Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Bu prosedürün genel amacı, maya hücrelerindeki mikrotübül dinamiklerini ölçmektir. Bu yöntem, tübüllerdeki ve mikrotübül düzenleyicilerindeki mutasyonların canlı bir hücredeki mikrotübül dinamiklerini nasıl düzenlediği gibi mikrotübül alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, canlı maya hücrelerinin görüntüde stabilize olmasıdır.

Bunun yerine, on dakika boyunca yüksek zaman çözünürlüğü veya birkaç saat boyunca düşük zaman çözünürlüğü. Prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan iki yüksek lisans öğrencisi olan Colby Fees ve Cassi Estrem olacak. Bu deneyde kullanılan maya hücreleri, GFP etiketli tübülini yapısal olarak eksprese etmek için yapılmıştır.

Maya hücrelerinin yaklaşık bir mikrolitresini, üç mililitre sentetik tam ortamda bir plaka üzerindeki tek bir koloniden aşılayın. Hücrelerin 250 RPM'de çalkalayarak gece boyunca 30 santigrat derecede büyümesine izin verin. Ertesi gün, doymuş kültürü ortamda 0.1'den daha düşük bir OD600'e seyreltin.

Seyreltilmiş kültürü üç ila dört saat boyunca veya OD600 0.4 ile 0.8 arasında olana kadar 30 derece Santigrat çalkalayıcıya geri koyun. Dört inç genişliğinde ve yedi inç uzunluğunda bir parça halinde bir parafin film tabakası keserek akış odası slaytlarının hazırlanmasına başlayın. Parafin filmin dört inç genişliğine uzunlamasına standart bir mikroskop lamı yerleştirin ve filmi, slaytın etrafına üç ila dört kat kalınlığında bir filmle kaplanacak şekilde üç ila dört kez sarın.

Makul bir sızdırmazlık olduğundan emin olmak için katmanları birbirine bastırın, ancak çok sert bastırmaktan veya filmin kırışmasına neden olmaktan kaçının. Temiz bir kutu kesici, tıraş bıçağı ve kesmek için düz bir kenar sağlamak için başka bir sürgü kullanarak, parafin filmi sürgünün dış kenarları boyunca kesin. Fazla filmi çalışma slaytından soyun ve atın.

İkinci slaytı düz kenar olarak kullanarak, yığılmış film katmanlarını slaytın uzun ekseni boyunca her biri iki ila dört milimetre genişliğinde yaklaşık 10 şerit halinde kesin. Daha sonra, iki ila dört milimetre genişliğinde, 23 ila 24 milimetre uzunluğunda ve üç ila dört katman kalınlığında şeritler oluşturmak için yığılmış parafin film katmanlarını slaydın kısa ekseni boyunca önceki kesimlere dik olarak kesin. Kesilen film şeritlerini soymak için 45 derecelik bir açıyla bir tıraş bıçağı kullanın.

Ardından, istenen sayıda oda oluşturmak için kesilen şeritleri temiz bir mikroskop lamı üzerine eşit olarak dağıtmak için forseps kullanın. Bu örnekte, üç oda oluşturmak için dört film şeridi kullanılacaktır. Film şeritlerinin üzerine tek bir kapak fişi yerleştirin ve forseps ile yerine hareket ettirin.

Hazırlanan slaytı yerleştirin, kapağı yukarı kaldırın, yaklaşık 95 santigrat dereceye ayarlanmış bir sıcak plakaya yerleştirin ve film şeritleri yarı saydam olana kadar slaytı yaklaşık üç dakika ısıtın. Kapak fişinin doğrudan parafin film şeritlerinin üzerinde bulunan bölgelerine hafifçe bastırmak için cımbız kullanarak sürgüyü ve kapak kızağını birbirine kapatın. Sürgüyü sıcak plakadan çıkarmak için forseps kullanın ve kapak kayma tarafı yukarı bakacak şekilde soğuması için bir kenara koyun.

Slayt soğudukça, film beyaz opak bir renge dönecektir. Bu işleme başlamak için, donmuş 200 mikrolitrelik bir Concanavalin A alikotunu oda sıcaklığında çözün. Hazırlanan slaytın her bir haznesine açık uçlardan birine pipetleyerek yaklaşık 100 mikrolitre çözülmüş Concanavalin A ekleyin.

Ardından, Concanavalin A'nın kapak kızağına yapışmasını sağlamak için sürgüyü asın, kapağı aşağı doğru iki mikrofüj tüpü rafı arasına beş dakika boyunca asın. Sürgüyü bir kapak kayma konumuna getirin ve hazneyi sentetik tam ortamla yıkayarak Concanavalin A'yı çıkarın. Haznenin bir ucundan sıvı çekmek için bir kağıt havlunun köşesini kullanarak haznenin diğer ucuna aynı anda taze sıvı pipetleyerek hazne hacminin iki katı kadar ortam akıtın.

Hücreleri, yönlendirilmiş akış yöntemini kullanarak hücre süspansiyonunun hazne hacminin iki katı akarak yükleyin. Hücrelerin kapak kızağına yapışmasını sağlamak için slaytı asın, kapağı aşağı doğru 10 dakika boyunca asın. Sentetik tam ortamın hazne hacminin dört katından akarak yapışmayan hücreleri yıkayın.

Haznenin her iki ucunu bir kağıt havlunun temiz bir köşesiyle dikkatlice kurulayın ve menisküsü kapak kaymasının kenarına getirin. Haznenin her iki ucunu ılık sızdırmazlık maddesi ile kapatın. Görüntü alımı, 1.45 NA 100X CFI Plan Apo objektif, bir Piezoelektrik aşama, bir dönen disk konfokal tarama ünitesi, bir aydınlatma lazeri ve bir EMCCD kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop ile gerçekleştirilecektir.

Görüntü alımı sırasında sahnenin sıcaklığını oda sıcaklığında tutun. Hücreleri odağa getirin ve alım alanının aynı odak düzleminde bir araya getirilmiş en az beş ila altı hücreye sahip olduğundan emin olmak için slaytta birlikte gruplandırılmış hücreleri arayın. Zaman içinde birden fazla zSeries toplamak için çok boyutlu bir satın alma programlayın.

Etkin alım ayarlarındaki ayarları aşağıdaki gibi ayarlayın: Tüm maya hücresini kapsayacak şekilde altı mikrometrelik toplam Z derinliği, aşırı örnekleme olmadan ışık toplamayı en üst düzeye çıkarmak için 300 nanometrelik Z adım boyutu, toplam 10 dakikalık süre, zSerileri arasında dört saniyelik zaman aralıkları ve her Z düzlemi için 90 milisaniyelik pozlama süresi. Çalıştır'a tıklayarak alıma başlayın ve 10 dakikalık süre boyunca çalışmasına izin verin. Veriler bir görüntü serisi olarak kaydedilir ve burada zaman atlamalı görüntülemenin örnek bir sonucu gösterilir.

ImageJ'yi açarak ve alınan görüntü yığınını doğrudan kontrol paneline sürükleyerek görüntü analizini başlatın. İçe aktarılan biyografi formatları otomatik olarak başlayacaktır. Görüntü yığınını bir hiper yığın olarak yüklemek için Tamam'ı seçin.

ZProject işlevini kullanarak, her zSeries'i en fazla iki boyutlu projeksiyon yoğunluğuna daraltın. İşlem menüsünü, filtre alt menüsünü ve medyan özelliğini seçerek benek parazitini azaltmak için görüntü yığınına bir orta filtre uygulayın. Yarıçap kutusuna 2.0 piksel girin ve Tamam'ı tıklayın"Alandaki NFA öncesi hücreleri tanımlayın.

Bunlar, orta büyüklükte tomurcuklar ve yaklaşık bir ila bir nokta beş mikrometre uzunluğunda kısa bir mitotik iğ ile karakterize edilir. Görüntü serisinin ilk zaman noktasından başlayarak, astral mikrotübül ile daha yoğun olarak etiketlenmiş iğ mikrotübülleri arasındaki kavşakta bulunan noktadan sitoplazmadaki artı uca kadar tek bir astral mikrotübül boyunca bir çizgi çizmek için segmentli çizgi aracını kullanın. Segmentli çizgiyi tamamlamak için mikrotübülün ucuna çift tıklayın.

Klavyedeki M düğmesine basarak ölçüm özelliğini kullanarak ölçümü sonuç tablosuna kaydedin. Tüm zaman noktaları için ölçümler yapıldıktan sonra, sonuçlar tablosundan verileri kopyalayın, bir elektronik tabloya yapıştırın ve verileri seçmek için Farklı Kaydet'i seçin. Bu grafik, vahşi tip bir hücrede astral mikrotübül dinamiğinin bir zaman serisini ve daha önce daha kararlı mikrotübüllere sahip olduğu gösterilen mutant bir suşu göstermektedir.

Mikrotübüller, mikrotübül uzunluğunu görselleştirmek için GFP etiketli alfa tübülin olarak etiketlenir. Kırmızı oklar, bir astral mikrotübülün toplam uzunluğunu izler ve ok uçları artı uçları gösterir. Mikrotübül uzunlukları her bir zaman noktasında sekiz dakika boyunca ölçüldü ve bu derlenen uzunluklar yaşam grafiklerinde gösterildi.

Yeşil noktalar polimerizasyonu, pembe noktalar ise depolimerizasyonu gösterir. Felaket olayları ok uçları ile gösterilir. Bu grafikler, mutanttaki mikrotübülün daha uzun olduğunu ve vahşi tip mikrotübülden daha az felaket sergilediğini göstermektedir.

Ayrıca çıkan ve alçalan mikrotübül uzunluklarının eğimlerinden belirlenen polimerizasyon ve depolimerizasyon hızları, mutantta vahşi tipe göre azalmaktadır. Mikrotübül dinamiğinin ölçümleri, mutant hücredeki mikrotübülün vahşi tipe kıyasla azalmış dinamiğe sahip olduğunu da ortaya koymaktadır. Ana kopya oluşturulduktan sonra, slayt hazırlama, hücre yükleme ve görüntü alma 30 dakika içinde gerçekleştirilebilir, bu da tek bir günde birçok farklı numunenin görüntülenebileceği anlamına gelir.

Bu videoyu izledikten sonra, maya hücrelerinin basit slayt odalarında nasıl stabilize edileceğini, dört boyutlu olarak nasıl görüntüleneceğini ve canlı hücrelerde mikrotübül dinamiklerini nasıl ölçeceğinizi iyi anlamanız gerekir. Mikrotübüllere ek olarak, bu prosedür, canlı maya hücrelerindeki diğer floresan etiketli proteinlerin dinamiklerini saniyelerden saatlere kadar değişen zaman ölçeklerinde ölçmek için değiştirilebilir.