Name: Ko-çöktürme yoluyla F-aktine Bağlı Proteinin Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Öğrenin, F-aktin ile ko-çöktürme yöntemiyle protein bağlanmasını ve bağlanma afinitesini ölçmeyi. Bu teknik, hücre biyolojisi ve biyokimya araştırmalarında protein etkileşimlerini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Grant Enstitüleri tarafından AVK&#39;ya HL127711 tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+Actin-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li>
<li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li>
<li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-binding+proteins%3A+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li>
<li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li>
<li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li>
<li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li>
<li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.cshlpress.org/default.tpl?cart=148475793033306084&fromlink=T&linkaction=full&linksortby=oop_title&--eqSKUdatarq=678">Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2009).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li>
<li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li>
<li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+gene+family%3A+function+follows+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li>
<li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology%3A+insights+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li>
<li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li>
<li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li>
<li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+actin%3A+purification+and+single+molecule+assembly+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Aktin birlikte sedimantasyon tahlili, bir proteinin F-aktine bağlanıp bağlanmadığını çabucak belirleyebilen basit bir tekniktir. Bazı değişikliklerle teknik, etkileşimin afinitesini ölçmek için de kullanılabilir. Yukarıdaki protokolde ortaya konulan hususlara ek olarak, tahlil tasarlanırken, iletilirken ve yorumlanırken aşağıdaki hususlar dikkate alınmalıdır. İlgi Proteinleri Yeni hazırlanmış veya dondurulmuş protein testte kullanılabilir. Dondurulmuş protein kullanılıyorsa, dondurmanın F-aktin bağlanmasını etkilemediğinden emin olmak için sonuçların taze (asla donmamış) protein ile karşılaştırılması önemle tavsiye edilir. G-aktin Kaynağı Birçok peletleme deneyinde göreceli bolluk nedeniyle kasdan izole edilen G-aktin kullanılır. Memelilerde - alfa, beta ve gamma - üç ana aktin izotipi vardır ki bunlar dikkat çekici derecede birbirine benzemektedir (&gt;% 90 sekans tanımlamaty). Bununla birlikte, izotipler 12 , 13 arasında işlevsel farklılıklar vardır. Mümkünse, bağlanma tahlilinde kullanılan G-aktin izotipi in vivo izotipe uymalıdır. Örneğin iskelet kasında ifade edilen bir proteini test ederseniz alfa-aktin en iyi seçimdir; Fibroblastlarda eksprese edilen bir proteini incelemek için beta-aktin önerilir. Phalloidin Kullanımı Falloidin F-aktini bağladığından, bazı F-aktin bağlayıcı proteinlerin bağlanmasını ( örneğin, faloidin , cofilin bağlamadan aktin filamentlerine blokar) müdahale edebilir veya hatta engelleyebilir. Bu nedenle, phalloidin dikkatle kullanılmalı ve mümkün olduğunca phalloidin ile muamele edilmiş numunelerle karşılaştırılmalıdır. Yüksek Arka Plan Proteinlerin F-aktin yokluğunda tortulaşması nadir değildir ( Şekil 1A , hiçbir F-aktin pelet örneğis). Bununla birlikte, arka plan sedimentasyonunun yüksek seviyeleri, gerçek aktin çökelmesini maskeleyebilir ve imkansız olmasa da, bir proteinin F-aktini bağlayıp bağlamadığını veya etkileşimin afinitesini ölçmesini zorlaştırabilir. Polidicanol tepkime tamponuna ekleme (adım 4.1), arka planı önemli ölçüde azaltabilir ve kolay bir çözümdür. Bu, arka planı azaltmazsa, reaksiyon tamponu, tuz konsantrasyonu ve / veya inkübasyon sıcaklığı ayarlanması yardımcı olabilir. Bağlanma Eğrisi Bir bağlanma eğrisi üretmek için, bir dizi reaksiyon üzerinde ilgi protein veya F-aktinin konsantrasyonunu değiştirmek gereklidir. Pratikte F-aktini sabit bir konsantrasyonda tutmak ve ilgi protein konsantrasyonunu değiştirmek daha kolay ve tercih edilir. Peletleme deneyinde F-aktinin sabit konsantrasyonda ( örn., 2 uM) tutulması, daha yüksek konsantrasyonlarda F-aktin ile spesifik olmayan yakalama sayısını sınırlar veDüşük (&lt;0.5 uM) F-aktin konsantrasyonlarında depolimerizasyon. Depolimerizasyon, phalloidin kullanılarak önlenebilir, ancak bu, sisteme potansiyel bir komplike edici faktör getirir (bkz. Adım 3.3 ve üstü). F-aktini sabit bir konsantrasyonda muhafaza etmek, numuneler boyunca F-aktin peletini karşılaştırabilir (ve normalleştirir) ve başarısız deneyleri tanımlamayı sağlar ( yani, F-aktin peletinin çok değişken olduğu, konsantrasyonlarda analizi önlediği durumda). Son olarak, F-aktini sabit bir konsantrasyonda tutmak, birinin aktin filamanına bağlanmanın birlikte çalışıp çalışmadığını belirlemesine izin verir ( Şekil 1C ). Doymuş Bağlama Bütün bağlanma deneylerinde olduğu gibi, F-aktine bağlanmanın doymuş olması ve protein artı F-aktin platolarının konsantrasyonunun kritik olması önemlidir ( Şekil 1C ). Bir plato olmadan doğru bir ayrışma denge sabitinin hesaplanması mümkün değildir. Böylece,Test edilecek seyreltme serisini dikkatlice planlamak ve her zaman daha yüksek konsantrasyonlarda protein ( yani, beklenen Kd&#39;den en az 5-10 kat daha yüksek) içerdiği önemlidir. Bağ Analizi Ölçülen ayrışma sabitlerinin kesin olması için, analiz, ilgi proteinine yönelik olarak F-aktin üzerindeki bağlanma alanlarının konsantrasyonunun afiniteye göre daha düşük olmasına izin veren bir F-aktin konsantrasyonu kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Bu kriterin karşılanıp karşılanmadığını kontrol etmek için bağlama alanlarının B max konsantrasyonunu hesaplayın. Örneğin, eğer [F-aktin] 2 mcM ve B max = 0.5 ise, o zaman [bağlanma bölgeleri] ≈ 1 uM&#39;dir. K d , [bağlanma yerlerinden] en az 5-10 kat daha büyük olmalıdır. Ölçülen Kd, [bağlanma alanları] ile aynı derecede ise, gözlemlenen bağlanma eğrisinin yüksek afiniteli bağlama titrini temsil etmesi mümkündürGerçek bir bağlayıcı izoterm yerine tes. Bu gözlemlenirse, doğru bir afinite ölçmek için tahlil 10 kat daha düşük bir F-aktin konsantrasyonu kullanılarak tekrarlayın. Yüksek afiniteli etkileşimler için afiniteyi doğru bir şekilde ölçmek için düşük bir F-aktin konsantrasyonu elde etmek için phalloidin stabilizasyonu (adım 3.3) gerekli olabilir. Son olarak, araştırmacıların testi yaparken ve değerlendirirken farkında olmaları gereken birlikte sedimantasyon tahlilinde temel sınırlamalar vardır. En önemlisi, birlikte sedimentasyon tahlili gerçek bir denge sabiti oluşturmaz. Bağlanma ürünleri ( yani, protein artı F-aktin), santrifüj işlemi sırasında reaktanlardan ayrılır ve daha sonra ürünler, yeni bir denge yaratmak için ayrışabilir. Sonuç olarak birlikte çöktürme deneyi, düşük afiniteli etkileşimleri yanlış hesaplayabilir veya algılayamaz. Birçok aktin bağlayıcı proteinin F-aktin için düşük bir ( yani, mikromolar) afiniteye sahip olması nedeniyle, negatif bir sonuçtur ( <eM&gt; yani herhangi bir tespit edilebilir bağlanma) bir proteinin F-aktini bağlamadığı anlamına gelmez. Alternatif olarak, TIRF mikroskopi tabanlı, tek filamentli bağlanma deneyleri, bir ayrışma sabitinin belirlenmesinde daha hassas ve daha doğrudur (bu tekniğe yönelik incelemeler için bkz. Referanslar 15,16 ). Bu kısıtlamalara rağmen, peletleme tahlili çoğu araştırmacı tarafından yapılmaktadır ve bir proteinin F-aktine bağlanıp bağlanmadığını belirlemek ve etkileşimin afinitesini ölçmek için etkili bir araçtır.

Aktin, motilite, kasılma, yapışma ve morfoloji gibi çok hücresel süreçlerde kritik bir rol oynayan temel bir sitoskeletal proteintir 1 . Aktin, iki biçimdedir: monomerik globüler aktin (G-aktin) ve polimerize filamentli aktin (F-aktin). Hücreler içinde F-aktin organizasyonu, aktin filamanlarının 2 , 3 , 4 nükleasyonunu, büyümesini, çapraz bağlanmasını ve sökülmesini düzenleyen geniş bir protein koleksiyonu tarafından kontrol edilir. Bununla birlikte, aktin ağı düzenlenmesini düzenleyen çoklu aktin-bağlayıcı proteinlerin nasıl işlediği hala net değildir. Protein-protein etkileşimlerinin ölçümü, proteinlerin hücresel davranış üzerine etkilerini biyokimyasal düzeyde nasıl uyguladığını anlamada önemli bir yaklaşımdır. Saflaştırılmış proteinler arasındaki etkileşimleri saptamak için birçok farklı tahlil kullanılabilir.Çözünür proteinler için yaygın yaklaşımlar pull-down&#39;lar, fluoresan polarizasyonu, izotermal titrasyon kalorimetresi ve yüzey plazmon rezonansıdır. Önemlisi, bu tahlillerin hepsi, proteinlerin çözünür olmasını gerektirir ve bu nedenle, F-aktin gibi bir polimerik, ipliksi protein ile kullanım için uyarlanmak zordur. Burada, bir protein veya protein alanının F-aktine bağlanıp bağlanmadığını belirlemek ve etkileşimin afinitesini ölçmek için bir teknik - aktin birlikte sedimentasyon veya topaklanma, tahlil tanımlıyoruz. Aktin peletleme tahlili, bir ultra-santrifüjün yanı sıra özel ekipman gerektirmeyen nispeten basit bir tekniktir. Tüm reaktifler, temel biyokimya bilgilerini varsayarak veya satın alınarak yapılabilir. F-aktin&#39;e bağlandıktan sonra, deney, görünür afiniteyi ( yani, ayrışma dengesi sabiti) ölçmek için kullanılabilir 5 . Ayrıca, bir kez bir afinite kurulduğunda, peletleme deneyi, Ilgi proteinindeki değişikliklerin ( yani , translasyon sonrası modifikasyonlar, mutasyonlar veya ligand bağlanması) F-aktin 6 ile olan etkileşimini nasıl etkilediğini ölçmek için yararlı bir araçtır. Tekniğin araştırmacının deneyi denemeden önce farkında olması gereken kısıtlamaları vardır (bkz. Tartışma ).

<table><tbody><tr><td>Sorvall MTX 150 Mikro-Ultrasantrifüj</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>S100-AT3 rotor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45585</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj tüpleri - 0,2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45233</td><td></td></tr><tr><td>Aktin, tavşan iskelet kası</td><td>Hücre iskeleti</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>Polidikanol (Thesit)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>88315</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3457</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin trifosfat (ATP)</td> <td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür (NaCl)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Etilen glikol-bis(&beta;-aminoetil eter)-N,N,N',N'-tetraasetik asit (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>3779</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx Görüntüleme Sistemi</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Mavi R-250 Boya</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Kolloidal Mavi Boyama Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC6025</td><td></td></tr></tbody></table>

ko-çöktürme yoluyla f-aktine bağlı proteinin Ölçülmesi

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Hücrelerin içinde filamentli aktin (F-aktin) organizasyonu, aktin nükleasyonu, büyümesi, çapraz bağlanma ve / veya demontajı kontrol eden çok sayıdaki aktin bağlayıcı proteinler tarafından düzenlenir. Bu protokol, bir protein veya protein alanının F-aktin&#39;e bağlanıp bağlanmadığını belirlemek ve etkileşimin afinitesini ( yani, ayrışma dengesi sabiti) ölçmek için bir tekniği - aktin çöktürme veya topaklama testi - tanımlamaktadır. Bu teknikte, ilgilenilen bir protein önce çözeltide F-aktin ile inkübe edilir. Ardından, aktin filamanlarını tortulaştırmak için diferansiyel santrifüj kullanılmış ve topaklaştınlmış malzeme SDS-PAGE ile analiz edilmiştir. Eğer ilgilenilen protein F-aktini bağlarsa, aktin filamentleri ile birlikte çökecektir. Bağlanma tepkimesinin ( yani F-aktin ve ilgili protein) ürünleri etkileşimin afinitesini belirlemek için nicelleştirilebilir. Aktin peletleme tahlili, belirlenmesi için basit bir tekniktirEğer ilgilenilen bir protein F-aktini bağlar ve ligand bağlanması gibi o proteindeki değişiklikler F-aktin ile olan etkileşimini nasıl etkilediğini değerlendirir.

Ko-sedimantasyon deneyinde F-aktine karşı αE-katenin homodimer bağlanmasını inceledi. Geçmiş deneyler, F-aktin için αE-katenin homodimerinin afinitesi 1 uM civarında ve Bmax 1 11&#39;e yakın olduğu gösterdiğinden, düşük bir F-aktin konsantrasyonuyla (2 uM&#39;den ziyade 0.2 uM; tartışma). 0.2 uM kritik konsantrasyonun altında olduğu için, tavşan iskelet kasından G-aktin&#39;den polimerize edilmiş F-aktini stabilize etmek için phalloidin ilave edildi (basamak 3.3). Artan konsantrasyonlarda αE-catenin homodimeri (0.125-12.0 uM) 0.2 uM F-aktin varlığında veya yokluğunda inkübe edildi. Numuneler santrifüje tabi tutuldu ve elde edilen pelletler analiz edildi ( Şekil 1A ). Beklendiği gibi, αE-katenin homodimeri, arka planın üstünde F-aktin ile birlikte çökeltildi ( Şekil 1A , F-aktin pelet numunelerinin no-F-ac&#39;ye kıyaslaKalay pellet örnekleri). BSA, negatif bir kontrol olarak çalıştırıldı ( Şekil 1B ). Bağlanan protein nicelendirildi ve etkileşimin afinitesini hesaplamak için serbest protein üzerine çizildi ( Şekil 1C ). Planlanan veriler en iyi Hill denklemine uymaktadır. Hesaplanan K d 2.9 uM, Bmax 0.2 ve Hill katsayısı (h) 4.8 idi. Dolayısıyla, αE-catenin homodimeri F-aktini, önceki çalışmada (~ 1.0 uM&#39;ye karşı 2,9 μM&#39;nin bir Kd&#39;si) tutarlı, düşük bir mikromolar afinite ile birlikte bağlar 11 . <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Şekil 1: Yüksek hızlı F-aktin birlikte sedimentasyon testi. ( A ) Artan konsantrasyonlar (0.125-12.0 uM) αE-katenin homodimeri, sol panellerle veya sağ paneller olmadan (sağ paneller), phalloidi ile stabilize edilmiş 0.2 uM F-aktin ile kuluçkaya yatırıldın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi ve santrifüj edildi. Toplam (başlangıç ​​maddesinin% 7.5&#39;i) ve pelet haline getirilmiş malzeme (pellet haline getirilmiş malzemenin% 50&#39;si) SDS-PAGE ile ayrılmış ve Coomassie boyasıyla lekelenmiştir. ( B ) 4 uM BSA negatif bir kontrol olarak çalıştırıldı. (+) Veya (-) F-aktin içeren toplam ve pellet örnekleri, SDS-PAGE ile ayrılmış ve Coomassie boyası ile boyanmıştır. ( C ) A&#39;dan bağlanan αE-katenin (μM / μM aktin) serbest αE-katenin (μM) karşısında çizildi ve veriler bir Hill denklemine (kırmızı çizgi) sığdı. K d , B max ve Hill katsayısı (h) listelenmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Şekil 2: Aktin peletleme kantifikasyonu </sTrong&gt; - akış şeması. Bu şema, Toplam ve Pelet örnekleri ( A , CE ) ve kantifikasyon için kullanılan standart eğri ( B ) örnekleriyle, bölüm 5&#39;deki önemli adımları özetlemektedir. 5.13 adımlar: 1 ) Toplam örneklerde (A) ilgi protein miktarını ölçün. 2 ) Bant yoğunluğuna karşı protein kütlesi (B) çizerek standart bir eğri oluşturun. 3 ) F-aktin ( C ) ile çöktürülen ilgi protein miktarını ölçün. 4 ) F-aktin ( D ) yokluğunda peletlenen ilgi protein miktarını ölçün. 5 ) F proteinine bağlı protein miktarını belirlemek için C&#39;den D çıkarın. 6 ) Her bir topakta (E) F-aktinin miktarını ölçün, numune başına F-aktinin ortalama miktarını hesaplayın ve her bir örneği ortalama olarak bölün (aşağıdaki sayılar oranı gösterelim). 7 )Her numune için, pelet içindeki farklılıkları ayarlamak için bağlanmış proteinin miktarını (5. adımda hesaplanan) F-aktin pelet oranı ile bölün (6. adımda hesaplanmıştır). 8 ) Her bir numunede normalize edilmiş bağlanmış proteinin miktarını (kütle) hesaplamak için standart eğriyi ( B ) kullanın (basamak 7). 9 ) Bağlayıcı bir eğri yaratmak için serbest protein ve bağlanmış protein konsantrasyonunu belirleyin. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Bu protokol, bir proteinin filamentli aktinle (F-aktin) birlikte sedimentasyon yeteneğini test etmek için bir yöntem ve bağlanma gözlemlendiğinde etkileşimin afinitesini ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.

Ko-çöktürme yoluyla F-aktine Bağlı Proteinin Ölçülmesi

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Bu tekniğin genel amacı, bir proteinin filamentöz aktin ile birlikte çökelme yeteneğini test etmek ve bağlanma gözlemlenirse etkileşimin afinitesini ölçmektir. Bu yöntem, bir proteinin F-aktine bağlanıp bağlanmadığını belirlemek için basit bir tekniktir. Bu tekniğin avantajları, bir ultrasentrifüj dışında özel ekipman gerektirmemesi ve tüm reaktiflerin hazırlanabiliyor veya satın alınabiliyor olmasıdır.Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı şekilde yüksek saflıkta protein hazırlayın. 280 nanometredeki absorbansı ölçerek protein konsantrasyonunu belirleyin. Kullanımdan hemen önce, çözünmeyen protein agregatlarını uzaklaştırmak için proteini yüksek hızda santrifüjleyin.Çözünürlük bir sorun teşkil ediyorsa, santrifüj sonrası protein konsantrasyonunu yeniden ölçün. Ardından, -80 °C dondurucudan globüler aktin veya g-aktin alikvotunu çıkarın ve hızlıca çözdürün. G-aktine 10X polimerizasyon tamponu ekleyin ve su ile 1X son konsantrasyona kadar seyreltin.Aktinin polimerleşmesini sağlamak için karışımı oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Polimerizasyon sonrası, polimerize olmuş filamentli aktini veya F-aktini, birkaç hafta boyunca stabil kalacağı dört derece santigrat sıcaklıktaki solüsyonda saklayın. Saklama sonrası F-aktini kullanmadan önce, tüm aktinin çözündüğünden ve solüsyonda homojen olarak dağıldığından emin olmak için tüpü birkaç kez yavaşça ters çevirin veya hafifçe vurun.Metin protokolünde açıklandığı şekilde, ilgilenilen proteinin F-aktine bağlanmasını sağlayın. F-aktin bağlanması gerçekleştikten sonra, test edilecek son konsantrasyonun iki katı konsantrasyonda yedi ila sekiz örnek içeren bir konsantrasyon serisi oluşturmak için proteini seri olarak dilüe edin. Örneğin, test edilecek aralık 0,1 ile sekiz mikromolar arasındaysa, mikrofüj tüplerinde 1X reaksiyon tamponu içinde 16, sekiz, dört, iki, bir, 0,5 ve 0,2 mikromolar protein dilüsyonları hazırlayın.İlgili proteini, ultrasantrifüj tüplerinde 1X reaksiyon tamponu ile nihai konsantrasyona kadar seyreltin. Uygun örneklere F-aktin ekleyin. Ardından tüm örnekleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.30 dakika sonra, her örnekten beşte birini alarak örnek tamponu ile karıştırın. Bunlar toplam örneklerdir. Ultrasantrifüj örnek tüplerini rotora yerleştirin ve 4 °C'de, 100.000 ×g hızında 20 dakika boyunca santrifüjleyin.Santrifüjden sonra, her tüpteki süpernatantın dörtte üçünü alın ve ayrı bir mikrosantrifüj tüpünde 4X örnek tamponu ile karıştırın. Bunlar süpernatant örnekleridir. Kalan süpernatantı, peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek bir jel yükleme ucuyla alın.Ardından tüm tüplere 1X örnek tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında en az beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tüpteki pellet alanını sürekli yıkayarak örneği p200 pipet ucuyla sekiz ila on kez tritüre edin. Yeniden süspansiyon işlemini kolaylaştırmak için tritürasyon sırasında pipet ucunu pellet üzerinden nazikçe sürükleyin.Yeniden süspande edilen proteini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bunlar pellet örnekleridir. Son olarak, toplam ve pellet örnekleri SDS-PAGE ile analiz edin.Coomassie ile boyanmış jelleri, protein bant yoğunluklarını geniş ve lineer bir aralıkta ölçen bir görüntüleme sistemi kullanarak görüntüleyin. Artan konsantrasyonlardaki alfa e katenin homodimeri, 0.2 µM F-actin varlığında veya yokluğunda inkübe edildi. Örnekler santrifüjlendi ve elde edilen peletler analiz edildi.Beklendiği gibi, alfa e katenin homodimeri, arka planın üzerinde F-aktin ile birlikte çöktü. Negatif kontrol olarak BSA kullanıldı. Etkileşimin afinitesini hesaplamak için bağlanan protein miktarı belirlendi ve serbest proteine oranlanarak grafiğe döküldü.F-aktin önceden polimerize edilmişse, bu teknik dört saat veya daha kısa sürede tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, santrifüjasyon sonrası süpernatanın hızlıca uzaklaştırılması ve peletin tamamen yeniden süspanse edilmesi kritik öneme sahiptir. Tüm bağlanma deneylerinde olduğu gibi, F-aktine bağlanmanın doyurulmuş olması ve saflık artı F-aktin değerinin bir plato oluşturması kritiktir; bir plato olmadan doğru bir birliklenme denge sabiti hesaplamak mümkün değildir.Araştırmacıların farkında olması gereken, ko-sedimentasyon deneyiyle ilgili temel kısıtlamalar bulunmaktadır; bunlardan en önemlisi, bu yöntem gerçek bir denge sabiti üretmez ve sonuç olarak düşük afiniteli etkileşimleri yanlış hesaplayabilir veya tespit edemeyebilir. Bu kısıtlamalara rağmen, ko-sedimentasyon deneyi, bir proteinin F-aktine bağlanıp bağlanmadığını belirlemek ve etkileşimin afinitesini ölçmek için erişilebilir ve etkili bir araçtır.

measuring-protein-binding-to-f-actin-by-co-sedimentation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Proteinler, farklı aktin bağlayıcı modüller aracılığıyla ipliksi aktin (F-aktin) bağlanır. Bu video in vitro testinin rutin olarak, F-aktin bağlayan proteinler ya da belirli etki analiz etmek için kullanılan bir co-sedimantasyon, aktin prosedürü göstermektedir.

Aktin Co-Sedimantasyon Testi; F-Aktin Bağlayıcı Protein Analizi

Biz geçerlidir etiket kinetik karakterizasyonu ile papain birkaç sistatin B mutantlar bağlayıcı yapı-işlev analizi için ücretsiz Biacore X100 kullanarak protein etkileşim analizi. Kalibrasyon konsantrasyon analizi (CFCA) standart eğri gerek kalmadan muhafaza bağlayıcı aktivite ile protein konsantrasyonu ölçer. Biz CFCA kinetik analiz güvenilirliğini artırır ve bu kinetik sabitler güvenilir bir rekombinant proteinin aktivitesi azalır bile tespit edilebilir kullanarak bu onay konsantrasyonlarının...

Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

Bu videoda, florofor etiketli Shwachman-elmas sendromu (SBDS) proteini ile uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimleri incelemek için floresan anizotropi tekniğini açıklıyoruz. SBDS proteinlerinin kademeli olarak artan EFL1 konsantrasyonları ile inkübe edilmesinde, iki protein arasında başarılı bir etkileşime işaret eden anizotropide sabit bir artış gözlenir.

Protein-Protein Etkileşimlerinin Floresan Anizotropi Tabanlı Tespiti

FtsZ'nin polimerizasyonu bakteri hücre bölünmesi için gereklidir. Bu raporda, FtsZ polimerizasyon aktivitesini izlemek ve tampon bileşiminin etkisini tartışmak için basit protokolleri detaylandırıyoruz. Protokoller, FtsZ'nin FtsZ polimerizasyonunu etkileyen düzenleyici proteinler veya antibakteriyel ilaçlarla etkileşimini incelemek için kullanılabilir.

FtsZ Polimerizasyon Tahliller: Basit Protokoller ve Düşünceler

Bu protokol, Rac1 dahil olmak üzere Rho ailesi GTPazları için bağlayıcı ortakların göreli afinitelerini karşılaştırır. İn vivo, Rac1 bağlayıcı proteinler, konformasyonu bağlı bir nükleotid tarafından belirlenen tek bir bağlanma arayüzü için rekabet eder. Nükleotid, yüksek hidroliz hızı nedeniyle hem önemlidir hem de deneysel olarak kontrol edilmesi zordur.

Rekabet tahlilleri kullanılarak GTPaz bağlayıcı proteinlerin afinitesini

Protein etkileşimleri bir hücrenin işlevi merkezinde yer alıyor. Kalorimetre ve spektroskopik teknikleri yaygın onları karakterize etmek için kullanılır. Burada Shwachman-Diamond Sendromu (SBD'ler) mutasyona uğramış protein ve Uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimi incelemek için bir araç olarak floresan anizotropi açıklar.

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Membran protein saflaştırma ve peptidiskler içine reconstitution birleştiren bir yöntem tek bir kromatografik adımda salıyoruz. Biyotinylated iskeleler biyolayer interferometri ile protein-ligand etkileşimlerinin doğrudan yüzey eki ve ölçümü için kullanılır.

PeptiQuick, Aerodinamik Protein Bağlayıcı Tahliller için Biyotinylated Peptidiskler içine Membran Proteinlerin Bir Adım Dahil

Bu protokol, floresan mikroskobu kullanılarak yeniden oluşturulmuş, membrana bağlı sitoiskelet ağlarının dinamiklerini incelemek için desteklenen lipid çift katmanlarının oluşumunu ve hücre iskeleti filamentlerinin ve motor proteinlerin eklenmesini açıklar.

Membrana Bağlı Minimal Aktin Kortekslerinin Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Üzerinde Yeniden Sulandırılması

Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen protein bileşenlerini kullanarak boncukların yüzeylerinde aktin kuyruklu yıldızlarının nasıl üretileceğini açıklamaktadır. Bu tür sistemler, hücrelerde bulunan çıkıntılı yapıları taklit eder ve kuvvet üretiminin fizyolojik mekanizmalarını basitleştirilmiş bir şekilde incelemek için kullanılabilir.

Aktin bazlı hareketliliğin ticari olarak temin edilebilen proteinlerle yeniden yapılandırılması

Bu yöntem, glukan fosfataz ve amilopektinin bağlanma afinitesini ölçmek için lektin bazlı in vitro sedimantasyon testini tanımlar. Bu ko-sedimantasyon testi, glukan fosfataz substrat bağlanmasını ölçmek için güvenilirdir ve çeşitli çözünür glukan substratlarına uygulanabilir.

Glukan Fosfatazların Substrat Bağlanmasını Ölçmek için Konkanavalin A Bazlı Sedimantasyon Testi

Doğası gereği düzensiz birçok proteinin, çok sayıda hücresel süreç için önemli bir davranış olan oldukça dinamik biyomoleküler kondensatların oluşumuna katıldığı gösterilmiştir. Burada, canlı hücrelerdeki biyomoleküler kondensatlarda proteinlerin birbirleriyle etkileşime girdiği dinamikleri ölçmek için tek moleküllü görüntüleme tabanlı bir yöntem sunuyoruz.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Öğrenin, F-aktin ile ko-çöktürme yöntemiyle protein bağlanmasını ve bağlanma afinitesini ölçmeyi. Bu teknik, hücre biyolojisi ve biyokimya araştırmalarında protein etkileşimlerini incelemek için kullanılır.

Ko-çöktürme yoluyla F-aktine Bağlı Proteinin Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet