Kas Dokular doğrudan sıvı azot içine girdikleri zaman Artifacts Donma bir çoklu-delikli dondurarak saklamaya uygun vialler ortadan kaldırır

Bu prosedürün genel amacı, dondurma artefaktlarını ortadan kaldırarak kas dokularını doğrudan sıvı azota daldırarak dondurmaktır. Laboratuvarımdan bir öğrenci olan Maozhang He, bu prosedürü Yizhong Huang ile birlikte gösterecektir. Başlamak için, her bir kriyojenik tüpe numune kimliğini etiketleyin.

Ardından, şu ekipmanları hazırlayın: bir sıvı azot tankı, koruyucu gözlük veya yüz siperliği, dondurucu eldivenleri, 10 santimetrelik pens ve 25 santimetrelik cımbız. Ayrıca, bir strafor soğutucu, plastik film, bir neşter ve A4 PVC ciltleme kapakları hazırlayın. Kas örneklerini hazırlamak için, soğutucuyu sıvı azotla doldurarak başlayın.

Numune alındıktan sonraki beş dakika içinde, örneği nazikçe bir A4 PVC cilt kapağının üzerine yerleştirin ve kas liflerinin yönünü gözlemleyin. Ardından, bir bistüri kullanarak kas lifleri yönünde, yaklaşık 3 santimetre uzunluğunda ve 0,6 santimetre aralıklarla numune üzerinden iki paralel kesi yapın. Kesilen kası yaklaşık 0,6 santimetre genişliğinde, 0,6 santimetre yüksekliğinde ve 1,5 santimetre uzunluğunda bir dikdörtgen şeklinde kesin.

Ardından, on santimetrelik bir pens kullanarak, kesilen kasın boylamasına ekseni filmin uzun kenarına paralel olacak şekilde örneği nazikçe bir plastik film parçasının üzerine yerleştirin. Kas dokusunu, etiketlenmiş bir kriyojenik tüpün alt orta kısmına, giriş deliklerinin tam arasına yerleştirin ve tüpün kapağını sıkıca kapatın. Doku örneğini dondurmak için, önceden soğutulmuş strafor soğutucudaki sıvı azota tüm kriyojenik tüpü hızlıca batırmak için 25 santimetrelik cımbız kullanın ve sıvı azot artık kaynayana kadar bekleyin.

Sıvı azot, kriyotüpün tamamını daldıracak miktarda olmalı ve kriyotüp tamamen sıvı seviyesinin altında kalmalıdır. Kas örneklerini uzun süreli saklama için bir sıvı azot depolama tankına veya -80 °C dondurucuya aktarın. Dondurulmuş kasların oda sıcaklığındaki kaplar veya aletlerle kazara temas etmemesi önemlidir.

Slaytları hazırlamak için, bir kriyostatı 20 °C ile 22 °C arasına ön soğutun. Eski mikrotom bıçağını çıkarıp atın; kriyostattaki bıçak tutucuyu ve anti-roll plakasını silin. Ardından, kriyostata yeni bir mikrotom bıçağı takın ve kesim kalınlığını 8 µm olarak ayarlayın.

Kas örneğinin bulunduğu kriyojenik tüpü sıvı azot depolama tankından veya -80 °C dondurucudan çıkarın ve sıvı azota veya kuru buza yerleştirin. Ardından örneği kriyostata aktarın ve örneğin kriyostat sıcaklığıyla dengelenmesi için 30 dakika bekleyin. Örneği gömmek için OCT kullandıktan sonra, örneği numune tutucuya monte edin.

Ardından, sekiz mikrometrelik kesitler alın. Kesitleri oda sıcaklığındaki bir mikro lamın merkezine doğru yerleştirin. Lamı derhal bir lam kutusuna koyun.

Ardından, lam kutusunu -80 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin. Lamın oda sıcaklığında kurumasına izin vermeyin. Burada görüldüğü gibi, domuzlardan alınan longissimus dorsi kası örneği doğrudan -80 °C'lik bir dondurucuya yerleştirildiğinde buz kristalleri oluşmuş ve kas kriyoseksiyonunda iyi bilinen "İsviçre peyniri etkisi"ne yol açmıştır.

Kas dokusu doğrudan sıvı azota daldırıldığında da buz kristalleri oluşmuştur. Başka bir yöntemle, doku uygun yönlendirmeyle OCT gömme ortamına daldırılıp ardından hızla izopentan bulamacında dondurulduğunda, miyofiberlerin sitoplazmik kompartmanında çok sayıda iğne benzeri buz kristali oluşmuştur. Dokunun çok delikli kriyotüpe dondurulması, belirgin bir sitoplazmik kompartman ve miyofiberlerin çevre dokuya sıkıca bitişik olduğu, mükemmel numune bütünlüğü sağlar.

Bu yöntem kullanılarak, hızlı kasılan ve yavaş kasılan kas liflerinde ATPase aktivitesi analiz edilmiştir. Eşdeğer süreler verildiğinde, hızlı kasılan lifler iki derece ile açık renkli, yavaş kasılan lifler ise siyah görünür. Burada gösterilen standart dondurma yönteminde, kas dokusu OCT montaj medyumu ile doğrudan temas etmeden izopentan bulamacı içine daldırılmıştır; ancak izopentanın katı-sıvı bulamaç halini bir saatten fazla korumak zordur ve izopentan her zaman mevcut olmayabilir.