Zebra balığı Gelişen Akut Böbrek Hasarının Modellenmesi İçin Hassas Hücresel Ablasyon Yaklaşımı

Bu prosedürün genel amacı, nefron hasarını ve onarımını modellemek için Zebrafish böbrek epitelyal hücrelerinin hedeflenmiş ablasyonunu indüklemektir. Bu yöntem, organ ve özellikle böbrek rejenerasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, rejenerasyonda yer alan ana hücresel süreçler nelerdir, hayatta kalan dokuların plastisite düzeyi nedir ve daha birçok soru bu kapsamdadır.

Bu tekniğin temel avantajı, hasarın hassas uzaysal ve zamansal kontrolüne olanak tanımasının yanı sıra hasar seviyesinin ayarlanabilme imkanı sunmasıdır. Bu tekniğin etkileri, böbrek hücresi hasarı ve rejenerasyonunda yer alan hücresel ve moleküler süreçlerin hassas uzaysal ve zamansal değerlendirmesine izin verdiği için akut böbrek hasarının tedavisine veya teşhisine kadar uzanmaktadır. Başlamak için, böbrek GFP floresan Zebrafish'leri çaprazlayarak embriyolar oluşturun.

Döllenmeyi takip eden 24 saat boyunca embriyoları 28.5 °C'de E3 solüsyonunda tutun. Ardından, E3 ortamını değiştirmek için E3 içinde %0.003 PTU kullanın. Embriyoları altı veya daha fazla gün boyunca inkübatöre geri yerleştirin; bu sürenin sonunda böbrekler olgunlaşmış olacaktır.

Canlı görüntüleme için Zebrafish haritalaması yapmak amacıyla, 0,2 mg/mL trigaine solüsyonu içeren %1 ila %2'lik düşük erime noktalı agaroz hazırlayın. Plastik veya cam bir pipet kullanarak embriyoyu solüsyona aktarmadan önce agaroz trigaine solüsyonunun soğuduğundan emin olun. Ardından, bir transfer pipeti kullanarak larvayı agarozla birlikte çekin ve 35 mm'lik bir kabın ortasına yerleştirin.

Zebrafish içeren agarozu, kabın tabanını eşit şekilde kaplayacak şekilde hızla yayın. Ardından, foto ablasyon ve görüntüleme için larva yönlendirmesini yapmak üzere bir cam prob kullanın; böylece incelenen böbrek segmenti ışın yoluna dik konuma gelirken, karşı yan segment lazer ışınının dışında kalır. Zebrafish'in yönlendirilmesi, lazer ablasyonunu içeren sonraki adımlar için kritik öneme sahiptir.

Larvaların agaroz içinde dik konumda kalmasını sağlamak için iyi bir teknik tavsiye edilir. Buharlaşmayı en aza indirmek için Petri kabını kapatın ve agarozun yaklaşık 15 dakika boyunca katılaşmasını bekleyin. Konfokal mikroskobu, metin protokolüne uygun olarak dik konfigürasyonda kurduktan sonra, larva içeren Petri kabını bir mikroskop lamının üzerine yerleştirin ve sabit tutmak için modelleme kili kullanın.

Ardından, kayar Petri kabını mikroskop tablasına yerleştirin. Daha sonra, üç mililitre görüntüleme solüsyonu ekleyin. Su daldırma objektifi altında, ışın yolunda hava kabarcığı kalmasını önlemek için objektifin hafif açılı olduğundan emin olarak tablayı yavaşça yükseltin.

Lens çözeltiye belli bir açıyla temas ettiğinde, embriyo üzerindeki görüş alanında merkezleyin. Şimdi, floresan ışık kaynağını kullanarak ilgilenilen segmenti bulun, ardından hasar vermek için hedefleyeceğiniz yüzeysel dala odaklanın. Işık saçılmasını en aza indirmek için yüzeysel dallar seçilmiştir.

Mikroskop yazılımında görünüm, görüntüleme kontrolü, C2plus kompakt GUI bölümlerine gidin. Piksel bekleme süresini 1.9 microseconds, kare boyutunu 512 by 512 pixels ve pinhole boyutunu 90 microns olarak ayarlayın. 405 nanometer lazer yoğunluğunu sıfıra ve 488 lazer yoğunluğunu düşük bir değere ayarlayın.

488 nanometre lazeri kullanırken, yazılım arayüzündeki scan seçeneğine tıklayın. Işın yoluna dik olan ve iyi GFP floresansı ile net bir şekilde görüntülenen ilgili segmenti bulun. Bu bölge tanımlandıktan sonra, bir ilgi alanı çizmek için ROI sekmesine gidin ve draw elliptic ROI seçeneğini kullanın.

Ardından, görünüm (view), kazanım kontrolleri (acquisition controls), C2plus tarama alanı (C2plus scan area) sekmesine gidin ve şerit tarama alanı (band scan area) seçeneğini belirleyin; dikdörtgen maske bu arayüz içerisinde görünecektir. İmleci kullanarak, lazer ablasyonu için hedeflenen segmenti kapsayacak şekilde dikdörtgen bir tarama alanını manuel olarak tanımlayın. Seçimi onaylamak için maske alanı içerisinde sağ tıklayın.

GFP'yi aktive etmek için yalnızca 488 nanometre lazeri kullanarak, yeşil kanalı izlerken zaman ölçümünü başlatın. 488 lazerinin yoğunluğunun nispeten düşük olduğundan emin olun. Ölçüm (measure) ve zaman ölçümü (time measurement) seçeneklerini belirleyerek, ilgi alanındaki GFP'nin ortalama yoğunluğunu ölçün.

ROI içindeki ortalama yoğunluk seviyelerini izlemek için grafik veya veri sekmesini kullanın. Lazer güç kontrolünü tamamen sağa kaydırarak yoğunluğu %100'e çıkarın ve mor lazeri kullanarak böbrek hücrelerinde hasar meydana getirin. Grafik sekmesindeki çizgi grafiği gözlemleyin veya GFP yoğunluğunun sayısal değerlerini görmek için veri sekmesini kullanın ve değerler istenen seviyeye düşene kadar bekleyin.

Örneğin, bazal değerin %50'si. Eliptik ROI içindeki GFP yoğunluğu istenen seviyeye düştüğünde, yazılım kontrol panelindeki lazer güç sürgüsünü tamamen sola kaydırarak mor lazerin yoğunluğunu derhal sıfıra indirin. Son olarak, GFP floresansı için yeni bir bazal değer elde edin.

Bu şekilde gösterildiği gibi, 405 nanometre lazer ışığına maruz kaldıktan sonra GFP floresansı hücre hücre kaybolmaya devam eder. 220. dakikada, ablate edilen segmentin tamamı GFP pozitifliğinin %100'ünü kaybeder. GFP pozitifliğini kaybeden hücrelerde kırmızı floresan propidyum iyodür pozitif çekirdeklerin görülmesinden anlaşıldığı üzere, bu durum GFP ekspresyonunun azalmasından değil, hücre ölümünden kaynaklanmaktadır.

Bu görüntüler, başlangıç maruziyeti değiştirilerek hasarın ve hasarlı epitelyumun verdiği yanıtın ayarlanabildiğini göstermektedir. %10 ila %20 başlangıç GFP fotobleykinginde, hasardan beş saat sonra GFP pozitifliğinde neredeyse hiçbir azalma gözlemlenmez. %50 ve %60'lık oranlar beş saat sonra GFP'nin tamamen kaybolmasına yol açarken, %30 ve %40'lık bleyking orta düzeyde sonuçlar verir ve yaklaşık %35 fotobleykinginde %50 tahmini ölüm gözlemlenir.

Bu durum, %20 fotobleyk işleminin ablasyon sonrası 100. dakikada neredeyse hiç propidyum iyodür boyanmasına yol açmadığı propidyum iyodür boyaması ile desteklenmektedir. Buna karşın, %50 fotobleyk işlemi, 60 dakikadan sonra ablate edilen epitelyumda sürekli propidyum iyodür pozitifliğine neden olur. %30 ve %40 fotobleyk işlemleri ise ara düzeyde propidyum iyodür tutulumuna yol açar.

Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığında 30 dakika içinde tamamlanabilir. Lazerlerle ve kimyasal reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceği unutulmamalıdır; bu prosedür gerçekleştirilirken lazer ışınına bakmaktan kaçınmak ve kimyasalları kullanırken eldiven giymek gibi önlemler her zaman alınmalıdır. Bu prosedürün ardından, böbrek hasarını ve onarımını hücresel ve moleküler düzeyde incelemeyi amaçlayan ek soruları yanıtlamak için zaman ayarlı mikroskopi, immünofloresan boyama ve benzeri diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu tekniğin geliştirilmesinin ardından, böbrek rejenerasyonu alanındaki araştırmacıların önü açılmıştır. Çalışmanın amacı, Zebrafish'lerde kolektif hücre göçünün ve yaralanma sonrası böbrek onarımının rolünü incelemektir. Bu videoyu izledikten sonra, GPF transgenik Zebrafish larvaları ve embriyolarında belirli böbrek segmentlerine zarar vermek için konfokal mikroskobun nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.