Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Bu prosedürün genel amacı, maya hücrelerindeki mikrotübül dinamiklerini ölçmektir. Bu yöntem, tübüllerdeki ve mikrotübül düzenleyicilerindeki mutasyonların canlı bir hücrede mikrotübül dinamiklerini nasıl düzenlediği gibi, mikrotübül alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, canlı maya hücrelerinin görüntüleme sırasında stabilize edilmesidir.

Aksine, on dakika için yüksek zaman çözünürlüğü veya birkaç saat için düşük zaman çözünürlüğü kullanılır. Prosedürü, laboratuvarımdan iki lisansüstü öğrenci olan Colby Fees ve Cassi Estremle göstereceğiz. Bu deneyde kullanılan maya hücreleri, GFP etiketli tubulini sürekli olarak eksprese edecek şekilde oluşturulmuştur.

Bir plakadaki tek bir koloniden alınan yaklaşık bir mikrolitre maya hücresini, üç mililitre sentetik komple besiyerine inoküle edin. Hücrelerin 30 °C'de, 250 RPM çalkalamayla gece boyunca büyümesine izin verin. Ertesi gün, doygun kültürü besiyeri içinde OD600 değeri 0,1'in altına düşecek şekilde dilüe edin.

Seyreltilmiş kültürü, OD600 değeri 0,4 ile 0,8 arasına gelene kadar üç ila dört saat boyunca 30 derece Celsius çalkalayıcıya geri koyun. Dört inç genişliğinde ve yedi inç uzunluğunda bir parafin film parçası keserek akış odası lamlarının hazırlanmasına başlayın. Standart bir mikroskop lamını, parafin filmin dört inçlik genişliğine boyunca yerleştirin ve lamı üç ila dört kat filmle kaplayacak şekilde filmi lamın etrafına üç ila dört kez sarın.

Makul bir sızdırmazlık sağlandığından emin olmak için katmanları birbirine bastırın, ancak çok sert bastırmaktan veya filmin kırışmasına neden olmaktan kaçının. Temiz bir maket bıçağı ucu ve kesim için düz bir kenar sağlayacak başka bir lam kullanarak, parafin filmi lamın dış kenarları boyunca kesin. Fazla filmi çalışma lamı üzerinden soyun ve atın.

İkinci lamı düz bir kenar olarak kullanarak, üst üste dizilmiş film tabakalarını lamın uzun ekseni boyunca, her biri iki ila dört milimetre genişliğinde yaklaşık 10 şeride bölün. Ardından, üst üste dizilmiş parafin film tabakalarını, önceki kesimlere dik olarak lamın kısa ekseni boyunca keserek iki ila dört milimetre genişliğinde, 23 ila 24 milimetre uzunluğunda ve üç ila dört tabaka kalınlığında şeritler oluşturun. Kesilen film şeritlerini soymak için bir jileti 45 derecelik açıyla kullanın.

Ardından, istenen sayıda bölme oluşturmak için kesilen şeritleri bir penset yardımıyla temiz bir mikroskop lamı üzerine eşit şekilde dağıtın. Bu örnekte, üç bölme oluşturmak için dört film şeridi kullanılacaktır. Film şeritlerinin üzerine tek bir lamelle örtü kapatın ve pensetle uygun konuma getirin.

Hazırlanan lamı, lamel kısmı yukarı gelecek şekilde yaklaşık 95 °C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı plaka üzerine yerleştirin ve film şeritleri şeffaflaşana kadar lamı yaklaşık üç dakika ısıtın. Bir cımbız yardımıyla, lamelin parafin film şeritlerinin tam üzerinde kalan bölgelerine nazikçe bastırarak lam ve lameli birbirine mühürleyin. Lamı ısıtıcı plakadan çıkarmak için pens kullanın ve lamel kısmı yukarı bakacak şekilde soğumaya bırakın.

Slayt soğudukça, film tekrar beyaz opak bir renge dönecektir. Bu prosedüre başlamak için, dondurulmuş 200 µL'lik Concanavalin A alikotunu oda sıcaklığında çözdürün. Açık uçlardan birine pipetleme yaparak, hazırlanan slaytın her bir haznesine yaklaşık 100 µL çözdürülmüş Concanavalin A ekleyin.

Ardından, Concanavalin A'nın lamel üzerine yapışmasını sağlamak için lamı, lameli aşağı bakacak şekilde iki mikrofüj tüp rafı arasına beş dakika boyunca asın. Lamı tekrar lameli yukarı bakacak konuma getirin ve odağı sentetik tamamlayıcı besiyeri ile yıkayarak Concanavalin A'yı uzaklaştırın. Kağıt havlunun bir köşesini kullanarak odağın bir ucundan sıvıyı çekerken, aynı anda diğer uçtan taze sıvı pipetleyerek odağın iki katı hacminde besiyerini odağın içinden geçirin.

Yönlendirilmiş akış yöntemini kullanarak, hücre süspansiyonunun oda hacminin iki katı kadarını akıtarak hücreleri yükleyin. Hücrelerin lamelle yapışmasını sağlamak için lameli, kapatma camı aşağıya gelecek şekilde 10 dakika boyunca asılı tutun. Sentetik tam besiyerinin oda hacminin dört katı kadarını akıtarak yapışmayan hücreleri yıkayıp uzaklaştırın.

Bir kağıt havlunun temiz bir köşesiyle haznenin her iki ucunu dikkatlice kurulayarak menisküsü ön camın kenarına getirin. Haznenin her iki ucunu sıcak sızdırmazlık malzemesiyle mühürleyin. Görüntüleme, 1,45 NA 100X CFI Plan Apo objektif, Piezoelektrik tabla, döner disk konfokal tarama ünitesi, aydınlatma lazeri ve bir EMCCD kamera ile donatılmış ters mikroskop kullanılarak gerçekleştirilecektir.

Görüntüleme sırasında sahnenin sıcaklığını oda sıcaklığında tutun. Hücreleri odağa getirin ve görüntüleme alanının aynı odak düzleminde kümelenmiş en az beş ila altı hücre içerdiğinden emin olmak için lam üzerinde grup halindeki hücreleri arayın. Zaman içinde birden fazla zSerisi toplamak için çok boyutlu bir görüntüleme programı oluşturun.

Aktif görüntüleme ayarlarındaki parametreleri şu şekilde düzenleyin: Tüm maya hücresini kapsayacak şekilde 6 µm toplam Z derinliği, aşırı örnekleme yapmadan ışık toplamayı maksimize etmek için 300 nm Z adım boyutu, 10 dakika toplam süre, zSerileri arasında 4 saniyelik zaman aralıkları ve her Z düzlemi için 90 ms pozlama süresi. Run düğmesine tıklayarak görüntülemeyi başlatın ve 10 dakikalık sürenin tamamlanmasını bekleyin. Veriler bir görüntü serisi olarak kaydedilir; zaman ayarlı (time-lapse) görüntülemenin örnek bir sonucu burada gösterilmiştir.

ImageJ'yi açarak ve elde edilen görüntü yığınını doğrudan kontrol paneline sürükleyerek görüntü analizini başlatın. Bio-formats içe aktarma işlemi otomatik olarak başlayacaktır. Görüntü yığınını bir hyperstack olarak yüklemek için "Tamam" (Okay) seçeneğini belirleyin.

ZProject fonksiyonunu kullanarak, her bir zSerisini maksimum yoğunlukta iki boyutlu bir projeksiyona indirgeyin. Speckle gürültüsünü azaltmak için işlem menüsünden filtre alt menüsünü ve ardından medyan özelliğini seçerek görüntü yığınına bir medyan filtre uygulayın. Yarıçap kutusuna 2.0 pixels değerini girin ve Tamam'a tıklayın. Alandaki pre-NFA hücrelerini belirleyin.

Bunlar, orta büyüklükte tomurcuklar ve yaklaşık bir ila bir nokta beş mikrometre uzunluğunda kısa bir mitotik iğ ile karakterize edilir. Görüntü serisinin ilk zaman noktasından başlayarak, astral mikrotübül ile daha yoğun etiketlenmiş iğ mikrotübüllerinin birleşme noktasında yer alan kısımdan, sitoplazmada bulunan artı uca kadar tek bir astral mikrotübül boyunca bir çizgi çizmek için bölümlenmiş çizgi aracını kullanın. Bölümlenmiş çizgiyi tamamlamak için mikrotübülün ucuna çift tıklayın.

Klavyedeki M düğmesine basarak ölçüm özelliğini kullanarak ölçümü sonuçlar tablosuna kaydedin. Tüm zaman noktaları için ölçümler yapıldıktan sonra, verileri sonuçlar tablosundan kopyalayın, bir hesap tablosuna yapıştırın ve verileri seçmek için "Farklı Kaydet" seçeneğini belirleyin. Bu grafik, yabani tip bir hücredeki ve daha önce daha stabil mikrotübüllere sahip olduğu gösterilen bir mutant suşta astral mikrotübül dinamiğinin zaman serisini göstermektedir.

Mikrotübüllerin uzunluğunu görselleştirmek için mikrotübüller GFP etiketli alfa tubulin ile işaretlenmiştir. Kırmızı oklar, ok başları artı uçları belirtecek şekilde, bir astral mikrotübülün toplam uzunluğunu izlemektedir. Mikrotübül uzunlukları sekiz dakika boyunca her zaman noktasında ölçülmüş ve derlenen bu uzunluklar yaşam grafikleriyle gösterilmiştir.

Yeşil noktalar polimerizasyonu, pembe noktalar ise depolimerizasyonu göstermektedir. Katastrof olayları ok başlarıyla belirtilmiştir. Bu grafikler, mutanttaki mikrotübülün daha uzun olduğunu ve vahşi tip mikrotübüle göre daha az katastrof sergilediğini göstermektedir.

Ek olarak, artan ve azalan mikrotübül uzunluklarının eğimlerinden belirlenen polimerizasyon ve depolimerizasyon hızları, mutantta yaban tipine kıyasla azalmıştır. Mikrotübül dinamiği ölçümleri ayrıca, mutant hücredeki mikrotübülün yaban tipine göre azalmış bir dinamikliğe sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Hazim olunduğunda; lam hazırlama, hücre yükleme ve görüntüleme işlemleri 30 dakikada tamamlanabilir, bu da tek bir günde birçok farklı örneğin görüntülenebileceği anlamına gelir.

Slayt odacıkları, Concanavalin A eklemeden önce önceden hazırlanabilir ve saklanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, maya hücrelerini basit slayt odacıklarında nasıl stabilize edeceğiniz, dört boyutlu görüntüleme yapacağınız ve canlı hücrelerde mikrotübül dinamiklerini nasıl ölçeceğiniz konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu prosedür, mikrotübüllerin yanı sıra, canlı maya hücrelerindeki floresan işaretli diğer proteinlerin dinamiklerini saniyelerden saatlere kadar uzanan zaman ölçeklerinde ölçmek için de modifiye edilebilir.