İki ve Üç boyutlu Embriyoid Oluşumu Fare Embriyonik Kök Hücreler Retinoik Asit kaynaklı sinir Farklılaşma analizi

Bu prosedürün genel amacı, fare embriyonik kök hücrelerinin nöral farklılaşmasının sırasıyla genlerin ve protein belirteçlerinin ekspresyonunu ve üretimini analiz etmektir. Bu yöntem, DPA'ların ham yaşına kadar nöral farklılaşmanın inhibisyonundan sorumlu mekanizmanın belirlenmesine yardımcı olabilir ve terapötik amaçlar için kök hücreleri nöronlara ayırmak için daha iyi protokollere yol açabilir. Bu tekniğin temel avantajı, optik mikroskopi de dahil olmak üzere emerin ve protein seviyelerinde nöral farklılaşma sürecinin izlenmesini kolaylaştırmasıdır.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımda araştırma görevlisi olan Dr.Junning Yang olacak. Embriyoid kök hücreleri %0.25 Tripsin-EDTA ile 37 santigrat derece, %5 karbondioksitte iki ila beş dakika hasat ederek embriyoid vücut oluşumuna başlayın. Ayırma hücrelerine% 15 FBS ile taze Iscove'un Modifiye Dulbecco's Medium'unu veya IMDM'yi ekleyin ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 160 x G'de santrifüjleyin. Daha sonra bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve 0.5 mikromolar retinoik asit ile IMDM'de mililitre süspansiyonu başına beş x 10 ila beşinci hücre hazırlayın. Ardından, 100 milimetre petri kabı başına 120 mikrolitrelik damlalar koymak için sekiz kanallı bir pipet ve 200 mikrolitrelik uçlar kullanın.

Asılı damlaların kurumasını önlemek için tabağı ters çevirin ve ters çevrilmiş kapağı PBS ile doldurun. Üç ila dört gün boyunca 37 santigrat derece,% 5 karbondioksitte kültür. Üç gün boyunca yetiştirilen asılı damla embriyoid cisimlerini hasat etmek için 200 mikrolitrelik pipet uçları kullanın.

Bir pipet ucuyla bir embriyoid gövdeye dokunun ve 24 oyuklu bir plakada fibernektin kaplı bir kapak fişine aktarın. Kültürlerdeki ortamı her iki ila üç günde bir değiştirin. Ortamı değiştirirken, gerektiği gibi protein salgı analizi için kullanılan ortamı toplayın.

Ortamda salgılanan proteinleri tespit etmek için, 500 mikrolitre embriyoid vücut ortamını 10 kilodalton kesme santrifüj filtreye aktarın ve dört santigrat derecede 20.000 x G'de döndürün. Aşırı zenginleşmeyi önlemek için santrifüj filtrelerin içinde kalan ortamı her 15 ila 20 dakikada bir inceleyin. Kalan ortamın hacmi 25 mikrolitreye düştüğünde santrifüjlemeyi durdurun.

Filtreyi ters çevirin ve dört santigrat derecede 160 x G'de döndürün, ardından üreticinin talimatlarını izleyerek kalan konsantre ortamı toplayın. 3D bir kültür için, daha önce olduğu gibi 200 mikrolitrelik pipet uçları ile asılı damlalar olarak dört gün boyunca büyütülen embriyoid cisimleri hasat edin. 30 embriyoid cismi 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın, daha sonra uygun hacimlerde kollajen solüsyonu ve 5X DMEM'i seyrelterek, nötralizasyon solüsyonunu ekleyerek ve hemen iyice karıştırarak kollajen jel solüsyonu hazırlayın.

Kollajen jeli buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, embriyoid cisimciklerini içeren tüpe uygun hacimde soğutulmuş kollajen çözeltisi pipetleyin ve ardından embriyoid cisim süspansiyonunu kabarcıklar oluşturmadan altı oyuklu bir plakanın kuyucuklarına nazikçe pipetleyin. Kollajen polimerizasyonunu başlatmak için plakayı hemen 60 dakika boyunca 37 santigrat dereceye, %5 karbondioksite aktarın.

60 dakika sonra, embriyoid cisimciklerini içeren plakayı IMDM ile kaplayın. Embriyoid cisim ayrışması için, dört günlük asılı damla embriyoid cisimciklerini 200 mikrolitrelik pipet uçları ile tekrar toplayın. Bu kez, onları dört gün daha% 15 FBS ve 37 santigrat derece,% 5 karbondioksitte kültür içeren IMDM içeren yapışkan olmayan bir bakteriyolojik petri kabına aktarın.

Dibe yapışmadıklarından emin olmak için embriyoid cisimlerini günde iki kez kontrol edin. Embriyoid vücut yapışmasını önlemek için tabağı hafifçe sallayın. Dört gün sonra, embriyoid cisimciklerini bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 185 x G'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemenin ardından süpernatanı çıkarın. Palet hacmi 100 mikrolitreyi geçmemelidir. Daha sonra, PBS'de% 20 FBS ile desteklenmiş% 0.25'lik bir mililitre% tip I kollajenaz pipetini embriyoid cisimciklerinin tüpüne pipetleyin.

Karışımı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir saat inkübe edin. Her 20 dakikada bir bir mililitrelik pipet ucu kullanarak süspansiyonu nazikçe pipetleyin. İnkübasyondan sonra, hücreleri PBS ile üç kez nazikçe yıkayın.

Hücre agregaları varsa, bunları çıkarmak için 100 mikron gözenekli bir hücre süzgeci kullanın. Hücreleri IMDM'de jelatin kaplı örtü kızakları üzerine yerleştirin, ardından 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. 2D veya ayrışmış 3D embriyoid cisimciklerini PBS ile yıkayın.

Daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yüzde dört paraformaldehit ve PBS ile sabitleyin. Yüzen hücre kalıntılarını gidermek için sabit hücreleri PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika geçirgen hale getirmek için PBS'ye% 1 triton X-100 ekleyin. Daha önce olduğu gibi yıkadıktan sonra, son yıkamayı çıkarın ve 30 dakika boyunca PBS'de% 5 BSA ile bloke edin.

İnkübasyonun sonuna doğru,% 0.03 triton X-100 ile desteklenmiş PBS'de% 1 BSA'da bir birincil antikor dilüsyonu hazırlayın. 30 dakika geçtiğinde, bloke edici çözeltiyi birincil antikor çözeltisi ile değiştirin. Oda sıcaklığında üç saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Yıkadıktan sonra, PBS'de ikincil bir antikor uygulayın ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Son olarak, optik mikroskopi için solmaya karşı korumalı bir ortamla cam kızakların üzerine kapak kızaklarını monte edin. Bu görüntü, GTPase RhoA'yı aktive eden bir guanin değişim faktörünü kodlayan Syx geninin iki kopyası için pozitif, ESC'lerden üretilen bir embriyoid cisimden filiz çıkışını göstermektedir.

Görüntü, 3D kültürde altı gün sonra çekildi. Syx KnockOut ESC'lerden oluşan bu embriyoid cisim, kültürde aynı zamandan sonra artan filizlenme gösterir. Burada, 2D embriyoid vücut kenarlarının faz görüntüleri, hücrelerin Syx KnockOuts'tan Syx vahşi tipinden daha hızlı genişlediğini göstermektedir.

Bu immünofloresan görüntüleri, kırmızı ile gösterilen nöral farklılaşma belirteci Nestin'in, altı günlük 2D6 KnockOut embriyoid cisimlerinden genişleyen hücrelerde, Syx vahşi tip muadillerine göre daha bol olduğunu göstermektedir. Burada, immünofloresan görüntüleri, nöral farklılaşma belirteçleri Nestin ve beta III Tubulin'in, 13 günlük 3D6 KnockOut embriyoid cisimlerinden ayrılan hücrelerde, Syx vahşi tip muadillerine göre daha bol olduğunu göstermektedir. Bu, embriyoid vücut büyümesi ve farklılaşma süresi nedeniyle zaman alıcı bir işlemdir.

Sadece en az sekiz gün gerektirmekle kalmıyor, bazı durumlarda 24 güne kadar farklılaşmayı takip ediyoruz. Bu prosedürü denerken, embriyoid cisimcikleri boyunca benzer farklılaşma oranlarını sağlamak için embriyoid vücut çapının canlılığını sınırlamayı unutmamak önemlidir.