Name: Dondurularak Kurutulmuş Berry Tozundan Polifenollerin Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Tedavisinde Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması In vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Öğrenin, dondurularak kurutulmuş böğürtlenlerden ultrasonik ekstraksiyon ve kloroform/etil asetat saflaştırma ile polifenol izole etme yöntemini. Bu teknik, vasküler düz kas hücrelerinde kardiyovasküler koruma mekanizmalarını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği (14GRNT20180028) ve Florida Eyalet Araştırma ve Yaratıcılık Konseyi (COFRS) tarafından finanse edildi.

1. Reaktiflerin Hazırlanması <ol><li> 80 mL mutlak etanol (moleküler biyoloji sınıfı) ve 20 mL hücre kültürü dereceli steril su karıştırılarak% 80 etanol (100 mL) hazırlayın. </li><li> Polifenol özütü (10 mg / mL) hazırlamak için, 10 mg CE veya PE ağırlığındasınız. Bir hücre kültür kapağının altında 1 mL düz Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ekleyin. Çözümü vorteksleyin. 200 μL&#39;lik kısımlar halinde alikotu ve -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Lizis tamponunu hazırlayın. <ol><li> 5 mL 1 M HEPES stok solüsyonu (pH 7.4, son 50 mM), 1 mL 5 M NaCl stok çözeltisi (50 mM nihai), 1 mL 0.5 M EDTA stok solüsyonu (5 mM nihai), 2 mL 0.5 M NaF stok çözeltisi (son 10 mM), 286 uL 700 mM Na3VO4 stok solüsyonu (2 mM nihai), 5 mL 200 mM Na4P207 stok çözeltisi (10 mM nihai) ve 5 mL % 20 Triton-X-100 stok solüsyonu suda (% 1 final) hazırlandı. 100 mL&#39;lik bir hacme ulaşmak için su ekleyin. 4 ° C&#39;de tutun. </li><lI&gt; 10 μL / mL proteaz inhibitörü kokteyli ekleyin. Hücreler, liziz için hazır olduğunda taze ekleyin. </li></ol></li><li> Laemmli numune tamponunu (4x) hazırlayın. <ol><li> 31.25 mL 2 M Tris stok solüsyonu (pH 6.8), 100 mL gliserol, 50 mL% 20 Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) çözeltisi ve 50 mL β-merkaptoetanol ilave edin. 250 mL&#39;ye kadar su ilave edin. 4 ° C&#39;de tutun. </li></ol></li><li> Tris Tamponlu Tuz (TBS) tamponu hazırlamak için 3 g Tris (25 mM nihai), 0.18 g KCI (2.5 mM nihai) ve 8.76 g NaCl (150 mM nihai) tartın. PH&#39;ı 7.4&#39;e ayarlayın ve 1 L&#39;ye kadar su ekleyin. RT&#39;de tutun. </li><li> TBS-T&#39;yi hazırlamak için, 997.5 mL TBS ve su içinde hazırlanmış 2.5 mL% 20 Triton-X-100 solüsyonu ilave edin. RT&#39;de tutun. </li></ol> 2. Siyahan Ekstrelerinin Hazırlanması <ol><li> Dondurularak kurutulmuş çilek tozundan ham özütün hazırlanması. <ol><li> 10 g dondurularak kurutulmuş böğürtlen tozu (veya 5 g taze toz) tartılır. Donmuş meyve kullanılırsa, i kesÇıkarmaya başlamadan önce çok küçük parçalara. </li><li> Meyve tozu 100 mL% 80 sulu etanol ile 1 L yuvarlak tabanlı Erlenmeyer şişe içinde karıştırılır. </li><li> Karışımı 25 dakika süreyle 42 kHz&#39;de 135 W, ultrasonik bir banyo kullanarak herhangi bir zaman aralığı olmadan 20 dakika süreyle sonike hale getirin. Sonikasyonu, azotlu ışıkta sürekli nitrojen tasfiye ederek gerçekleştirin. Dondurulmuş meyveler için kuluçka süresini 4 saate çıkarın. </li><li> Karışımı # 2 filtre kağıdından geçirerek vakumlu emmeli soğutulmuş Buchner hunisini kullanarak filtre edin. NOT: Bu adımın sonunda, numunenin artıkları filtre kağıdında görünür; Buna filtre kek denir. </li><li> Filtre pastasını 50 mL% 100 etanol ile durulayın. Süzüntüsünü saklayın ve filtre keki 100 mL% 80 sulu etanol içeren 1 L&#39;lik yuvarlak tabanlı bir şişeye ekleyin. </li><li> Artık madde için ekstraksiyon işlemini tekrarlayın (aşamalar 2.1.2 - 2.1.4 adımları). </li><li> İki süzüntüyü, ilave 50 mL&#39;lik yuvarlak tabanlı bir şişeye% 80 sulu etanol. NOT: Nihai hacim yaklaşık 300 mL olmalıdır. </li><li> Solventi buharlaştırmak için 62 ° C&#39;de ve 50 rpm&#39;de bir döner buharlaştırıcı kullanın. Etanol artık buharlaşıncaya kadar bu işleme devam edin. NOT: Bu işlem yaklaşık 45 dakika sürmektedir. </li><li> Numuneyi 50 mL&#39;lik bir konik tüpe aktarın. Tüpün üst kısmına nitrojen gazı enjekte ederek etanolü 10 dakika boyunca buharlaştırın. NOT: Bu basamak, etanolün tamamen buharlaşmasını sağlamak için gereklidir. Bu aşamadaki numunenin hacmi yaklaşık 20 mL&#39;dir. </li><li> Numuneyi -80 ° C&#39;de en az 24 saat boyunca dondurun. NOT: Bu adım daha verimli bir dondurarak kurutma işlemine izin vermek için gereklidir. </li><li> -80 ° C&#39;de yaklaşık 8 saat boyunca örneği dondurarak kurutun. Örnekleri -20 ° C&#39;de saklayın. NOT: Dondurma kurutucu numuneleri kurutmak için haznenin içinde -50 ° C&#39;de güçlü bir vakum oluşturur ancak polip gibi bileşimlerin çoğunu korurfenoller. </li></ol></li><li> Ham özütlerden saf polifenol ekstraktlarının hazırlanması. <ol><li> Dondurularak kurutulmuş özütlenen örnekleri tartın. NOT: Bu adımda özütün hacmi yaklaşık 10 mL&#39;dir. </li><li> Ham özlüğe iki hacim (~ 20 mL) kloroform ilave edin ve çözeltiyi bir karıştırma plakasında 5 dakika çalkalayın. </li><li> Karışımı ayırma hunisine döktürün. Ham et ekstrakte edilerek saflaştırılmış fraksiyon elde edilir. NOT: Bu aşamada iki fazlı bir karışım oluşur. </li><li> Alt tabakayı (kloroform fazı) ayırma hunisinden atın ve sulu tabakayı temiz bir behere toplamayın. </li><li> Sulu fraksiyona iki hacim etil asetat ilave edin ve karışımı oda sıcaklığında 5 dakika karıştırmak için manyetik bir karıştırma çubuğu kullanın. </li><li> Karışımı, # 2 filtre kağıdından vakum emmeli soğutulmuş Buchner hunisini kullanarak filtre edin. </li><li> Filtrelenen numuneyi toplayın ve biz olabilmek için yuvarlak tabanlı bir şişeye aktarın.Döner buharlaştırıcı ile </li><li> Döner buharlaştırıcıyı 62 ° C ve 50 rpm&#39;ye ayarlayın ve etil asetatı yaklaşık 30 dakika buharlaştırın. </li><li> -80 ° C&#39;de yaklaşık 8 saat boyunca örneği dondurarak kurutun. Numuneyi 50 mL&#39;lik bir konik tüpe aktarın ve -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li></ol> 3. Berilyum özleri ile VSMC&#39;lerin tedavisi <ol><li> VSMC kültürü. <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi, bir enzimatik sindirim gerçekleştirerek VSMC&#39;leri Sprague-Dawley sıçanlarının torasik aortlarından izole edin 29 . VSMC&#39;leri tarif edildiği gibi kültürleyin 29 . </li><li> 1 g / L glikoz içeren ve% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 100 U / mL penisilin, 100 mg / mL streptomisin ve 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM kullanarak VSMC&#39;lerin kültürü için komple ortam hazırlayın. Ortamı 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> VSMC&#39;lerin polifenol ekstraktlarıyla inkübe edilmesi. <ol><li> VSMC&#39;leri bölmek için, kültürü atınOrta ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez hücreleri yıkayın. 4 mL PBS ve 2 mL tripsin EDTA% 0.25 ekleyin. 37 dakika CO 5 inkübatörde 5 dakika boyunca hücreleri inkübe edin. <ol><li> Hücreleri toplayın, 15 mL&#39;lik bir santrifüj tüpünde 2 mL komple ortam ile karıştırın ve 1100 x g&#39;de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve hücre pelletini 1 mL PBS ile tekrar süspanse edin. Hemocytometer kullanarak hücreleri sayın. </li><li> 6 oyuklu kültür plakalarında kuyu başına 50,000 VSMCs tohumlayın ve% 90 konfluansa (yaklaşık 3 gün) erişene kadar onları% 10 FBS içeren komple ortamda büyütün. VSMC&#39;leri nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de muhafaza edin. </li></ol></li><li> 1 g / L glikoz, 100 U / mL penisilin, 100 mg / mL streptomisin, 2 mM L-glutamin ve% 0.5 FBS içeren DMEM ortamı kullanarak işleme orta hazırlayın. İşlem ortamını 4 ° C&#39;de saklayın. NOT: Polifenol ekstraktları ve Ang II, bu mestadyumu. </li><li> 10 mg ekstraktın 1 mL düz DMEM ortamına özülmesi ile polifenollerin 10 mg / mL&#39;lik Ham Eriteki (CE) veya Saflaştırılmış Özüt (PE) stok çözeltisini hazırlayın. Stok -20 ° C&#39;de 200 mcL alikotları halinde tutun. </li><li> VSMC&#39;leri% 0.5 FBS içeren 2 mL işlem ortamıyla kuluçkalayın ve 50-500 μg / mL konsantrasyon elde etmek için CE veya PE özütleri ekleyin. Ortamı her 24 saatte bir taze polifenol ekstraktları ekleyerek değiştirin. Hücreleri 3 gün boyunca tedavi edin. </li><li> Ang II veya diğer hormonlar ve büyüme faktörleri ile tedavi için, Ang II&#39;nin (100 nM) ilavesinden önce% 0.5 FBS içeren işleme ortamı ile hücreleri inkübe etmek suretiyle hücreleri en az 24 saat aç bırakın. NOT: Ang II ilavesi öncesi% 0.5 FBS muamele ortamında CE ve PE içeren veya içermeyen inkübasyon önerilir. <ol><li> Açlıktan 24 saat sonra 100 nM Ang II ekleyin. Tedavi ortamını 3 saat boyunca her 24 saatte bir taze CE, PE veya Ang II ile değiştirin. </li></ol></li></ol></li><li> Hücre örneklerinin hazırlanması. <ol><li> İşlenmiş hücreleri iki kez soğuk PBS içerisinde yıkayın ve buz üzerinde 200 μL liziz tamponu ile çözündürünüz. </li><li> Hücre sıyırıcıları kullanarak hücre lizatları toplayın ve lizatları 1.5 mL&#39;lik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Toplam hücre lizatlarını buz üzerinde 20 dakika inkübe edin ve her 5 dakikada bir girdaplayın. </li><li> Hücre özütlerini, her biri 10 saniye süreyle 125 W&#39;da üç patlamayla sonlandırın ve arasında 2 sn duraklama yapın. Sonication boyunca örnekleri buzda tutun. </li><li> 595 nm&#39;de bir protein assay reagent kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün. </li><li> Western leke analizi için örnekleri -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Western leke. <ol><li> Kontrol edilmeyen ve polifenol ile muamele edilmiş veya Ang II ile muamele edilmiş örneklerin lizis tamponu ile eşit miktarda protein (yaklaşık 50 ug) karıştırın ve maksimum toplam hacim 50 μL&#39;dir. 16 uL 4x Laemmli numune tamponu ekleyin. Numuneleri 75 ° C&#39;de 5 dakika ısıtın. </li><li> Örneklemi ayır% 10 SDS-PAGE jelleri içerisinde süspansiyon haline getirin ve spesifik antikorlarla Western leke analizi için yarım kuru bir transfer sistemi içinde 75 dakika boyunca 10 V&#39;de PDVF membranlara aktarın. </li><li> Membranı TBS% 0.05 Triton-X100 tamponu (TBS-T) içinde% 2 süt ile 20 dakika bloke edin. </li><li> Memeyi TBS (her biri 5 dakika) ile en az üç kez yıkayarak sütü çıkarın ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında veya 0 ° C&#39;de birincil antikorlarla inkübe edin (4 ° C). </li><li> Membranı TBS-T ile üç kez, her 10 dakikada yıkayın ve 45 dakika boyunca bir HRP-bağlantılı sekonder antikorla inkübe edin. </li><li> Membranı TBS-T ile üç kez, her birinde 10 dakika yıkayın ve gelişmiş kimyasal ışıkla (ECL) geliştirin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biological+effects+of+dietary+phenolic+compounds%3A+relevance+to+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Pharmacol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).</li>
<li>Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20664075">Gut microbiota in health and disease.</a> Physiol Rev. 90 (3), 859-904 (2010).</li>
<li>Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenols%3A+food+sources+and+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Polyphenols: food sources and bioavailability.</a> Am J Clin Nutr. 79 (5), 727-747 (2004).</li>
<li>Griffiths, G., Trueman, L., Crowther, T., Thomas, B., Smith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onions--a+global+benefit+to+health%5BTitle%5D)+AND+%22Phytother+Res%22%5BJournal%5D)">Onions--a global benefit to health.</a> Phytother Res. 16 (7), 603-615 (2002).</li>
<li>Mazzoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+aspects+of+berries%3A+from+field+to+health%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sci+Food+Agric%22%5BJournal%5D)">The genetic aspects of berries: from field to health.</a> J Sci Food Agric. 96 (2), 365-371 (2016).</li>
<li>Wang, S. Y., Jiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenging+capacity+of+berry+crops+on+superoxide+radicals%2C+hydrogen+peroxide%2C+hydroxyl+radicals%2C+and+singlet+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen.</a> J Agric Food Chem. 48 (11), 5677-5684 (2000).</li>
<li>Choi, M. H., Shim, S. M., Kim, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+black+raspberry+seed+containing+anthocyanins+against+oxidative+damage+to+DNA%2C+protein%2C+and+lipid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Protective effect of black raspberry seed containing anthocyanins against oxidative damage to DNA, protein, and lipid.</a> J Food Sci Technol. 53 (2), 1214-1221 (2016).</li>
<li>Forbes-Hernandez, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Healthy+Effects+of+Strawberry+Polyphenols%3A+Which+Strategy+behind+Antioxidant+Capacity%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Food+Sci+Nutr%22%5BJournal%5D)">The Healthy Effects of Strawberry Polyphenols: Which Strategy behind Antioxidant Capacity?</a> Crit Rev Food Sci Nutr. 56, Suppl 1. S46-S59 (2016).</li>
<li>Figueira, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+a+blueberry+extract+in+acute+inflammation+and+collagen-induced+arthritis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Protective effects of a blueberry extract in acute inflammation and collagen-induced arthritis in the rat.</a> Biomed Pharmacother. 83, 1191-1202 (2016).</li>
<li>Daglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenols+as+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polyphenols as antimicrobial agents.</a> Curr Opin Biotechnol. 23 (2), 174-181 (2012).</li>
<li>Hügel, H. M., Jackson, N., May, B., Zhang, A. L., Xue, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenol+protection+and+treatment+of+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Polyphenol protection and treatment of hypertension.</a> Phytomedicine. 23 (2), 220-231 (2016).</li>
<li>Niedzwiecki, A., Roomi, M. W., Kalinovsky, T., Rath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+Efficacy+of+Polyphenols+and+Their+Combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations.</a> Nutrients. 8 (9), E552(2016).</li>
<li>Kresty, L. A., Mallery, S. R., Stoner, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+raspberries+in+cancer+clinical+trials%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Berry+Res%22%5BJournal%5D)">Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future.</a> J Berry Res. 6 (2), 251-261 (2016).</li>
<li>Hertog, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavonoid+intake+and+long-term+risk+of+coronary+heart+disease+and+cancer+in+the+seven+countries+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study.</a> Arch Intern Med. 155 (4), 381-386 (1995).</li>
<li>Peterson, J. J., Dwyer, J. T., Jacques, P. F., McCullough, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+flavonoids+and+cardiovascular+disease+incidence+or+mortality+in+European+and+US+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Rev%22%5BJournal%5D)">Associations between flavonoids and cardiovascular disease incidence or mortality in European and US populations.</a> Nutr Rev. 70 (9), 491-508 (2012).</li>
<li>Cassidy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+anthocyanin+intake+is+associated+with+a+reduced+risk+of+myocardial+infarction+in+young+and+middle-aged+women%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women.</a> Circulation. 127 (2), 188-196 (2013).</li>
<li>Jacques, P. F., Cassidy, A., Rogers, G., Peterson, J. J., Dwyer, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+flavonoid+intakes+and+CVD+incidence+in+the+Framingham+Offspring+Cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Dietary flavonoid intakes and CVD incidence in the Framingham Offspring Cohort.</a> Br J Nutr. 114 (9), 1496-1503 (2015).</li>
<li>Aghababaee, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+blackberry+%28Morus+nigra+L.%29+consumption+on+serum+concentration+of+lipoproteins%2C+apo+A-I%2C+apo+B%2C+and+high-sensitivity-C-reactive+protein+and+blood+pressure+in+dyslipidemic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Res+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of blackberry (Morus nigra L.) consumption on serum concentration of lipoproteins, apo A-I, apo B, and high-sensitivity-C-reactive protein and blood pressure in dyslipidemic patients.</a> J Res Med Sci. 20 (7), 684-691 (2015).</li>
<li>Jeong, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Rubus+occidentalis+extract+on+blood+pressure+in+patients+with+prehypertension%3A+Randomized%2C+double-blinded%2C+placebo-controlled+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension: Randomized, double-blinded, placebo-controlled clinical trial.</a> Nutrition. 32 (4), 461-467 (2016).</li>
<li>Jia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antihypertensive+effect+of+ethyl+acetate+extract+from+red+raspberry+fruit+in+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogn+Mag%22%5BJournal%5D)">The antihypertensive effect of ethyl acetate extract from red raspberry fruit in hypertensive rats.</a> Pharmacogn Mag. 7 (25), 19-24 (2011).</li>
<li>Feresin, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blackberry%2C+raspberry+and+black+raspberry+polyphenol+extracts+attenuate+angiotensin+II-induced+senescence+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Funct%22%5BJournal%5D)">Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells.</a> Food Funct. 7 (10), 4175-4187 (2016).</li>
<li>Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+nitric+oxide+biosynthesis+by+anthocyanin+fraction+of+blackberry+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract.</a> Nitric Oxide. 15 (1), 30-39 (2006).</li>
<li>Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+involved+in+chemoprevention+of+black+raspberry+extracts%3A+from+transcription+factors+to+their+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes.</a> Nutr Cancer. 54 (1), 69-78 (2006).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+extract+of+unripe+Rubus+coreanus+fruit+attenuates+atherosclerosis+by+improving+blood+lipid+profile+and+inhibiting+NF-%CE%BAB+activation+via+phase+II+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-κB activation via phase II gene expression.</a> J Ethnopharmacol. 146 (2), 515-524 (2013).</li>
<li>Wang, J., Mazza, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+anthocyanins+and+other+phenolic+compounds+on+the+production+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+LPS%2FIFN-gamma-activated+RAW+264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages.</a> J Agric Food Chem. 50 (15), 4183-4189 (2002).</li>
<li>Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., Garcia-Viguera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavanols+and+anthocyanins+in+cardiovascular+health%3A+a+review+of+current+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health: a review of current evidence.</a> Int J Mol Sci. 11 (4), 1679-1703 (2010).</li>
<li>Kim, D. O., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471142913.fai0102s06/abstract">Extraction and Isolation of Polyphenolics.</a> Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, John Wiley & Sons. New York. 2.1-2.12 (2002).</li>
<li>Queires, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenols+purified+from+the+Brazilian+aroeira+plant+%28Schinus+terebinthifolius%2C+Raddi%29+induce+apoptotic+and+autophagic+cell+death+of+DU145+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells.</a> Anticancer Res. 26 (1A), 379-387 (2006).</li>
<li>Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+phosphatidylinositol-specific+phospholipase+C+from+cultured+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells.</a> J Biol Chem. 266 (23), 15498-15504 (1991).</li>
<li>Vuong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+polyphenol-enriched+preparation+on+chemoprevention+of+mammary+carcinoma+through+cancer+stem+cells+and+inflammatory+pathways+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation.</a> J Transl Med. 14, (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Çileklerden izole edilen polifenoller farklı bileşimler içerir. Burada açıklanan etanol bazlı ekstraksiyon protokolü, BL&#39;nin ham ve saflaştırılmış polifenol özütlerinde mevcut olan farklı seviyelerde fenolik asitlerin ve flavonoidlerin tanımlanmasına izin verdi ( Tablo 1 ). CE, gallik asit, ferulik asit, 4-0-kafeoilkinik asit ve 5-0-kafeoilkinik asitte zenginleştirildi. Saflaştırma işlemi galik asit ve p-kumar asit seviyelerini önemli ölçüde değiştirmedi. Bununla birlikte, 3- O- kafeinokini...

Polifenoller yapılarında en az bir fenolik halka içeren bileşiklerdir ve bitki krallığı 1&#39;de bol miktarda bulunurlar. İnsanlar, bu gibi bileşiklerin varlığından haberdar olmaksızın, binlerce yıldır şifalı bitkiler tüketiyorlar. Birçok meyve ve sebze, flavonoidler, stilbenler ve fenolik asitleri içeren farklı miktarlarda olsalar da, paylaşılan bazı polifenolik bileşiklere sahiptir 3 . Polifenoller çoğunlukla renkli meyve ve sebzelerle ilişkiliyse de, bu kesinlikle doğru değildir. Örneğin, soğan ve sarımsak gibi son derece renkli olmayan sebzelerde zeaksantin ve ksantin, tarçın ailesinden ve sayısız sağlık yararı 4 ile ilişkilendirilmiştir. Birkaç sağlık faydası 5 ile bağlantılı olmanın yanı sıra, polifenoller, böceklerden veD ultraviyole ışınımı 2 . Polifenoller, insan diyetinde yaygın olarak bulunurlar ve Reaktif Oksijen Türlerini (ROS) sileceği için güçlü antioksidanlar olarak kabul edilirler 6 , 7 , 8 . Ayrıca anti-inflamatuar 9 , antimikrobiyal 10 , anti-hipertansif 11 ve anti-kanserojen 12,13 özellikleri vardır. Epidemiyolojik çalışmalar, flavonoidlerin tüketimi ile kardiyovasküler hastalık (KVH) insidansı 16 , 17 ve mortalite 14 , 15 arasında ters bir ilişki olduğunu ortaya koymaktadır. Çilek yaygın olarak ABD&#39;de tüketilir ve flavonoidler de dahil olmak üzere polifenollerin yüksek miktarlarda bulunur. Örneğin, böğürtlen (BL) suyunun tüketimi (300<html> ML / gün), dislipidemik hastalarda sistolik kan basıncını önemli ölçüde düşürmüştür [ 18] . Jeong ve ark. 19 , günde 2.5 g siyah ahududu (BRB) ekstresi tüketen hipertansif erkek ve kadınların plasebo alanlara kıyasla 24 saat daha düşük ve gece kan basıncına sahip olduklarını bildirmiştir. Ahududay (RB) spontan hipertansif sıçanlarda süperoksit dismutaz (SOD) ekspresyonunu arttırırken kan basıncını düşürdü 20 . Yakın zamanda, BL, RB ve BRB&#39;nin Vasküler Düz Kas Hücrelerinde (VSMC) 21 anjiyotensin II (Ang II) tarafından indüklenen ROS ve yaşlanma düzeylerini düşürdüğü gösterilmiştir. Ek olarak, BL ekstraktından alınan antosiyanin fraksiyonu, uyarılabilir nitrik oksit sentaz (iNOS) ekspresyonunu azalttı ve lipopolisakkarid (LPS) uyarılmış Nükleer Faktör kappa B (NF-κB) ve hücre dışı sinyal regüle kinaz (ERK) aktivitesini inhibe etti J774 hücreleriAss = &quot;xref&quot;&gt; 22. BRB ekstreleri in vitro 23&#39;te NF-κB aktivasyonunu ve siklooksijenaz 2 (COX-2) ekspresyonunu azalttı, lipid profilini geliştirdi ve yüksek yağlı bir diyetle beslenen farelerde ateroskleroz lezyon oluşumunu önledi 24 . Çilek içerisinde en bol flavonoid olarak kabul edilen antosiyaninler, Tümör Nekroz Faktörü alfa (TNF-α) üretimini azaltarak LPS ile uyarılan RAW 264.7 makrofajlanndaki iltihap tepkisini modüle eder 25 ve VSMC&#39;lerin çoğalmasını ve göçünü azaltır 26 . Polifenollerin insan sağlığı ve hastalığındaki rolünü anlama konusundaki artan ilgi bu yana, ekstraksiyon yöntemini optimize etmek önemlidir. Çözücü ekstraksiyonu, bu amaca uygun olarak kullanılır; zira maliyet açısından etkili ve kolayca üretilebilir. Bu çalışmada, bir solvent ekstraksiyonu etanol ile birlikte ultrasonik yardımlı ekstrakt ileN metodu, Kim ve Lee&#39;den uyarlanmıştır 27 . Querous et al&#39;dan uyarlanan saflaştırılmış özüt (PE) fraksiyonunu elde etmek için kloroform ve etil asetat kullanılarak ham özütlerin (CE) saflaştırılması ve fraksiyonlanması gerçekleştirildi. Bundan başka, ERKl / 2&#39;nin bazal fosforilasyonunu düşürürken BL&#39;den saflaştırılmış polifenol ekstraktlarının etkinliği karşılaştırılmış ve saflaştırılmış BL polifenol ekstresinin VSMC&#39;lerde Ang II ile uyarılan sinyal azalmaları üzerindeki önleyici etkisinin temsili örnekleri sağlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Anjiyotensin II</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A9525-10MG</td><td>VSMC'lerin</td></tr> <tr><td>ve beta;-aktin</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.'in tedavisi</td><td>A2228</td><td>Birincil antikor (1:5000)</td></tr><tr><td>Böğürtlen meyvesi</td><td>Mercer Foods</td><td></td><td>Dondurularak kurutulmuş böğürtlen tozu</td></tr><tr><td>Katalaz&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>219010</td><td>Birincil antikor (1:1000)</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Biotech Grd, Inc.</td><td>97064-678</td><td>Saflaştırılmış polifenol ekstraktlarının hazırlanması</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Mediatech, Inc.</td><td>10-014-CV</td><td>VSMC Kültürü</td></tr><tr><td>Etanol (mutlak moleküler biyoloji derecesi)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>E7023-500ML</td><td>Polifenol ekstraktlarının hazırlanması&nbsp;</td></tr><tr><td>Etilasetat</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>439169</td><td>Saflaştırılmış polifenol ekstraktlarının hazırlanması</td></tr><tr><td>ERK1/2</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi, Inc.</td><td>9102S</td><td>Birincil antikor (1:500)</td></tr><tr><td>EDTA, 500 mM, pH 8.0</td><td>Teknova, Inc.</td><td>E0306</td><td>Lizis tamponu</td></tr><tr><td>Dondurarak Kurutucu</td><td>Labconco</td><td>VirTis Tezgah Üstü K</td><td>Polifenol ekstraktlarının hazırlanması</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Seradigm</td><td>1400-500</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>H3375</td><td>Lizis tamponu&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>EMD Millipore, Inc.</td><td>7760</td><td>Lizis tamponu</td></tr><tr><td>NaF</td><td>J.T.Baker, Inc.</td><td>3688-01&nbsp;</td><td>Lizis tamponu</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>450243</td><td>Lizis tamponu</td></tr><tr><td>Na4P2O7, dekahidrat</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>S-9515</td><td>Lizis tampon</td></tr><tr><td>fosfo ERK1 / 2&nbsp;</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi, Inc.</td><td>9101S</td><td>Birincil antikor (1:1000)</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>P8340-5ml</td><td>Lizis tamponu</td></tr><tr><td>Protein tahlili boya reaktifi</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>500-0006</td><td>Protein konsantrasyonu Ölçümü</td></tr><tr><td>PVDF transfer membranı</td><td>Thermo Scientific, Inc.</td><td>88518</td><td>Western blots</td></tr><tr><td>Döner Evaporatör</td><td>Buchi Labortechnik</td><td>Rotavapor R3000</td><td>Polifenol ekstraktlarının hazırlanması</td></tr><tr><td>Steril su</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-055-CV</td><td>Polifenol ekstraktlarının hazırlanması</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>QSonica, LLC</td><td>Q125</td><td>Hücre ekstraktlarının hazırlanması</td></tr><tr><td>SOD2</td><td>Enzo Life Sciences, Inc.</td><td>ADI-SOD-110-F</td><td>Birincil antikor (1:1000)</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>X100</td><td>Western lekeleri</td></tr><tr><td>Whatman #2 filtre kağıdı</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>28317-241</td><td>Polifenol ekstraktlarının hazırlanması</td></tr></tbody></table>

dondurularak kurutulmuş berry tozundan polifenollerin vasküler düz kas hücrelerinin tedavisinde ekstraksiyonu ve saflaştırılması<em&gt; in vitro</em

Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro

Epidemiyolojik çalışmalar, artan flavonoid alımının, Birleşik Devletler (ABD) ve Avrupa&#39;da kardiyovasküler hastalıklara (KVH) bağlı mortalitenin azalmasıyla korele olduğunu göstermektedir. Çilek yaygın olarak ABD&#39;de tüketilir ve yüksek bir polifenolik içeriğe sahiptir. Polifenollerin birçok moleküler hedef ile etkileşime girdiği ve antioksidan, anti-enflamatuar ve kardiyoprotektif etkileri de dahil olmak üzere çok sayıda pozitif biyolojik fonksiyonlar sergilediği gösterilmiştir. Böğürtlen (BL), ahududu (RB) ve siyah ahududu (BRB) izole edilen polifenoller anjiyotensin II&#39;ye (Ang II) yanıt olarak oksidatif stres ve hücresel yaşlanmayı azaltır. Bu çalışma, dondurularak kurutulmuş meyvelerden polifenol özütleri hazırlamak için kullanılan protokolün ayrıntılı bir tarifi sağlar. Dondurularak kurutulmuş çilek tozundan polifenol ekstraksiyonları% 80 sulu etanol ve bir ultrason yardımlı ekstraksiyon yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi. Ham öz, daha da arıtıldı ve kloroform ve etil asetat kullanılarak fraksiyonlandınldı,sırasıyla. Hem ham hem de saflaştırılmış ekstraktların etkileri kültürde Vasküler Düz Kas Hücreleri (VSMC&#39;ler) üzerinde test edildi.

Daha önce BL, RB ve BRB&#39;den izole edilen polifenol ekstraklarının Ang II 21&#39;e yanıt olarak VSMC&#39;lerin yaşlanmasını azalttığı gösterilmiştir. Bu saflaştırılmış polifenol ekstraktlarının Akt, p38 Mitojen-Aktive Edilmiş Protein Kinazı (MAPK) ve ERK1 / 2&#39;nin fosforilasyonunu azaltarak Ang II sinyallemesini modüle ettiği gösterilmiştir. BL, süperoksit anyonları üreten ve Ang II tarafından kuvvetle yukarı doğru düzenlenen bir enzim olan NADPH oksidaz (No...

Bu çalışma, dondurularak kurutulmuş çilek tozundan polifenol bakımından zengin ekstraktları hazırlamak için adım adım bir yöntemi ayrıntılarıyla anlatmaktadır. Buna ek olarak, Vasküler Düz Kas Hücreleri (VSMC) kullanarak peptit hormonu anjiyotensin II&#39;nin (Ang II) varlığında hücre kültüründe bu polifenol bakımından zengin özütlerin nasıl kullanılacağına dair kapsamlı bir açıklama sağlar.

Dondurularak Kurutulmuş Berry Tozundan Polifenollerin Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Tedavisinde Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması<em&gt; In vitro</em

Epidemiological studies indicate that increased flavonoid intake correlates with decreased mortality due to cardiovascular diseases (CVD) in the United ...

Bu protokolün genel amacı, gelecekte hücrelerin tedavi edilmesinde kullanılabilecek bitki polifenollerinin ekstraksiyonu ve saflaştırılması için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sunmaktır. Bu yöntem, gıdaların fonksiyonlarının insan sağlığı ve hastalıkları üzerindeki rolüne ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu etanol tabanlı ve ultrasonik destekli polifenol ekstraksiyonu, daha yüksek polifenol verimi sağlayan kolay ve tekrarlanabilir bir yöntemdir.Kloroform kullanımı şekerlerin, yağ asitlerinin, proteinlerin ve diğer moleküllerin uzaklaştırılmasını sağlarken, etil asetat polifenol fraksiyonasyonuna olanak tanır. Bu konsantre polifenol ekstraktları, burada açıklanan şekilde, kardiyovasküler sistem dahil olmak üzere çeşitli dokular üzerindeki etkilerini ve etki mekanizmalarını incelemek amacıyla in vitro ve in vivo olarak kullanılabilir. Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtilen reaktifleri hazırlayın.Ardından, 10 gram dondurularak kurutulmuş böğürtlen tozu tartın. Meyve tozunu, 100 mL %80'lik sulu etanol içeren bir litrelik yuvarlak tabanlı balona ekleyin. Balonu 25 °C sıcaklıktaki bir ultrasonik banyoya yerleştirin.Loş ışık altında sürekli azot süpürme işlemi uygulanırken, karışımı 42 kilohertz ve 135 watt değerlerinde 20 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Ardından, karışımı iki numara filtre kağıdından süzmek için vakumlu emişli soğutulmuş bir Buchner hunisi kullanın. Filtre kekini 50 milliliters %100 etanol ile durulayın.Süzüntüyü saklayın ve filtre kekini, 100 mL %80'lik sulu etanol içeren bir litrelik yuvarlak tabanlı bir erlene ekleyin. Ardından, karışımı sonikasyon, süzme ve yıkama işlemlerini uygulayarak ekstraksiyon sürecini tekrarlayın. İki süzüntüyü, 50 mL %80'lik sulu etanol içeren bir yuvarlak tabanlı erlenle birleştirin.62 °C ve 50 rpm'de döner evaporatör kullanarak solventi uçurun. Etanol artık uçmayana kadar bu işleme devam edin. Ardından, örneği 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.Kalan etanolü uçurmak için tüpün üst kısmından 10 dakika boyunca azot gazı uygulayın. Numuneyi en az 24 saat boyunca -80 °C'de dondurun. Ardından, numuneyi yaklaşık sekiz saat boyunca -50 °C'de liyofilize edin.Numuneleri kullanıma hazır olana kadar -20 °C'de saklayın. Başlamak için, dondurularak kurutulmuş ekstrakt numuneleri tartın. Numunenin bulunduğu 100 mL'lik bir behere yaklaşık 20 mL kloroform ekleyin.Bir manyetik karıştırıcı kullanarak çözeltiyi beş dakika boyunca karıştırın. Ardından, karışımı bir ayırma hunisine boşaltın. Ham özütün oda sıcaklığında bir saat boyunca çökelmesini bekleyin.Bundan sonra, alt tabakayı atın ve sulu tabakayı temiz bir behere toplayın. Behere iki hacim etil asetat ekleyin. Bir manyetik karıştırıcı kullanarak, karışımı oda sıcaklığında beş dakika boyunca karıştırın.Ardından, karışımı 2 numaralı filtre kağıdı üzerinden süzmek için vakum emişli ve soğutulmuş bir Buchner hunisi kullanın. Süzülen örneği yuvarlak tabanlı bir balona aktarın. 62 °C ve 50 rpm'de bir döner buharlaştırıcı kullanarak etil asetatı 30 dakika boyunca buharlaştırın.Bundan sonra, örneği -50 °C'de sekiz saat boyunca liyofilize edin. Örneği 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve kullanıma hazır olana kadar -20 °C'de saklayın. Vasküler düz kas hücrelerini kültürledikten sonra, kültür ortamını dökün ve hücreleri fosfat tamponlu salin ile iki kez yıkayın.Ardından, dört mililitre PBS ve iki mililitre %0,25 Trypsin-EDTA ekleyin. 37 °C'de, bir karbondioksit inkübatöründe beş dakika boyunca inkübe edin. Bunun ardından hücreleri, iki mililitre kompleli besiyeri içeren 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.1.100 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini bir mililitre PBS ile yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.Ardından, altı kuyucuklu kültür plaklarında, kuyucuk başına 50,000 hücre ekleyin. Hücreleri, %10 fetal bovine serum içeren komple medyumda %90 konfluensle büyütün. İşlem medyumunu metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın ve dört derece Celsius'ta saklayın.Ardından, 10 mg/mL'lik bir stok çözelti hazırlamak için 1 ml sade DMEM'e 10 miligram ham veya saflaştırılmış ekstrakt ekleyin. Stok çözeltiyi, -20 °C'de 200 µL'lik alikotlar halinde saklayın. Bundan sonra, hücrelere %0,5 fetal bovine serum ve istenen konsantrasyonda stok çözelti içeren iki mililitre tedavi ortamı ekleyin.Nemlendirilmiş %5CO2 inkübatörde 37 °C'de üç gün boyunca inkübe edin. Ardından, hormonlar veya büyüme faktörleri ile işlem yapılacaksa, %0,5 fetal bovine serum içeren işlem ortamıyla inkübe ederek hücreleri en az 24 saat aç bırakın. Aç bırakma işleminden sonra, metin protokolünde detaylandırıldığı üzere, işlem ortamını üç gün boyunca her 24 saatte bir yenileyerek istenen hormonu ekleyin.Ardından, işlem görmüş hücreleri soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri buz üzerinde 200 µL lizis tamponu kullanarak lize edin. Hücre kazıyıcılar yardımıyla hücre lizatını toplayın ve 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Toplanan lizatı, her beş dakikada bir vorteksleyerek 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bunun ardından, hücre ekstraktlarını 125 watt gücünde, her biri 10 saniye süren ve aralarında iki saniyelik duraksamalar olan üç kısa sonikasyonla sonike edin. Protein konsantrasyonunu, 595 nanometrede bir protein analiz reaktifi kullanarak ölçün.Maksimum toplam hacim 50 µL olacak şekilde, 50 µg proteini lizis tamponu ile karıştırın. 16 µL 4x Laemmli örnek tamponu ekleyin. Ardından, örnekleri 75 °C'de beş dakika boyunca ısıtın.Örnekleri %10 SDS-PAGE jellerinde ayırın ve spesifik antikorlarla Western blot analizi yapmak üzere PVDF membranlara aktarın. Bu çalışmada, ham ve saflaştırılmış polifenol böğürtlen ekstrelerinde bulunan farklı fenolik asit ve flavonoid seviyelerini belirlemek için etanol bazlı bir ekstraksiyon kullanılmıştır. Saflaştırma işlemi gallik asit veya p-kumarik asit seviyelerini önemli ölçüde değiştirmezken, 3-O-kafeoilkuinik asit seviyelerini 170,5'ten 235,3 ppm'e ve Kuersetin seviyelerini 24,5'ten 95 ppm'e yükseltmiştir.Buna karşılık, ham özütün saflaştırılması sırasında Ferulik asit ve Rutin kaybedilmiştir. Ekstraksiyon sonrası VSMC'ler, 0,5% fetal bovine serum içeren besiyerinde, üç gün boyunca 50 ila 500 µg/mL konsantrasyonundaki ham veya saflaştırılmış böğürtlen özütü ile inkübe edilmiştir. Her iki özütün de ERK'nin bazal fosforilasyonunu azaltmada etkili olduğu görülmektedir.Bununla birlikte, saflaştırılmış ekstraktın 100 µg/mL konsantrasyonda güçlü bir aşağı düzenleme yaptığı görülürken, ham ekstrakt için 400 ila 500 µg/mL gerekmektedir. Bu durum, saflaştırılmış ekstraktın ERK fosforilasyonunu inhibe etmedeki daha yüksek verimliliğinin, içerdiği daha yüksek polifenol bileşiği konsantrasyonlarından kaynaklandığını göstermektedir. Bundan sonra, VSMC'ler 100 nM anjiyotensin II eklenmesinden önce 200 µg/mL saflaştırılmış böğürtlen ekstraktı ile 24 saat boyunca işleme tabi tutulur. Daha önce bildirildiği üzere, böğürtlen polifenol ekstraktı anjiyotensin II tarafından indüklenen ERK fosforilasyonunu azaltır, ancak katalaz veya SOD2 ekspresyonu üzerinde herhangi bir etki göstermez.Polifenol ekstraksiyonu tekniği bir kez kavrandığında, birkaç saat içinde hazırlanabilir. Bu teknik, fonksiyonel gıdalar alanındaki araştırmacıların, polifenollerin rolünü in vitro ve hayvan modellerinde incelemelerine yardımcı olabilir. Bu videoyu izledikten sonra, meyve ve sebzelerden polifenolleri ekstre edip saflaştırabilmeli ve polifenol ekstrelerini kültürdeki hücreleri işleme tabi tutmak için kullanabilmelisiniz.Aortik vasküler düz kas hücrelerinin yaşlanmasını önlemede böğürtlen polifenollerinin rolünü göstermek için bu yöntemi kullandık. Vasküler sistemin yaşlanmasının kardiyovasküler hastalıkların gelişimi için ana bir risk faktörü olduğu düşünüldüğünde, bu durum önem taşımaktadır.

extraction-purification-polyphenols-from-freeze-dried-berry-powder

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Burada, BİYOANALİZLER bir mantar patojen, Colletotrichum fioriniae, yaban mersini yoksa yabanmersini çiçek özleri cam coverslips Tarih huzurunda gelişimini izlemek için tasarlanmıştır açıklanmıştır. Su - kloroform-, dayanarak ve alan yağmur suyu - çiçek çıkarma teknikleri bu bilgileri uygulanabilir nasıl fikir yanı sıra ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Colletotrichum fioriniae Su ve kloroform tabanlı yaban mersini ve kızılcık çiçek özleri kalkınma

Temel araştırma ve biyoloji ve tedavi potansiyelini araştırmak için murine kardiyak perisitleri izole etmek ve arındırmak için bir protokol optimize ettik.

Murine Kardiyak Perisitlerin İzolasyon ve Safifikasyonu

Biz murine serebral perisit lerin çıkarılması için bir protokol sıyoruz. Antibiyotiksiz zenginleştirme odaklı perisit çıkarma dayanarak, bu protokol, böylece kullanılan deneysel hayvan sayısını azaltarak, yüksek saflık ve yüksek verim sağlayan in vitro çalışmalar için değerli bir araçtır.

Serebral Perisitleri Fareden Ayırmak Için Yüksek Çıkış Yöntemi

Bu protokolün amacı, yarı hedefli kromatografi-kütle spektrometrisi yöntemi kullanarak plazmadaki fenolik metabolitleri tespit etmektir.

Yaşlı Yetişkinlerin Plazmasındaki Fenolik Metabolitlerin Kütle Spektrometri Analizine Bağlanan Yarı Hedefli Ultra Yüksek Performanslı Kromatografi

Arteriyel pulmoner dolaşımın vasküler yanıtları intrapulmoner arter (IPA) ve vasküler düz kas hücreleri (VSMC'ler) kullanılarak araştırılabilir. Bu çalışmada IPA'nın izolasyonu ayrıntılı olarak ve fizyolojik uyaranlara yanıt olarak vazogevşemenin araştırılmasında kullanılan protokoller açıklanmaktadır.

Vasküler Yanıtları Araştırmak için İntrapulmoner Arter ve Düz Kas Hücrelerinin İzolasyonu

Bu protokol, Fructus Phyllanthi'nin hiperlipidemiye karşı temel hedeflerini ve mekanizmalarını araştırmak için ağ farmakolojisi tahmini ve metabolomik doğrulamaya dayanan entegre bir stratejiyi tanımlamaktadır.

Ağ Farmakolojisi Hiperlipidemiye Karşı Fructus Phyllanthi Mekanizmasının Tahmini ve Metabolomik Validasyonu

Burada, geleneksel Çin tıbbı ekstraktlarının stabilitesini değerlendirmek için çoklu ışık saçılma teknolojisine dayanan bir stabilite değerlendirme yöntemi sunuyoruz.

Farklı Ekstraksiyon Yöntemleri ile Elde Edilen Phyllanthus emblica L. Ekstraktlarının Stabilitesini İncelemek İçin Çoklu Işık Saçılmasının Kullanılması

Bu protokol, fenolik bileşiklerin ve doğal antioksidanların ekstrakte edilmesi için poliol bazlı mikrodalga destekli bir ekstraksiyon yönteminin kullanımını detaylandırır ve kullanıma hazır ekstraktların geliştirilmesine yönelik pratik ve çevresel olarak sürdürülebilir bir yaklaşımı temsil eder.

Poliol bazlı teknoloji kullanılarak kozmetik uygulamalar için fenolik bileşiklerin ve antioksidanların mikrodalga destekli ekstraksiyonu

Bu protokol, iyot ve nişastadan glukoz moleküllerinin zincirleri arasında bir kompleks oluşumuna dayanır koymak kolorimetrik yöntem sayesinde yüksek tarif etmektedir. İyot amiloz ve amilopektin içinde uzun zincirleri hem de kompleksler oluşturur. Bir nişasta örnek iyot ilave edildikten sonra, amiloz ve amilopektin maksimum emme, sırasıyla, 620 ve 550 nm'de meydana gelmektedir. Amiloz / amilopektin oranının 620 ve 550 nm absorbans değerlerinin oranından tahmin edilir ve belirli bir bilinen...

Freeze Kurutulmuş Patates Yumru Örnekleri Hızlı Yüksek Verimli Amilozlu Belirlenmesi

DNA origamisi, DNA moleküllerinin kendi kendine montajını programlayarak hassas nano ölçekli nesneler üretmek için güçlü bir yöntemdir. Burada, DNA origamisinden biyo-duyarlı bir robotun katlanması, transmisyon elektron mikroskobik görüntüleme (TEM) için saflaştırılması ve negatif boyanması için bir protokol açıklıyoruz.

DNA Origami bir Bio-duyarlı Robot katlanması ve Karakterizasyonu

Öğrenin, dondurularak kurutulmuş böğürtlenlerden ultrasonik ekstraksiyon ve kloroform/etil asetat saflaştırma ile polifenol izole etme yöntemini. Bu teknik, vasküler düz kas hücrelerinde kardiyovasküler koruma mekanizmalarını incelemek için kullanılır.

Dondurularak Kurutulmuş Berry Tozundan Polifenollerin Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Tedavisinde Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması In vitro (Video) | JoVE Journal

Dondurularak Kurutulmuş Berry Tozundan Polifenollerin Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Tedavisinde Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Daha fazla video keşfet