Name: Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Öğrenin, maya hücrelerinde mikrotübül dinamiklerini yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile ölçme yöntemini. GFP etiketli tübulin kullanarak canlı hücre görüntüleme ve kantitatif analiz tekniklerini keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çeşitli FP-TUB1 plazmidler paylaşımı için Kerry Bloom (Kuzey Carolina Üniversitesi), Kyung Lee (NCI), Steven Markus (Colorado Eyalet Üniversitesi), ve Elmar Schiebel (Universität Heidelberg) teşekkür ederim. Biz slayt odası hazırlama yönteminde bizi eğitimi için Melissa Gardner (Minnesota Üniversitesi) minnettarız. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) (JKM kadar) R01GM112893-01A1 ve (CE) T32GM008730 hibe tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).</li>
<li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).</li>
<li>Byers, B., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+spindles+and+spindle+plaques+in+the+cell+cycle+and+conjugation+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).</li>
<li>Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Tub4p%2C+a+yeast+gamma-tubulin-like+protein%3A+implications+for+microtubule-organizing+center+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function.</a> J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).</li>
<li>Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-Tubulin-like+Tub4p+of+Saccharomyces+cerevisiae+is+associated+with+the+spindle+pole+body+substructures+that+organize+microtubules+and+is+required+for+mitotic+spindle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation.</a> J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).</li>
<li>Winey, M., Bloom, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22491889">Mitotic spindle form and function.</a> Genetics. 190 (4), 1197-1224 (2012).</li>
<li>Gupta, M. L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Tubulin+C354+mutations+that+severely+decrease+microtubule+dynamics+do+not+prevent+nuclear+migration+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast.</a> Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).</li>
<li>Moore, J. K., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+mitosis+with+cell+polarity%3A+Molecular+motors+at+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).</li>
<li>Gartz Hanson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+alpha-tubulin+mutation+disrupts+neural+development+and+tubulin+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis.</a> Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).</li>
<li>Fees, C. P., Aiken, J., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+negatively+charged+carboxy-terminal+tail+of+beta-tubulin+promotes+proper+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation.</a> Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).</li>
<li>Song, S., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+of+Saccharomyces+cerevisiae+CDC5+in+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis.</a> J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).</li>
<li>Knop, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+tagging+of+yeast+genes+using+a+PCR-based+strategy%3A+more+tags+and+improved+practical+routines%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines.</a> Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).</li>
<li>Kosco, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+microtubule+dynamics+by+Stu2p+is+essential+for+spindle+orientation+and+metaphase+chromosome+alignment+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast.</a> Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).</li>
<li>Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+stabilization+of+microtubule+dynamic+instability+in+vitro+by+vinblastine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine.</a> Biochemistry. 32 (5), 1285-1293 (1993).</li>
<li>Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+novel+and+discrete+functions+for+tubulin+carboxy-terminal+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails.</a> Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).</li>
<li>Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+living+budding+yeast%3A+anaphase+A+but+no+metaphase+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate.</a> Science. 277 (5325), 574-578 (1997).</li>
<li>Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc14-regulated+midzone+assembly+controls+anaphase+B%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B.</a> J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).</li>
<li>Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Plasmids+for+Fluorescent+Protein+Tagging+of+Microtubules+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae.</a> Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Tomurcuklanan maya modeli zamanla görüntü tek mikrotüpcüklere yetenek ve maya genetik araçlarını kullanarak tübülinler ve mikrotübül düzenleyicileri manipüle etme yeteneği dahil olmak üzere, bir in vivo ortamda mikrotübül dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü ölçümler toplamak için önemli avantajlar sunuyor. Konkanavalin A ile kaplı bölmeler erimiş agar pedleri de dahil olmak üzere daha önce tarif edilen tertibatlarda, üzerinde bir çok avantaj sağlar. odaları ile Slaytlar önceden yapıl...

Mikrotübüller αβ-tübülin proteini alt ünitelerinin yapılmış iskelet polimerlerdir ve hücre içi ulaşım, hücre bölünmesi, morfojenez ve motilite içeren hücresel bağlamlarda çeşitli kullanılmaktadır. nerede ve ne zaman mikrotubuller formu bu çeşitli roller için mikrotübül ağları oluşturmak için, hücreler dikkatle düzenleyen gerekir. Bu düzenleme, serbest alt-birimler halinde mikrotübül polimerler veya demonte mikrotübüllere αβ-tübülin alt-birimleri monte ya da bu reaksiyonların kontrol edilmesi ile elde edilir; Bu mikrotübül dinamiklerinin olarak bilinir. mikrotübül alanının önemli bir amacı, tübülin ve / ya da mikro tüpler bağlanan αβ-tübülin alt-birimleri ve dışsal düzenleyiciler çalışmalar dahil olmak üzere mikrotübül dinamiklerine, düzenleyen moleküler mekanizmalarını etmektir. Ve iyi bilinen bir deneysel yaklaşım com genellikle, saflaştırılmış αβ-tübülin proteini kullanılarak, in vitro olarak, bu sistem tekrar oluşturmak için olanSaflaştırılmış dış düzenleyicileri ile bileflimini. Bu yararlı bir yaklaşım olsa da, yeniden oluşturulmuş bir sistemde mikrotübül dinamikleri canlı hücrelerde gözlenen olandan kuvvetle farklılık olduğu açıktır. Örneğin, mikrotübüller daha hızlı büyür ve in vitro in vivo daha yavaş küçültmek. Bu farklılıklar, hücreler bilinen dış düzenleyiciler 1 mevcudiyeti, aynı zamanda, henüz tanımlanmamış-faktörlere bağlı olabilir. Nedenle, mikrotübül düzenleyiciler ve bir yerli hücresel bağlamda dinamiklerini bozacak mutantların faaliyetlerini belirlemek için çok önemlidir. metazoan modelleri mikrotübül fonksiyonunu ve üst düzey örgüt araştırmak için geçerli olan sistemler olduğu kanıtlanmış olmasına rağmen, birkaç pratik kaygılar ciddi mikrotübül dinamiklerinin hassas ölçümü için bu modellerin yarar sınırlar. İlk olarak, hücre başına binlerce onlarca arasında değişen mikrotübül yüksek sayıda, güvenle etmek zorlaştırırzamanla bireysel Mikrotübülleri izlemek. Birçok çalışmada seçici böyle uç bağlayıcı (EB) ailede proteinler gibi mikrotübül uçlarına lokalize proteinler görüntüleme yoluyla bu sorunu aşmak. Bununla birlikte, bu proteinler, sadece Metazoan&#39;da 2 mikrotübülleri büyüyen uçları lokalize bilinmektedir. Bu nedenle, bu proteinlerin programı yalnızca dolaylı olarak felaket sıklığı dinamikleri diğer yönleri, ölçüm yaparken doğrudan büyüme oranları ölçümü ile sınırlıdır. İkincisi, genom düzenleme teknolojisindeki gelişmeler rağmen kararlı bir şekilde floresan etiketli tubulin veya selektif tübülin veya mikrotübül düzenleyiciler işlemek için mutasyonlar tanıtarak ifade eden hücreleri oluşturarak önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Üstelik Metazoan&#39;da birçok tübülin izotiplerinin varlığı mutasyonları bireysel tübülin genleri nasıl etkilediğini çalışma boşa çıkarıcıdır. Çiçek mayası sistemi in vivo microtubu ölçüm için çeşitli önemli avantajlar sağlarle dinamiği. Maya bireysel mikrotübül görselleştirme izin basitleştirilmiş mikrotübül ağı bulunmaktadır. Mayada, mikrotübüller çekirdek zarfına 3 gömülü mil kutup gövdelerinin (SPBs) olarak bilinen merkezi organize kaynaklanmaktadır. SPBs mikrotübül 4, 5 çekirdeklenmesi γ-tübülin küçük kompleksleri için iskelet olarak hizmet vermektedir. SPBs mikrotübül, mil mikrotübül ve astral mikrotübül iki sınıfları çekirdekleştirmek. Nükleolazma içine Mil mikrotubuller projesi ve kinetochore mikrotübül aracılığıyla kromozomların bağlayabilmek için ve interpolar Mikrotübülleri 6 örtüşen yoluyla mil stabilize için önemlidir. Buna karşılık, astral mikrotübül dışa sitozol içine proje ve iğ mikrotübüller yoğun ağına nispeten nadir karşılaştırılır. Mitoz sırasında önceden anafaz hücreler SPB ya çıkan sadece 1-2 astral mikrotübülleri sahiptir; Bu i olarak varyerine 7 demetleri olarak daha ndividual mikrotübüller. mitoz sırasında mikrotübüllerin Astral rolü tomurcuk boyun olarak bilinen anne ve tomurcuk bölmeleri arasındaki birleşme içine çekirdeği ve mil taşımaktır. Bu hareket, doğru ve en sonunda tomurcuk boyun 8 içine çekirdeği ve mil çekme astral mikrotübüller üzerindeki kuvvet üretir iyi tanımlanmış yolları kapsar. maya sisteminin bir diğer avantajı, eşsiz bir hassasiyetle mikrotübül düzenleyiciler ve tübülin alt-birimleri araştırmak için kullanılabilir olan genetik bir programı. Tek bir β-tübülin geni (TUB2) ve iki α-tubulin genleri (TUB1 ve TUB3): Maya da bir tübülin izotiplerinin basitleştirilmiş repertuar sahiptirler. Mutasyonlar hali hazırda bu genlerin sokulur ve böylece homojen bir tübülin nüfus 9, 10 olarak incelenebilir. yaygın bir dizi vardırMevcut etiketleme mikrotübül için yapılar ve bu kararlı ifadesi için kromozom lokuslarındaki entegrasyon için hedeflenebilir (Tartışma). Bu yöntemin genel amacı, mikrotübül dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü ölçümler için dört boyutta (X, Y, Z ve T), maya hücreleri, canlı görüntü tek mikrotübüllere etmektir. maya hücrelerinde floresan etiketli tubulin konstitütif, düşük seviyeli bir ekspresyon için yapıları birleştirmek için yöntemler tarif edilmiştir. görüntüleme önce, canlı hücreler uzun süreli görüntüleme için hücrelerini kararlı hale lektin Concanavalin A ile kaplanmış kayar odalarına monte edilmiştir. görüntü elde etmek için en uygun parametreler, hem de veri analizi için bir iş akışı, ayrıca açıklanmıştır.

<table><tbody><tr><td>DOB (bırakma tabanları)</td><td>Gündoğumu bilimi&nbsp;</td><td>1650</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Leu</td><td>Gündoğumu bilimi&nbsp;</td><td>1005</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Ameresco</td><td>N833</td><td></td></tr><tr><td>100 mm polistiren plakalar</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>ssDNA (Samon Sperm)&nbsp; steril DiH2O</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>&nbsp; D7656</td><td>, DiH2O'da 10 mg / mL'de yeniden süspansiyon haline getirilir. Alikotları -20 &gtm'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Sentetik Komple Ortam&nbsp;</td><td>Gün doğumu bilimi&nbsp;</td><td>1459-100</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L7647</td><td>, DiH2O'da 2 mg / mL'de yeniden süspansiyon haline getirilir. Alikotları -20 &gtm'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Lameller</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>parafin filmi</td></tr><tr><td>VALAP (Vazelin, lanolin ve parafinin eşit parçaları)</td><td></td><td></td> <td>75 ° C'de erir; Forseps kullanmadan önce C</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-106</td><td></td></tr><tr><td>Poyetilen glikol (PEG) 3350</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>202444</td><td></td></tr><tr><td>İsim</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti E ters Mükemmel Odak mikroskobu</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>1.45 NA 100X CFI Plan Apo objektif</td><td>Nikon Instruments</td><td>MRD01905</td><td></td></tr><tr><td>Piezo elektrikli sahne&nbsp;</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-736</td><td></td></tr><tr><td>Dönen disk tarayıcı</td><td>Yokogawa</td><td>CSU10</td><td></td></tr><tr><td>Lazer birleştirici modülü</td><td>Agilent Technologies</td><td>MCL400B</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD kamera</td><td>Andor Teknolojisi</td><td>iXon Ultra 897&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements yazılımı</td><td>Nikon Instruments</td><td>MQS31100</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel yazılımı</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB yazılımı</td><td>MathWorks, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ64</td><td>NIH</td><td></td><td>Rasband, W.S., ImageJ, U.S. Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, Maryland, ABD, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.</td></tr><tr><td>Biyo-Formatlar İçe Aktarıcı eklentisi</td><td>Açık Mikroskopi Ortamı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pUC19-LEU2::GFP-TUB1</td><td></td><td>pSK1050</td><td>referans: Song, S. ve Lee, K. S. Sitokinezde Saccharomyces cerevisiae CDC5'in yeni bir işlevi. J Hücre Biol. 152 (3), 451-469 (2001)</td></tr></tbody></table>

yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve bireysel astral mikrotubul dynamics analizi budding maya

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dinamik mikrotübülüsler birçok hücresel süreçlere temeldir ve mikrotübül dinamiklerinin doğru ölçümler hücreleri bu süreçleri düzenleyen nasıl içine ve nasıl genetik mutasyonlar darbe düzenleme öngörü sağlayabilir. metazoan modellerinde mikrotübül dinamiklerinin miktar genetik manipülasyonlara yüksek mikrotübül yoğunluğu ve ilişkin kısıtlamalar da bulunmaktadır ilişkili zorluklar, bir dizi vardır. Buna karşılık, tomurcuklanan maya modeli bu zorlukların üstesinden avantajlar sunuyor. Bu protokol, maya hücreleri, canlı bir mikrotübül dinamiklerinin ölçmek için bir yöntemi tarif etmektedir. floresan etiketli tubulin ifade eden hücreler, sabit zaman atlamalı görüntü elde etmek için izin monte kayar odalarına yapıştırılır. Yüksek hız için ayrıntılı bir rehber, dört boyutlu görüntü elde etme de eş odaklı görüntü yığınlarının dinamik mikrotübül özelliklerinin ölçülmesi için bir protokol, hem de temin edilmektedir. Bu yöntem, geleneksel maya genetik ile birlikte, atakantitatif tübülin alt-birimleri aktivitesini değiştiren mikrotübül regülatörleri veya mutasyonların etkilerini değerlendirmek için çok uygundur bir yaklaşım IdeS.

maya hücreleri canlı mikrotübül dinamiklerinin Ölçüm mikrotübül regülatörleri veya tubulin kodlayan genlerdeki mutasyonların etki polimerizasyonu ve depolimerizasyon oranları, aynı zamanda bu durumları arasındaki geçişin frekans alt-birimlerini ne kadar değerlendirmek için ilgi çekici bir araç sağlar. Şekil 1&#39;de, bir vahşi tip hücre astral mikrotübül dinamiklerinin bir zaman serisi ve (430Δ tub2-) β-tubulin bir mutasyona sahip bir mutant hücre. Mikrotübüller...

Maya tomurcuklanan nedeniyle güçlü genetik ve mikrotübül hücre iskeletinin basitliği için in vivo olarak mikrotübül dinamiklerinin çalışmak için avantajlı bir modeldir. Aşağıdaki protokol dönüşümü ve kültür maya hücreleri eş odaklı mikroskopi görüntü elde ve kantitatif maya hücrelerini canlı mikrotübül dinamiklerini analiz etmek açıklamaktadır.

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Bu prosedürün genel amacı, maya hücrelerindeki mikrotübül dinamiklerini ölçmektir. Bu yöntem, tübüllerdeki ve mikrotübül düzenleyicilerindeki mutasyonların canlı bir hücrede mikrotübül dinamiklerini nasıl düzenlediği gibi, mikrotübül alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, canlı maya hücrelerinin görüntüleme sırasında stabilize edilmesidir.Aksine, on dakika için yüksek zaman çözünürlüğü veya birkaç saat için düşük zaman çözünürlüğü kullanılır. Prosedürü, laboratuvarımdan iki lisansüstü öğrenci olan Colby Fees ve Cassi Estremle göstereceğiz. Bu deneyde kullanılan maya hücreleri, GFP etiketli tubulini sürekli olarak eksprese edecek şekilde oluşturulmuştur.Bir plakadaki tek bir koloniden alınan yaklaşık bir mikrolitre maya hücresini, üç mililitre sentetik komple besiyerine inoküle edin. Hücrelerin 30 °C'de, 250 RPM çalkalamayla gece boyunca büyümesine izin verin. Ertesi gün, doygun kültürü besiyeri içinde OD600 değeri 0,1'in altına düşecek şekilde dilüe edin.Seyreltilmiş kültürü, OD600 değeri 0,4 ile 0,8 arasına gelene kadar üç ila dört saat boyunca 30 derece Celsius çalkalayıcıya geri koyun. Dört inç genişliğinde ve yedi inç uzunluğunda bir parafin film parçası keserek akış odası lamlarının hazırlanmasına başlayın. Standart bir mikroskop lamını, parafin filmin dört inçlik genişliğine boyunca yerleştirin ve lamı üç ila dört kat filmle kaplayacak şekilde filmi lamın etrafına üç ila dört kez sarın.Makul bir sızdırmazlık sağlandığından emin olmak için katmanları birbirine bastırın, ancak çok sert bastırmaktan veya filmin kırışmasına neden olmaktan kaçının. Temiz bir maket bıçağı ucu ve kesim için düz bir kenar sağlayacak başka bir lam kullanarak, parafin filmi lamın dış kenarları boyunca kesin. Fazla filmi çalışma lamı üzerinden soyun ve atın.İkinci lamı düz bir kenar olarak kullanarak, üst üste dizilmiş film tabakalarını lamın uzun ekseni boyunca, her biri iki ila dört milimetre genişliğinde yaklaşık 10 şeride bölün. Ardından, üst üste dizilmiş parafin film tabakalarını, önceki kesimlere dik olarak lamın kısa ekseni boyunca keserek iki ila dört milimetre genişliğinde, 23 ila 24 milimetre uzunluğunda ve üç ila dört tabaka kalınlığında şeritler oluşturun. Kesilen film şeritlerini soymak için bir jileti 45 derecelik açıyla kullanın.Ardından, istenen sayıda bölme oluşturmak için kesilen şeritleri bir penset yardımıyla temiz bir mikroskop lamı üzerine eşit şekilde dağıtın. Bu örnekte, üç bölme oluşturmak için dört film şeridi kullanılacaktır. Film şeritlerinin üzerine tek bir lamelle örtü kapatın ve pensetle uygun konuma getirin.Hazırlanan lamı, lamel kısmı yukarı gelecek şekilde yaklaşık 95 °C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı plaka üzerine yerleştirin ve film şeritleri şeffaflaşana kadar lamı yaklaşık üç dakika ısıtın. Bir cımbız yardımıyla, lamelin parafin film şeritlerinin tam üzerinde kalan bölgelerine nazikçe bastırarak lam ve lameli birbirine mühürleyin. Lamı ısıtıcı plakadan çıkarmak için pens kullanın ve lamel kısmı yukarı bakacak şekilde soğumaya bırakın.Slayt soğudukça, film tekrar beyaz opak bir renge dönecektir. Bu prosedüre başlamak için, dondurulmuş 200 µL'lik Concanavalin A alikotunu oda sıcaklığında çözdürün. Açık uçlardan birine pipetleme yaparak, hazırlanan slaytın her bir haznesine yaklaşık 100 µL çözdürülmüş Concanavalin A ekleyin.Ardından, Concanavalin A'nın lamel üzerine yapışmasını sağlamak için lamı, lameli aşağı bakacak şekilde iki mikrofüj tüp rafı arasına beş dakika boyunca asın. Lamı tekrar lameli yukarı bakacak konuma getirin ve odağı sentetik tamamlayıcı besiyeri ile yıkayarak Concanavalin A'yı uzaklaştırın. Kağıt havlunun bir köşesini kullanarak odağın bir ucundan sıvıyı çekerken, aynı anda diğer uçtan taze sıvı pipetleyerek odağın iki katı hacminde besiyerini odağın içinden geçirin.Yönlendirilmiş akış yöntemini kullanarak, hücre süspansiyonunun oda hacminin iki katı kadarını akıtarak hücreleri yükleyin. Hücrelerin lamelle yapışmasını sağlamak için lameli, kapatma camı aşağıya gelecek şekilde 10 dakika boyunca asılı tutun. Sentetik tam besiyerinin oda hacminin dört katı kadarını akıtarak yapışmayan hücreleri yıkayıp uzaklaştırın.Bir kağıt havlunun temiz bir köşesiyle haznenin her iki ucunu dikkatlice kurulayarak menisküsü ön camın kenarına getirin. Haznenin her iki ucunu sıcak sızdırmazlık malzemesiyle mühürleyin. Görüntüleme, 1,45 NA 100X CFI Plan Apo objektif, Piezoelektrik tabla, döner disk konfokal tarama ünitesi, aydınlatma lazeri ve bir EMCCD kamera ile donatılmış ters mikroskop kullanılarak gerçekleştirilecektir.Görüntüleme sırasında sahnenin sıcaklığını oda sıcaklığında tutun. Hücreleri odağa getirin ve görüntüleme alanının aynı odak düzleminde kümelenmiş en az beş ila altı hücre içerdiğinden emin olmak için lam üzerinde grup halindeki hücreleri arayın. Zaman içinde birden fazla zSerisi toplamak için çok boyutlu bir görüntüleme programı oluşturun.Aktif görüntüleme ayarlarındaki parametreleri şu şekilde düzenleyin: Tüm maya hücresini kapsayacak şekilde 6 µm toplam Z derinliği, aşırı örnekleme yapmadan ışık toplamayı maksimize etmek için 300 nm Z adım boyutu, 10 dakika toplam süre, zSerileri arasında 4 saniyelik zaman aralıkları ve her Z düzlemi için 90 ms pozlama süresi. Run düğmesine tıklayarak görüntülemeyi başlatın ve 10 dakikalık sürenin tamamlanmasını bekleyin. Veriler bir görüntü serisi olarak kaydedilir; zaman ayarlı (time-lapse) görüntülemenin örnek bir sonucu burada gösterilmiştir.ImageJ'yi açarak ve elde edilen görüntü yığınını doğrudan kontrol paneline sürükleyerek görüntü analizini başlatın. Bio-formats içe aktarma işlemi otomatik olarak başlayacaktır. Görüntü yığınını bir hyperstack olarak yüklemek için "Tamam" (Okay) seçeneğini belirleyin.ZProject fonksiyonunu kullanarak, her bir zSerisini maksimum yoğunlukta iki boyutlu bir projeksiyona indirgeyin. Speckle gürültüsünü azaltmak için işlem menüsünden filtre alt menüsünü ve ardından medyan özelliğini seçerek görüntü yığınına bir medyan filtre uygulayın. Yarıçap kutusuna 2.0 pixels değerini girin ve Tamam'a tıklayın. Alandaki pre-NFA hücrelerini belirleyin.Bunlar, orta büyüklükte tomurcuklar ve yaklaşık bir ila bir nokta beş mikrometre uzunluğunda kısa bir mitotik iğ ile karakterize edilir. Görüntü serisinin ilk zaman noktasından başlayarak, astral mikrotübül ile daha yoğun etiketlenmiş iğ mikrotübüllerinin birleşme noktasında yer alan kısımdan, sitoplazmada bulunan artı uca kadar tek bir astral mikrotübül boyunca bir çizgi çizmek için bölümlenmiş çizgi aracını kullanın. Bölümlenmiş çizgiyi tamamlamak için mikrotübülün ucuna çift tıklayın.Klavyedeki M düğmesine basarak ölçüm özelliğini kullanarak ölçümü sonuçlar tablosuna kaydedin. Tüm zaman noktaları için ölçümler yapıldıktan sonra, verileri sonuçlar tablosundan kopyalayın, bir hesap tablosuna yapıştırın ve verileri seçmek için "Farklı Kaydet" seçeneğini belirleyin. Bu grafik, yabani tip bir hücredeki ve daha önce daha stabil mikrotübüllere sahip olduğu gösterilen bir mutant suşta astral mikrotübül dinamiğinin zaman serisini göstermektedir.Mikrotübüllerin uzunluğunu görselleştirmek için mikrotübüller GFP etiketli alfa tubulin ile işaretlenmiştir. Kırmızı oklar, ok başları artı uçları belirtecek şekilde, bir astral mikrotübülün toplam uzunluğunu izlemektedir. Mikrotübül uzunlukları sekiz dakika boyunca her zaman noktasında ölçülmüş ve derlenen bu uzunluklar yaşam grafikleriyle gösterilmiştir.Yeşil noktalar polimerizasyonu, pembe noktalar ise depolimerizasyonu göstermektedir. Katastrof olayları ok başlarıyla belirtilmiştir. Bu grafikler, mutanttaki mikrotübülün daha uzun olduğunu ve vahşi tip mikrotübüle göre daha az katastrof sergilediğini göstermektedir.Ek olarak, artan ve azalan mikrotübül uzunluklarının eğimlerinden belirlenen polimerizasyon ve depolimerizasyon hızları, mutantta yaban tipine kıyasla azalmıştır. Mikrotübül dinamiği ölçümleri ayrıca, mutant hücredeki mikrotübülün yaban tipine göre azalmış bir dinamikliğe sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Hazim olunduğunda; lam hazırlama, hücre yükleme ve görüntüleme işlemleri 30 dakikada tamamlanabilir, bu da tek bir günde birçok farklı örneğin görüntülenebileceği anlamına gelir.Slayt odacıkları, Concanavalin A eklemeden önce önceden hazırlanabilir ve saklanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, maya hücrelerini basit slayt odacıklarında nasıl stabilize edeceğiniz, dört boyutlu görüntüleme yapacağınız ve canlı hücrelerde mikrotübül dinamiklerini nasıl ölçeceğiniz konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu prosedür, mikrotübüllerin yanı sıra, canlı maya hücrelerindeki floresan işaretli diğer proteinlerin dinamiklerini saniyelerden saatlere kadar uzanan zaman ölçeklerinde ölçmek için de modifiye edilebilir.

high-resolution-imaging-analysis-individual-astral-microtubule

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Gen silme ve protein aşırı ekspresyonu proteinlerin işlevleri çalışmak için sık kullanılan yöntemlerdir. Bu makalede, bir nüfus protein konsantrasyonu fonksiyonu ve tek hücreli düzeylerde fenotip gelişimi analiz için bir...

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Fisyon mayası cinsel yaşam döngüsünün uzun süreli mikroskobu için tekrarlanabilir bir temel yöntem sunuyoruz. Açıklanan küçük ayarlamalarla, sunulan protokol, araştırmanın üreme sürecinin farklı adımlarına odaklanmasına izin verir.

Bölünme Maya Cinsel Yaşam Döngüsü Mikroskopi

Fisyon maya, Schizosaccharomyces pombe sitokinezi incelemek için mükemmel bir model sistemi, hücre bölünmesi son aşamasıdır. Burada canlı fisyon maya hücreleri farklı cytokinetic olayları analiz etmek için bir mikroskop yaklaşım açıklar.

Fisyon Maya Cytokinetic Olayların zamanmekansal Analizi

Bu protokol, çok renkli 4d (zaman atlama 3D) Konfokal mikroskobu kullanarak mantar tomurcuklanan içinde floresan etiketli hücre içi bölmeler Analizi açıklanmaktadır. Görüntüleme parametreleri, fotodamat kısıtlarken yeterli sinyalleri yakalamak için seçilir. Özel ımagej eklentileri etiketlenmiş yapıların izlenmesini ve niceli olarak analiz edilmesini sağlar.

Maya 4D mikroskopisi

Burada, araştırmacıların mitoz ve Meiosis sırasında yaşayan fisyon Maya hücrelerinde protein davranışları ve nükleer dinamikleri incelemesini sağlayan toksik olmayan bir mikroskopi yöntemi olan canlı hücreli görüntüleme sunuyoruz.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Burada canlı hücre dönen disk konfokal mikroskopisi ve MATLAB tabanlı görüntü işleme kullanarak prometafazda senkronize hücrelerde mikrotübül dinamiği analizinin sağlam ve ayrıntılı bir yöntemini sıyoruz.

Monopolar Mitotik İğlerde Dönen Disk Mikroskobu ile Mikrotübül Dinamiğinin Ölçülmesi

Burada, bozulmamış dokuda süper çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme için bir protokol sunulmaktadır. Son derece hassas bir erişkin kök hücre popülasyonunu doğal doku ortamında görüntüleme koşullarını standartlaştırdık. Bu teknik, biyolojik olayların canlı dokuda doğrudan gözlemlenmesine izin vermek için zamansal ve mekansal çözünürlüğü dengelemeyi içerir.

Hücre Altı Yapıların Süper Çözünürlüklü Canlı Hücre Görüntülemesi

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Fisyon mayası burada, polimerizasyonlarını görselleştirmek için GFP ile translasyonel füzyon proteinleri olarak FtsZ ve MreB gibi bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini eksprese etmek için heterolog bir konakçı olarak kullanılır. Ayrıca, polimerizasyonu etkileyen bileşikler, bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntüleme ile tanımlanır.

Bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini hedef alan antibakteriyel ilaç taramaları için bir platform olarak fisyon mayası

Bu protokol, maya hücresi döngüsü durdurma ve isteğe bağlı salım için iki yöntemi detaylandırır ve hücre döngüsüne bağlı süreçleri incelemek için floresan mikroskobunun kullanımını detaylandırır.

Tomurcuklanan mayada hücre döngüsüne bağlı süreçlerin manipülasyonu ve analizi

Öğrenin, maya hücrelerinde mikrotübül dinamiklerini yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile ölçme yöntemini. GFP etiketli tübulin kullanarak canlı hücre görüntüleme ve kantitatif analiz tekniklerini keşfedin.

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Daha fazla video keşfet