Kronik Travmatik Ensefalopatiyi Modelleyen Yeni Bir Yöntem Drosophila

Burada, Drosophila melanogaster'de kapalı kafa travmatik beyin hasarına neden olan yeni bir yaklaşım açıklıyoruz. Metodumuz, başa tek başına ayarlanabilen mukavemetli tekrarlayan çarpmalara doğrudan sahip olma avantajına sahiptir. Omurgasız sistemin daha fazla araştırılması kronik travmatik ensefalopati patogenezinin aydınlatılmasına yardımcı olacaktır.

Bu yeni prosedürün genel amacı, yeni bir kronik travmatik ensefalopati modeli oluşturmak için meyve sineği Drosophila'da kapalı travmatik beyin yaralanmalarına neden olmaktır. Bu yöntem, tekrarlayan travmanın nöron dejenerasyonunu nasıl indüklediği gibi kronik travmatik ensefalopati alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ayarlanabilir güçlerin tekrarlayan etkilerini, hayvan vücudunun diğer kısımlarına zarar vermeden doğrudan sinek kafasına iletmesidir.

Bu yöntemin gerçek dünyada gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü cihazın montajı ve sinek yükleme adımlarının öğrenilmesi zordur, çünkü Drosophila kafası çok küçüktür ve darbeyi sadece kafaya uygulamak önemlidir. Meyve sineklerini sarsmak veya vurmak için kullanılan aparatı yapmak için önce aparatın çarpma tertibatını yapın. Pistonu bir mililitrelik polikarbonat tüberkülin şırıngasından çıkarın ve ardından namluyu bir mililitre işaretinde kesin.

Bir çarpma tertibatı için, 200 mikrolitrelik pipet ucunda bulunan aerosol bariyerini kullanın. Bu çarpma tertibatı üç milimetre uzunluğunda ve dört milimetre çapında olmalıdır. Ardından, çarpma tertibatını düz tarafı memeye bakacak şekilde şırınga namlusuna yerleştirin.

Kuvvet sağlamak için, şırınga haznesini bir karbondioksit akış regülatörüne takın. Regülatör, bir Açma, Kapama geçiş anahtarına ve gaz akış hızının iyi bir kontrolüne sahip olmalıdır. Ardından, namluyu dikey olarak demir bir standa sıkıştırın, böylece çarpma tertibatı namlunun dibine düşecektir.

Sonra, sinek tutucuyu yapın. 200 mikrolitrelik bir pipet ucuyla başlayın. 8 milimetre çapında bir açıklık oluşturmak için pipetin ucunu küçük uçtan beş milimetre kesin.

Bu delikten bir sinek kafası sığacak, ancak göğüs kafesi sığmayacaktır. Son olarak, sinek tutucu ve çarpma tertibatı için bir tane yapın. İlk olarak, küçük açıklıktan 44 milimetre uzakta bir mililitrelik pipet ucu kesin.

İkinci olarak, bir mililitrelik bir şırınga için iğne kapağından altı milimetre uzunluğunda bir uzunluk kesin. Ardından, ikisini bir araya getirin. Karbondioksit kullanarak tek, iki günlük yetişkin bir dişi sineği uyuşturun.

Karbondioksit pedinden ince bir fırça kullanarak sineği nazikçe tutucuya aktarın. Ardından, kafa uçtan dışarı çıkana kadar tutucuya hafifçe vurun. Hortum açığa çıkarsa, körelmiş, bir mililitrelik şırınga iğnesi kullanarak yavaşça ucun içine geri sokun.

Sinek gövdesini, özellikle ağız kısmını, tutucunun içinde tutmak çok önemlidir. Aksi takdirde, sinek iç organlara zarar vermekten veya yiyecek yiyememekten ölebilir. Ardından, gaz basıncını 100 kilopaskal'a ayarlayın ve akışı gerektiği gibi ayarlayın.

Sinek yüklendikten sonra, sinek kafası aşağı bakacak şekilde konektörü kullanarak tutucuyu şırınga namlusuna sıkın. Ardından, geçiş anahtarını kullanarak, çarpma tertibatını sineğe yalnızca bir kez çarpacak şekilde hareket ettiren bir gaz patlaması gönderin. Şimdi, sinek tutucuyu ayırın ve sineği karbondioksit pedine geri boşaltın.

İyileşene kadar sineği boş bir şişeye fırçalayın. Flakon başına bir sinek bulundurun. Kurtarma işlemi sadece birkaç dakika sürer.

Deney grubu başına dört sineği test etmek için işlemi tekrarlayın. Bir test ve bir sahte olmak üzere iki grubun işlenmesi sadece 20 ila 30 dakika sürmelidir. Çarpma tertibatı tüpüne bir aerosol bariyeri dahil etmemek dışında, şemşeklere tıpkı test hayvanları gibi davranın.

Bir Petri kabındaki sinek hareketlerini izlemek için, önce izleme alanını yapmak için altı santimetrelik bir çanağı şeffaf silikon elastomer ile doldurun. Silikon ile kapak arasında üç milimetre boşluk bırakın, böylece sinekler boşlukta serbestçe yürüyebilir, ancak uçamazlar. İzleme alanının altında beyaz bir arka plan var.

Daha sonra, aynı tedavi grubundan dört sineği uyuşturun ve onları arenaya yerleştirin. Sineklerin bir saat boyunca tamamen aydınlatılması ve yaklaşık 22 santigrat derecede olması gereken arenaya alışmasına izin verin. Oda sıcaklığından daha sıcak değil.

Bir saat sonra, sineğin aktivitesini beş dakika boyunca kaydetmek için arenanın üzerine yerleştirilmiş şarj bağlantılı bir cihaz kamerası kullanın. Beş dakikalık kayıttan sonra, arenadaki sinekleri uyuşturun ve onları yeni bir ev şişesine geri koyun. Ardından, arenayı atın.

Daha sonra, ücretsiz olarak sunulan Ctrax yazılımını kullanarak kayıtları analiz edin. Bu yazılım, MATLAB formatı gibi programlanabilir dil uyumlu bir formatta dışa aktarılabilen izleme verileri üretir. Verilerden, kare başına kat edilen mesafeyi, her sinek için ortalama yürüme mesafesini ve sinek başına kat edilen ortalama mesafeyi hesaplayın.

İstatistiksel anlamlılık için, tedavi grubu başına yaklaşık 100 sineği test etmeyi bekleyin. Kronik travmatik ensefalopati modeli oluşturmak için, çarpma aparatı tarafından farklı hızlarda yapılan tek bir kapalı kafa travmasının etkinliği, iki günlük Kanton-S kadınları kullanılarak analiz edildi. Gaz basıncı 100 kilopaskalda tutuldu.

Test edilen en yüksek akış hızında tek bir darbeye maruz kalan sinekler, minimum dış kusurlar sergiledi. Dış hasar için net bir kanıt olmamasına rağmen, dakikada 15 litre akış hızındaki yaralanmalar akut ölümcüldü ve 24 saat içinde %10'dan daha az hayatta kalma ile sonuçlandı. Daha düşük akış hızları ile hayatta kalma arttı.

Dakikada beş litre veya daha az bir oranda yüzde yüz hayatta kalma elde edildi, bu nedenle model için standart olarak dakikada beş litre seçildi. Vurulduktan hemen sonra, sinekler dört dakika içinde yavaş yavaş hareketliliklerini geri kazandılar. Şems'in toparlanması yaklaşık bir dakika daha hızlıydı.

Lokomotif işlevini ölçmek için çarpma sonrası, video destekli hareket takibi kullanıldı. Çarpışmadan sonraki iki gün boyunca, hareket yavaş yavaş normale döndü. Kademeli iyileşme için bu kanıt, insanlarda CTE iyileşmesi ile uyumludur.

Uzun vadeli etkileri değerlendirmek için, beş gün boyunca beş grevden oluşan tekrarlayan bir travmatik beyin hasarı protokolü uygulandı. Tedaviden yirmi gün sonra, her grupta hayatta kalan üyelerin hareketleri karşılaştırıldı ve tedavi edilen grup açıkça daha az yürüdü. Tedavi edilen grubun ömrü de önemli ölçüde azaldı ve kontroller için 37 güne kıyasla medyan 26 gün oldu.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, klasik hayvan modeli Drosophila melanogaster'deki patojenik mekanizmaları keşfetmek için hafif tekrarlayan travmatik beyin hasarı alanındaki araştırmacıların yolunu açıyor. Bu prosedürü denerken, hortumu, göğüs kafesini ve karnı aerosol bariyerinin doğrudan etkisinden korumayı unutmamak önemlidir.