. Bu prosedürü denerken, doğal olmayan amino asidin yokluğunda sızıntı ifadesini kontrol etmeyi unutmamak önemlidir.

Bu, her mutasyon için yapılmalıdır, çünkü sızıntı ifadesinin miktarı, protein içindeki durdurma kodonunun yerleştirme yerine bağlıdır. Bu teknik şimdi araştırmacıların, düzenleyici mekanizmaların çoğunun meydana geldiği proteinin sitozolik bölgesindeki konformasyonel değişiklikleri incelemelerini sağlıyor.