Macaques Karaciğer ve Mezenterik lenf nodu Seri Koleksiyonu için Laparoskopik Tekniği

Bu minimal invaziv laparoskopik prosedürün genel amacı, hayvan refahını iyileştirirken mezenterik lenf nodlarının ve karaciğer biyopsilerinin birden fazla zaman noktasında toplanmasıyla GI yolundan mikrobiyal translokasyonun etkilerinin değerlendirilmesini iyileştirmektir. Bu yöntem, HIV biyolojisi alanında, mezenterik lenf nodları ve karaciğer üzerindeki enfeksiyon ve mikrobiyal translokasyonun immünolojik sonuçları ve bu dokuların patolojisi hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bir çalışmada hayvana veya değerlendirilmekte olan parametrelere minimum etki ile birden fazla zaman noktasında numune alınmasına izin vermesidir.

Bu yöntem, HIV hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için kritik öneme sahip örnekler sağlayabilir. GI inflamasyonu ve mikrobiyal translokasyonun önemli olduğu diğer modellere de uygulanabilir. İşlemi Washington Ulusal Primat Araştırma Merkezi'nde veteriner hekimler olan Dr. Jeremy Smedley ve Dr. Cassie Moats yapacak.

Metin protokolünde belirtildiği gibi ameliyat için bir makak hazırladıktan sonra, steril bir fenestre örtü ile örtün. Ardından, steril bir kamera örtüsü kullanarak dijital kamerayı sıkıca kapatın ve kuleye takın. Rijit dürbünü kamera kafasına bağlayın.

Ardından sert dürbüne steril bir ışık kablosu takın ve ışık kaynağına bağlayın. Son olarak, insüflatöre steril bir insüflasyon tüpü monte edin. Laparoskopiye başlamak için, göbek deliğinin yaklaşık bir ila iki santimetre soluna 15 neşterlik bir bıçak yerleştirin ve karın kaslarına ulaşan deride yaklaşık 5 milimetrelik bir bıçak kesisi yapın.

Baskın olmayan el ile, kesiğin kraniyal tarafındaki karın duvarını yukarı kaldırın. Daha sonra diğer elinizi kullanarak, insizyondan hayvanın kafasına doğru açılı bir varus iğnesinin ucunu sokun. Varus iğnesini şaftından tutun ve karın duvarından geçene ve karın boşluğunda iğneye karşı direnç azalana kadar sıkıca itin.

Daha sonra CO2 insüflatörünün tüpünü iğneye takın ve gazı karın boşluğuna bırakmak için vanayı açın. 10 ila 12 milimetre cıva basıncına ulaşarak bir pnömoperitoneum oluşturun. Artık karın tamamen şişirildiğine göre, 15 neşter bıçağını sol kraniyal karın üzerine, son kaburgaya yaklaşık iki ila dört santimetre kaudal olacak şekilde yerleştirin ve yaklaşık beş ila yedi milimetrelik bir cilt kesisi yapın.

Ardından, kesimden beş milimetrelik bir trokar kanül düzeneğini yerleştirin. Düzeneği bir ila iki santimetre derinliğe getirin ve yaklaşık 45 ila 60 derece kaudodial olarak yönlendirin. Daha sonra dönme hareketiyle, kanülü karın içine vidalamak için 1,5 ila üç santimetre derinliğe ulaşarak kanülü ileri kaydırın.

Daha sonra trokarı çıkarın. İnsüflatör tüpünü varus iğnesinden ayırın ve ardından vanayı kapatın. Tüpü kanüle bağlayın ve pnömoperitoneumu korumak için vanayı açın.

Basıncın başarılı bir şekilde korunduğu doğrulandıktan sonra varus iğnesini çıkarın. Daha sonra, kanül aracılığıyla, sert kapsamı karın boşluğuna yerleştirin. Kamera kontrolünde, varus iğnesinin çıkarılmasından sonra kalan cilt kesisini derinleştirin, karın kaslarını ve karın zarını kesin.

Son olarak, hayvanı ayakları başın yaklaşık 15 ila 30 derece üzerinde olacak şekilde konumlandırın. Mezenterik lenf düğümünden biyopsi almak için, hazırlanan insizyondan karın boşluğuna katı bir prob sokun. Probu omentum ve bağırsak arasına yerleştirin ve hafif bir süpürme benzeri hareketle, aşağıda gizlenmiş olan mezenteri görselleştirmek için bağırsağı omentumdan çıkarın.

Omentumu ameliyat alanından uzaklaştırmak için probu kaudal yönden kraniyal yöne hareket ettirmeye devam edin. Daha sonra probu kullanarak, inen kolonu karın duvarına doğru hareket ettirin. Kolon ve mezenterik damarlar boyunca yer alan mezenterik lenf düğümlerini bulmak için mezenteri prob ile inceleyin.

Lenf nodu tanımlandıktan sonra, karın boşluğundaki probu Maryland mandallı forseps ile değiştirin ve noda bitişik mezenteri tutun. Mezenteri insizyona doğru çekin ve dürbünü kanülden çıkarın. Ardından insüflatörü kapatın ve karın bölgesindeki gazı boşaltmak için kanül vanasını açık bırakın, bu da mezenter dışlanmasını kolaylaştıracaktır.

Ardından mezenteri kesiden çekin. Kesiden erişimi sağlamak için dıştaki mezenteri forseps ile kavrayın. Daha sıkı bir nodül veya daha gri bir alan olarak görünmesi gereken lenf düğümünü belirlemek için mezenteri palpe edin veya gözlemleyin.

Daha sonra, kavisli hemostatlar kullanarak, düğüme bitişik mezenterde üç ila beş milimetrelik bir açıklık açın ve dokuya herhangi bir eki kör bir şekilde inceleyin. Gerekirse, damar sistemini 4-0 emilmeyen monofilament sütür ile bağlayın ve neşter kullanarak lenf nodunu diseke edin. Ardından, biyopsiyi RPMI 1640 besiyerinde buz üzerine yerleştirin.

Son olarak, mezenteri serbest bırakın ve dokuyu karın boşluğuna geri çekmeyi sağlamak için karnı bir kez daha şişirin. Tablayı yatay konuma getirin. Karaciğer biyopsisi almak için, lenf nodu toplanması için kullanılan kesiden karın boşluğuna dişli bir kanül yerleştirin.

Daha sonra kanülü kullanarak, karaciğeri görselleştirmek için kraniyal karın boşluğuna doğru yönlendirilen sert dürbün içinde kaydırın. Kameranın kontrolü altında, daha önce karın boşluğunu şişirmek için kullanılan kanülden biyopsi forsepsleri yerleştirin. Forsepsleri, çeneleri dokuya bakacak şekilde belirlenen karaciğer lobu kenarının altına yerleştirin ve forsepsleri açarak kenarın çenelere düşmesine izin verin.

Konumlarını ayarladıktan sonra forsepsleri kapatın ve basıncı yaklaşık 20 ila 30 saniye koruyun. Daha sonra forsepsleri kanülden yavaşça çekerek numuneyi çıkarın. Biyopsiyi buz üzerine RPMI ortamında yerleştirin.

Son olarak, biyopsi bölgesinde kanama gözlenmediğinden emin olun ve kesileri kapatın. Burada mezenterik lenf nodundan elde edilen hücresel verimler ve iki sağlıklı dişi makaktan iki farklı zaman noktasında toplanan karaciğer biyopsileri sunulmaktadır. Beklendiği gibi, lenf nodu biyopsileri, karaciğer biyopsilerine kıyasla anlamlı derecede daha fazla sayıda izole hücre verdi.

Kaynak dokudan bağımsız olarak, izole edilen hücrelerin %85'inden fazlası yaşayabilirdi. Daha sonra izole edilen hücre örnekleri CD45+lökosit ve CD45+CD3+lenfosit popülasyonları için analiz edildi. Mezenterik lenf nodları, karaciğer kaynaklı hücrelere kıyasla daha fazla CD45 + lökosit ve CD3 + lenfosit frekansına sahipti.

İzole edilen popülasyonların ayrıntılı karakterizasyonu, mezenterik lenf nodlarının önemli ölçüde daha yüksek oranlarda CD3 + T hücreleri ve CD4 + T hücrelerinin yanı sıra yüksek sayıda CD8 + T hücresi içerdiğini gösterdi. Tersine, karaciğer CD14 + lökositlerde önemli ölçüde zenginleştirilmiştir. Her iki organ da benzer miktarda CD20 + B hücresi gösterdi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik 30 ila 40 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Hayvanlar tipik olarak anesteziden kurtulur, birkaç saat içinde aktif hale gelir ve yemek yer ve kesikler o kadar küçüktür ki kafes tarafını görmek zor olabilir. Bu prosedürü denerken, hayvanları başarıyı kolaylaştıracak bir vücut kondisyonunda tutmak önemlidir.

Önemli mezenter yağı, düğümleri gizlediği ve kızartılabilirliği ve kanamayı artırdığı için zorlu bir engel olabilir. Bu işlemi takiben flebotomi, periferik lenf nodu biyopsisi, üst ve alt GİS endoskopi ve rektal biyopsi gibi diğer yöntemler ile sistemik ve mukozal immün yanıtlar, mikropların ve epitel bariyerlerinin durumu ve viral yükler değerlendirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, laboratuvarımızdaki araştırmacıların, daha önce sadece nekropsi ile elde edilebilen makaklardan elde edilen dokularda uzunlamasına iltihaplanan mikrobiyal popülasyonları keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu tekniğin etkileri, HIV tedavisine kadar uzanır, çünkü mikrobiyal translokasyon, HIV patogenezini yönlendiren inflamasyonun önemli bir nedenidir. Bunu seri bir şekilde değerlendirmek, potansiyel hedefler sağlayabilir ve terapötik müdahalelerin değerlendirilmesine izin verebilir. Virüs bulaşmış herhangi bir makakla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Makak, herpes virüsü 1 dahil olmak üzere biyolojik tehlikeler için uygun eğitim, uygun kişisel koruyucu ekipman, ısırma ve tırmalama kitleri ve uygun tıbbi takip gibi önlemler alınmalıdır.