Name: Tavuk İşitsel Beyinsapındaki Ovo Elektroporasyonunda (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Öğrenin, tavuk işitsel beyinsapında gen ifadesini in ovo elektroporasyonla uzamsal ve zamansal olarak nasıl kontrol edeceğinizi. Bu yöntem, işitsel nöron gelişimini ve patofizyolojik olayları incelemek için etkili bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Drs&#39;a teşekkür etmek isteriz. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria ve Bayan Ximena Optiz-Araya, protokol kurulumu ile ilk yardım için ve plazmid sağlamak için. Bu çalışma NIH / NIDCD hibe DC013841 (JTS) tarafından desteklenmiştir.

Tüm prosedürler Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmış ve Ulusal Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Sağlık Rehberleri Ulusal Enstitüleri uyarınca gerçekleştirilmiştir. 1. Yumurta Taşıma <ol><li> Gübrelenmiş yumurtaları yerel bir satıcıdan satın alın. Kuluçka öncesi en fazla 5 gün boyunca yumurtaları 13 ° C&#39;de bir buzdolabında saklayın. Embriyo canlılığı, 1 hafta sonra belirgin şekilde azalır. </li><li> Kuluçka makinesi koymadan önce her yumurta% 70 etanol ile sürün. </li><li> Yaklaşık% 50 nemde sıcaklık 38 ° C&#39;ye ayarlanmış bir inkübatörde 1-2 düzine yumurta koyun. Bu, sırasıyla, elektroporasyon ve uygun canlılık için uygun embriyo konumlandırma sağlar. NOT: 48-52 saat kuluçkadan sonra, yumurtalar ~ 12-13 Hamburger-Hamilton (HH) evresinde olacak ve elektroporasyon için hazır olacaktır. </li></ol> 2. Hazırlık <ol><li> Mi plazmasıxing <ol><li> Her 7 mcL DNA karışımı için 1 μL% 0.1 hızlı yeşil (18 MΩ deiyonize ve damıtılmış H2O [ddH2O] içinde% 0.1) ilave edin. </li><li> Birden çok plazmitin birlikte elektroporasyonu için plazmidleri 1: 1 oranında karıştırın. Nihai DNA konsantrasyonu 5-8 μg / μL olmalıdır. </li></ol></li><li> Dolgu Enjeksiyonlu Pipet <ol><li> Bir mikropipet çekicide pipetleri çekin. Bir 28G şırınga iğnesi kullanarak 1-2 mcL plazmid pipet doldurun. </li><li> Forsep kullanarak pipet ucunu 10 - 20 μm&#39;ye kadar kesin. Kırılmış pipet ucunun boyutunu belirlemenize yardımcı olması için bir mikroskop kullanın. Pikspiritör pipet tutucusuna pipet takın. </li></ol></li></ol> 3. Pencereleme NOT: Pencereleme prosedürü 13&#39;ten önce yayınlanmıştır. Ek görsel bilgi için lütfen referans 13&#39;e bakınız. <ol><li> Tüm malzemeleri ve çalışma alanını% 70etanol. </li><li> Kuluçka makinesinden istenilen sayıda yumurta alın (6-10 arası), oda sıcaklığında bırakın ve ayrı ayrı% 70 etanol içeren yumurtaları sürün. Kuluçka makinesinin çıkartılmasından sonra yumurtalar en az 2 saat süreyle canlı kalır. </li><li> Embriyo konumlandırmayı tanımlamak için yumurtayı hafif bir aydınlatıcının üzerine yerleştirin. Karanlık bölgenin merkezini ( yani embriyo) bir kurşun kalemle daire haline getirin. </li><li> Bir 19G iğne kullanarak, yumurtanın künt ucundaki bir delik açın. </li><li> Yumurtanın sivri tarafındaki çizilmiş çemberin yakınındaki bir başka delik açın. 19G iğne ile dış yumurta kabı (yaklaşık 16 mm 2 ) küçük bir parça çıkarın ve sonra forseps ile iç yumurta kabuğunun (yaklaşık 8 mm 2 ) küçük bir parça çıkarın. </li><li> 19G&#39;lik bir iğne takılmış 3 mL şırınga ile yumurtadan künt uç deliğinden 1.5-2.5 mL albümini geri çekin. İğneyi 45 ° açıyla aşağıya açtığınızdan emin olun. </li><li> Kör uç deliğini küçük bir bant parçası (1 cm x 1 cm) ile örtün. Çizilen daireyi veD ikinci deliğin bantla (2.5 cm x 4 cm). </li><li> Kıvrımlı makas (kesme kenarı = 2.5 cm) ile, bir pencereyi daire içinde kesin. Makas yumurta kabuğuna paralel olmalıdır ve pencerenin çapı 2 cm&#39;den az olmalıdır. </li></ol> 4. Plasmid Enjeksiyonu <ol><li> Pikristin cihazını açın. Basıncı 18 psi ve süresi 5 μs olarak ayarlayın. Diseksiyon mikroskopu için hava tankını ve lambayı açın. </li><li> Steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde karışık bir mağaza satın Hint mürekkebi 1: 10 seyreltme 30 ml stok solüsyonu olun. 4 ° C&#39;de saklayın. Hint mürekkebinin enjeksiyonu, tavuk embriyonunun daha iyi görselleştirilmesi için önemli bir adımdır. <ol><li> Seyreltilmiş Hint mürekkebi çözeltisi ile 1 mL şırınga doldurun. 27G&#39;lik bir iğne takın ve şırıngadaki mevcut kabarcığı dışarı atın. </li><li> Embriyonun 2-3 mm kadar solüsyonunu hemen sarısı membranın altına yerleştirin ve ~ 0.2 mL Hint mürekkebi yavaşça embriyo altına enjekte edin. YapEmbriyonun sağkalımını azaltabileceğinden, Hint mürekkebinin 0.5 mL&#39;den daha fazla enjekte edilmemelidir. </li></ol></li><li> Pencere yumurta diseksiyon mikroskopu altında bir yumurta tutucu yerleştirin. Plazmid enjeksiyon bölgesinin en iyi görselleştirilmesi için en yüksek büyütmeyi kullanın. </li><li> Forseps kullanarak membranı enjeksiyon bölgesi üzerinden çıkarın. Dikkat çekici işitsel beyin sapı bölgeleri ( ör . NM ve NL) Rhombomeres 5 ve 6&#39;dan (R5 / R6) ortaya çıkar. R5 / R6, R5 / R6 plasmid enjeksiyonları için yer işaretleri olarak görev yapan otokistlere (omurgalılarda embriyonik yapı, iç kulağa doğru gelişir) bitişik olarak bulunur. </li><li> DNA dolgulu pipeti, R5 / R6 bölgesini örten sinir tüpüne ve mikromanipülatörü kullanarak otokistler arasına indirin. Şekil 1A&#39;da ideal yerleşim şeması gösterilmektedir. </li><li> Sinir tüpünde DNA çıkarmak için pikspritzerden hava basıncı (18 psi, 5 μs süre) uygulayın. </li></ol> 5. Elektroporasyon <ol><li> Aç şunuO akım / voltaj uyarıcısı. </li><li> PBS ile 3 mL enjektör doldurun ve şırınga filtresini takın. Embriyo üzerine 1-2 damla PBS ekleyin. </li><li> Enjeksiyon yerinin üstünde negatif elektrot (medial) ve R5 / R6&#39;ya ( Şekil 1A ) yan tarafta bulunan pozitif elektrot ile mikromanipülatörü kullanarak bipolar elektrodu embriyoya indirin. Embriyo ile doğrudan temastan kaçının. Elektrot malzemesinin platinyum iridyum olduğu yerde iki kutuplu elektrot kullanın. İpuçları arasındaki boşluğu forseps ile 0,5 mm&#39;ye ayarlayın. </li><li> Bir akım / voltaj uyarıcısı kullanarak, 1 sn aralıklarla 1 ms için 50 V&#39;de 20 kez darbe uygulayın. </li><li> Elektroporasyondan sonra, maruz kalan alanın üzerine bir damla PBS ekleyin. Nazikçe elektrodu çıkarın ve bir laboratuvar dokusu ve% 70 etanol ile temizleyin. Bez ile embriyo ortaya pencere kapatın. </li><li> Enjekte edilen plasmid tipi ve kuluçka tarihi ile yumurta kabuğunu etiketleyin. </li><li> Pencereyi yukarı gelecek şekilde yumurtaları kuluçka makinesine yerleştirin. 38 ° C&#39;de 50 ° C&#39;de inkübe edinİstenen gelişim aşamasına gelene kadar nem%. </li><li> Bir tet-on vektörü, gen ekspresyonunun zamansal kontrolü için elektroporasyona tabi tutulursa, gen ekspresyonunu başlatmak için 24 saatte bir Doxycycline (Dox) uygulayın (bkz. Bölüm 6). </li></ol> 6. Gen İfadesinin Zamansal Kontrolü için Tet-On Sistemi <ol><li> Aşağıdaki plazmidleri kullanın: PCAGGS-T2TP: bir transposaz ifade eden plasmid. PT2K-CAGGS-rtTA-M2: Dox bağlayıcı proteini istikrarlı bir şekilde ifade eden bir plazmid. PT2K-BI-TRE-EGFP: EGFP raportörünün ve ilgili ikinci bir genin çift yönlü tet-on promotörünü (TRE) tetikleyen ekspresyonunu içeren bir plazmid. NOT: Yukarıdaki üç plasmidin 1: 1: 1 oranla birlikte elektroporasyona tabi tutulması gerekir. </li><li> Stok çözeltisi hazırlama: <ol><li> 1 mg / mL stok çözeltisi üretmek için Dox steril PBS&#39;de eritilir. -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Dox uygulaması: <ol><li> Ekspiroyu teşvik etmekBelirli gelişim evreleri boyunca ilgilenilen genin n&#39;si Dox&#39;u 24 saatte bir uygulayın. </li><li> Dox uygularken, yumurtayı çıkarın, pencereyi açın, 50 uL Dox&#39;u koryoarotomatik zara pipetleyin, pencereyi kapatın ve kuluçka makinesine yumurtayı geri koyun. </li></ol></li></ol> 7. Beyin Fırtınası Dilimleri İçin Diseksiyon Alanının Hazırlanması NOT: Aşağıdaki bölümler (7 - 9) ve prosedürler 14&#39;den önce yayınlanmıştır. Ek görsel bilgi için lütfen bu referanslara bakın. <ol><li> Bir agar solüsyonu hazırlayın (40 mg / mL agaroz, yani % 4 ddH20). Agar solüsyonunu bir Petri kabına dökün ve oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin. Dokunun beyin sapı dilimlemesi sırasında gelecekte kullanılmak üzere kapalı agar plakasını buzdolabında saklayın. </li><li> Yapay serebral omurga sıvısı (ACSF)% 95 O 2 ve% 5 CO 2 (pH 7.2-7.4 ve ozmolarite: 295-310 mOsm / L) sürekli kabarcıklar.</li><li> Çalışma alanını ve vibratomu% 70 EtOH ile temizleyin ve bıçağı damıtılmış su ile durulayın. </li><li> Uygun diseksiyon aletleri ile çalışma alanına temiz bir sıvı emici ped koyun. </li><li> Agar plakasını buzdolabından alın, küçük bir agar küveti kesin (10 mm x 10 mm x 8 mm). Ticari olarak mevcut superglue kullanarak bir vibratome dilimleme odasının aşamasına agar blok Tutkal. </li></ol> 8. Tavuk İşitsel Beyin Fırtınasının İzolasyonu <ol><li> Yumurtayı bantlanmış pencere alanından açın. Membran kese bir neşter ile delin ve tavuk embriyo başını çıkarın. </li><li> Tavuğu keskin makasla kes. </li><li> Tıraş bıçağı ucunu gözlerin arkasından hafifçe yerleştirin. Kafatası ile kaudal orta çizgide kafatası yoluyla incise edin. Embriyonun yaşına bağlı olarak hafif basınç uygulayın. Eski embriyolar daha fazla baskı gerektirir. </li><li> Kafatasını ortaya çıkarmak ve orta hat kesimini doğrulamak için yavaşça cildi ve tüyleri itin. </li><li> UygulanıyorTrunk basıncında, kafatasının rostral bölümünü bir ustura bıçağı ile kes. Bıçağı hemen gözlerin arkasına yerleştirin ve tüm kafatası ve beyin dokusunu kesin. </li><li> Başın iki yanındaki boyun kaslarının biraz önündeki, kafatasının kaudal bölgesindeki makasla orta hattan insana insizyon yapın.Kafatasını ve fazla dokuyu çekerek beyin ve beyinciği açığa çıkarın. </li><li> Makasla beyin sapına yapışmış dokuyu kesin ve kafatasından rahatça ayıran beyin sapını çıkarın. </li></ol> 9. İnvivo Elektrofizyoloji veya Görüntüleme için Beyin Fırtınası Dilimlerinin Hazırlanması <ol><li> Beyin sapını optik tectadan geçirin. </li><li> Serebellumu, dördüncü ventrikülün zemini açığa vurarak, makaslarla pedankülleri keserek çıkarın. </li><li> Cımbız kullanarak, membranöz doku ve kan damarlarını beyin sapı yüzeyinden çıkarın. </li><li> Beyin kökeneğini engellemek için, dört katın en rostral ucunda yatay bir kesim yapınKortekste sadece kaudal olan ventrikül. Beyin sapını izole etmek için optik tecta lateral kesikler dikey yapın. </li><li> Agar bloğunun hemen önündeki vibratome sahnesine az miktarda süper tutkal yerleştirin. </li><li> Cımbız kullanarak omurgadaki beyin sapını kaldırın ve rostral yüzü aşağı bakan ve dorsal tarafı vibratome bıçağına doğru tutturun. Fazla tutkal bir laboratuvar dokusu veya filtre kağıdı ile çıkarın. </li><li> Vibrasyonlu sahneye oksijenli ACSF dökün. Vibrasyonlu bıçağı 20-22 ° açı ile ayarlayın. Maksimum genlik salınımında vibratome başlatın. Sahneyi bıçağa doğru yukarı hareket ettirin, böylece dokunun üst kısmı bıçakla paraleldir. </li><li> Bıçağı beyin sapı dokusuna doğru hızla hareket ettirin. Bıçağın doku ile temasından önce bıçağı yavaşça yavaşlatın. </li><li> Doku mümkün olan en yavaş ilerleme hızıyla kes. Bıçak tüm koronal doku bölümünden geçtikten sonra, bir transfer pipetini kullanarak dilimi hafifçe çıkarın. &lt;/ Li&gt; <li> Aşamayı 200-300 μm altına indirin ve tekrar dilimleyin. İşitsel çekirdeklerin anatomik işaretleri görünene kadar tekrarlayın; örneğin, NL&#39;nin belirgin dorsal / ventral nöropil bölgesi ve NM&#39;nin NL&#39;ye göre medial konumu. </li><li> ACFS&#39;de dilimleri dikkatlice muhafaza edin. Bu oda sıcaklığında (22 ° C) veya fizyolojik koşulların (~ 41 ° C) sıcak su banyosu kullanılarak yapılabilir. Dilimleme sırasına dikkat edin. İlk dilim en kaudal doku bölgesine karşılık gelir ve son dilim en rostral bölgeye karşılık gelir. Bu kabaca sırasıyla düşük frekanslı frekans bölgelerinden yüksek frekanslı kodlama bölgelerine yapılan işitsel beyin sapının tonotopik organizasyonunu temsil eder. </li></ol>

<ol><li>Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20664077">Mechanisms of sound localization in mammals.</a> Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).</li>
<li>Anderson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+timing+is+linked+to+speech+perception+in+noise%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural timing is linked to speech perception in noise.</a> J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).</li>
<li>Shannon, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speech+recognition+with+primarily+temporal+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Speech recognition with primarily temporal cues.</a> Science. 270 (5234), 303-304 (1995).</li>
<li>Carr, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+development+of+time+coding+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Evolution and development of time coding systems.</a> Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).</li>
<li>Carr, C. E., Soares, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+convergence+and+shared+computational+principles+in+the+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system.</a> Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).</li>
<li>Rubel, E. W., Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken%3A+tonotopic+organization+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).</li>
<li>Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken%3A+ontogeny+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).</li>
<li>Schecterson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li>
<li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).</li>
<li>Oertel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+of+timing+in+the+brain+stem+auditory+nuclei+of+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates.</a> Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).</li>
<li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).</li>
<li>Cramer, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. (8), e306(2007).</li>
<li>Sanchez, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+culture+of+chicken+auditory+brainstem+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Jhaveri, S., Morest, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+architecture+in+nucleus+magnocellularis+of+the+chicken+auditory+system+with+observations+on+nucleus+laminaris%3A+a+light+and+electron+microscope+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study.</a> Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).</li>
<li>Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+adeno-associated+virus+vector+efficiently+transduces+neurons+in+the+embryonic+and+post-embryonic+chicken+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain.</a> PLoS One. 7 (11), e48730(2012).</li>
<li>Koppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+nerve+terminals+in+the+cochlear+nucleus+magnocellularis%3A+differences+between+low+and+high+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies.</a> J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).</li>
<li>Hyson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+interaural+time+differences+in+the+chick+brain+stem%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">The analysis of interaural time differences in the chick brain stem.</a> Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).</li>
<li>Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+hearing+in+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of hearing in the chicken embryo.</a> J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).</li>
<li>Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+auditory+evoked+responses+in+the+cochlea+and+cochlear+nuclei+of+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick.</a> Brain Res. 63, 59-74 (1973).</li>
<li>Woolf, N. K., Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+auditory+function+in+the+cochlea+of+the+mongolian+gerbil%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil.</a> Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).</li>
<li>Walsh, E. J., McGee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+development+of+auditory+nerve+and+cochlear+nucleus+neuronal+responses+in+kittens%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens.</a> Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).</li>
<li>Uziel, A., Romand, R., Marot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cochlear+potentials+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Audiology%22%5BJournal%5D)">Development of cochlear potentials in rats.</a> Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Ovo elektroporasyonunda in vivo gen fonksiyonunu analiz etmek için ilgi genleri eksprese eden veya yere seren bir yöntem 8 , 9 . Tavuk embriyosunda plazmid kodlu genleri farklı işitsel beyin sapı bölgelerinde ifade etmek için yenilikçi bir yöntem 8 . Optimal ifade sağlamak için birkaç kritik adım gereklidir. İlk olarak, yalnızca otokistleri açıkça görülen embriyolar enjekte edin. Otokistler görünür değilse, embriyo elekt...

Sesin hızlı sinirsel kodlaması normal işitme işlevleri için gereklidir. Bunlar arasında ses lokalizasyon yetenekleri 1 , gürültü ayırımı 2&#39;deki konuşma ve davranışsal olarak diğer iletişim sinyallerinin anlaşılması 3 bulunur . Hem kuşların hem de memelilerin işitsel beyin sapında bulunan benzer nöronlar, hızlı sinirsel kodlama 4 için son derece uzmanlaşmıştır. Tavuk çekirdeği magnocellularis (NM), çekirdek laminaris (NL) ve bunların memeli analogları, anteroventral koklear çekirdek (AVCN) ve sırasıyla medial superior zeytin (MSO) 5 içerir . Bununla birlikte, hızlı sinirsel kodlamayı düzenleyen gelişim mekanizmaları, işitsel beyin sapında çok az anlaşılmıştır. Bu nedenle, hızlı inal kodlamadan sorumlu belirli genleri au&#39;da ifade, düzenleme ve işlevlerini daha iyi anlamak için incelemek avantajlıdırDitory gelişme. Gelişmekte olan tavuk embriyo, işitsel sistem gelişiminin temel biyolojik sorularını incelemek için etkili ve köklü bir araştırma aracıdır 6 , 7 . Son moleküler ilerlemeler, gelişmekte olan tavuk embriyosundaki bu biyolojik soruları , in vivo gen fonksiyonunu analiz etmek için ilgi genleri çürüterek veya çürüterek ele almıştır 8,9 . Spesifik genlerin düzenleyici rolünün araştırılması, işitsel açıklarla ilişkili patolojilerin anlaşılmasında önemli bir gelişmedir. Burada, plazmid kodlu genlerin, hızlı nöral ses kodlamasının gerçekleştiği tavuk işitme beyin sapı içine ovo elektroporasyonunda sunuyoruz. 5 ve 6 no.lu rhombomeres 11 , 12 ile birlikte görülen işitsel sinirsel progenitör bölgeleri hedef alarak (R5 /R6), biz NM ve NL plazmid transfeksiyon mekansal kontrol göstermektedir. Buna ek olarak, bir tet-on vektör sistemi benimseyerek ifadenin zamansal düzenlenişini gösteriyoruz. Bu, doksisiklinin (Dox) 8 varlığında ilgilenen genleri ifade eden bir uyuşturucu ile uyarılabilir prosedürdür.

<table><tbody><tr><td>Döllenmiş beyaz leghorn tavuk yumurtası</td><td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III, tek veya çift kanallı</td></tr><tr><td>Akım/gerilim stimülatörü</td><td>Çim Teknolojileri</td><td>SD9</td><td>SD9</td></tr><tr><td>Microfil şırınga iğneleri</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td>28 Ölçü, 67 mm Uzunluğunda, (5'li Paket)</td></tr><tr><td>Elektrot tutucu</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1280</td><td>MP Serisi: Elektriksel Olmayan Basınç Uygulamaları</td></tr><tr><td>Uyarıcı mikroelektrot</td><td>FHC</td><td>PBSA1075</td><td>PBSA1075</td></tr><tr><td>Hava tankı/regülatörü</td><td>NU Laboratuvar Hizmetleri</td><td></td><td>Hava kuruması 300 CF</td></tr><tr><td>Hızlı yeşil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>F7258-25G</td></tr><tr><td>Şeffaf plastik bant</td><td>Scotch</td><td>191</td><td></td></tr><tr><td>Doksisiklin hyclate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Yumurta buzdolabı</td><td>Vissani Şarap Buzdolabı</td><td></td><td>13.3 - 16.1 & C (56-61&derece; F)</td></tr> <tr><td>Kuluçka makinesi</td><td>Hova-Bator</td><td></td><td>38 & derece; C (100 &derece; F), ~%50 nem</td></tr><tr><td>Diseksiyon kapsamı</td><td>Zeiss</td><td>4.35E+15</td><td>SteREO Discovery, V8 Mikroskop, 50.4X</td></tr><tr><td>Soğuk ışık kaynağı</td><td>Zeiss</td><td>4.36E+15</td><td>CL6000 LED</td></tr><tr><td>Mikromanipülatörler</td><td>Narishige Japonya</td><td>Model: MM-3</td><td>2 Mikromanipülatör</td></tr><tr><td>Kılcal borular</td><td>Sutter Enstrümanı</td><td>BF150-86-10</td><td>Kalın duvarlı borosilikat (boyutlar)</td></tr><tr><td>Şırıngalar</td><td></td><td></td><td>1 mL, 3 mL</td></tr><tr><td>İğneler</td><td>BD Hassas Kayma&nbsp;</td><td></td><td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Çalma</td><td></td><td>No. 5 Süper İnce Dumont</td></tr><tr><td>Yumurta tutucu</td><td>Özel Yapım</td><td></td><td>Kil taban da çalışır</td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme</td><td>Sutter Alet Modeli</td><td></td><td>P-97</td></tr><tr><td>Şırınga filtresi</td><td>Ultra Cruz</td><td>sc-358811</td><td>PVDF 0.22 & mu; m</td></tr></tbody></table>

tavuk İşitsel beyinsapındaki ovo elektroporasyonunda

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Elektroporasyon, genleri tavuk embriyo gibi biyolojik açıdan önemli organizmalara tanıtan bir yöntemdir. Tavuk embriyonunun işitsel sistem gelişiminin temel biyolojik işlevlerini incelemek için etkili bir araştırma modeli olduğu uzun zamandır bilinmektedir. Daha yakın zamanlarda, tavuk embriyo, işitme ile ilişkili gen ekspresyonu, düzenlenmesi ve işlevinin incelenmesinde özellikle değerli hale geldi. Ovo elektroporasyonu, son derece uzmanlaşmış işitme işlevlerinden sorumlu işitsel beyin sapı bölgelerini hedeflemek için kullanılabilir. Bu bölgeler tavuk çekirdeği magnocellularis (NM) ve çekirdek laminaris (NL) içerir. NM ve NL nöronları rhombomerlerin 5 ve 6 (R5 / R6) &#39;nın belirgin öncüllerinden kaynaklanmaktadır. Burada, bu bölgelerdeki gen ile ilgili özellikleri incelemek için plasmidle kodlanmış genlerin ovo elektroporasyonunda sunuluyoruz. Fonksiyonel fenotipin kazanılmasını veya kaybedilmesini teşvik eden, gen ifadesinin mekânsal ve zamansal kontrolü için bir yöntem gösteriyoruzes. R5 / R6 ile ilişkili işitsel nöral progenitör bölgeleri hedefleyerek, NM ve NL&#39;de plazmid transfeksiyonunu gösteririz. Gen ekspresyonunun zamansal regülasyonu bir tet-on vektör sistemi benimseyerek başarılabilir. Bu, doksisiklinin (Dox) varlığında ilgilenilen genleri ifade eden bir uyuşturucu ile uyarılabilir prosedürdür. İn ovo elektroporasyon tekniği - ya biyokimyasal, farmakolojik ve / veya in vivo fonksiyonel testlerle - birlikte, işitsel nöron gelişimini ve buna bağlı patofizyolojik olayları incelemek için yenilikçi bir yaklaşım sağlar.

Ovo elektroporasyonunda normal olarak gelişen bir biyolojik sistemde gen ifadesine izin verdiğini burada gösteriyoruz. Plasmid ile kodlanmış genler, R5 / R6 üzerinde bulunan sinir tüpüne fokal olarak enjekte edilir. Önemli anatomik belirteçlere göre elektrod ve pipet yerleşimlerinin şematik bir örneği Şekil 1A&#39;da gösterilmiştir. Plazmid enjeksiyonunun doğru konumu, elektroporasyondan 24 saat sonra doğrulanır ve Şekil 1B&#39;de gösterilir. R5...

Kuş ve memelilerin işitsel beyin sapı nöronları, normal işitme işlevleri için temel bir süreç olan hızlı sinirsel kodlama için uzmanlaşmıştır. Bu nöronlar, embriyonik arka bedenin belirgin öncüllerinden kaynaklanmaktadır. İşitme gelişiminde gen işlevini incelemek için tavuk embriyolarının arka bacasında genleri ifade etmek için elektroporasyon teknikleri sunuyoruz.

Tavuk İşitsel Beyinsapındaki Ovo Elektroporasyonunda

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Bu prosedürün genel amacı, tavuk işitsel beyin sapında gen ekspresyonunu mekansal ve zamansal olarak kontrol etmektir. In ovo elektroporasyonun kullanımı, işitsel nöron gelişimini ve ilgili patofizyolojik fenomenleri incelemek için yenilikçi bir yaklaşım sunar. Bu prosedür, gen ekspresyonu kontrolünün, normal işitsel beyin sapı gelişimi için gerekli olan fenotip kazancını veya kaybını nasıl teşvik ettiği gibi, işitsel nöral gelişim alanındaki temel soruları yanıtlamanıza yardımcı olabilir.Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Doktor Ting Lu uygulamalı olarak gösterecek. Başlamak için, her 7 µL DNA karışımı için 1 µL Fast Green çözeltisi ekleyerek plazmit çözeltilerini hazırlayın. Ardından, birden fazla plazmitin eş zamanlı elektroporasyonu için DNA çözeltilerini bire bir oranda karıştırın.Plazmit çözeltisi hazırlandıktan sonra, bir mikropipet çekici ile pipetler imal edin. Ardından, pipeti bir ila iki µL plazmit çözeltisi ile doldurmak için 28 gauge bir şırınga iğnesi kullanın. Pens yardımıyla pipet ucunu 10 ila 20 mikron boyutunda kırın ve kırılan ucun boyutunu mikroskop altında belirleyin, ardından pipeti bir pipet tutucu aracılığıyla picospritzer'a bağlayın.Prosedürden önce, yerel bir satıcıdan satın alınan yumurtaları 13 °C'deki bir buzdolabında beş günden fazla saklamayın. Başlangıç olarak, yumurtayı %70 etanol ile dezenfekte edin; ardından uygun embriyo konumlandırmasını sağlamak ve optimal canlılığı garanti etmek için yumurtayı yan tarafı üzerinde 38 °C'de ve yaklaşık %50 nemde inkübe edin. 48 ila 52 saatlik inkübasyonun ardından, yumurta yaklaşık 12 ila 13. Hamburger-Hamilton evresine ulaştığında, çalışma alanını ve tüm aletleri %70 etanol ile dezenfekte edin.Ardından yumurtayı inkübatörden çıkarın, oda sıcaklığında bekletin ve %70 etanol ile ikinci kez silin. Hafif bir ışık kaynağı kullanarak, koyu bir alan olarak görünen embriyonun konumunu belirleyin ve bir kurşun kalemle merkezinin etrafına daire çizerek işaretleyin. 19 gauge bir iğne ile yumurtanın küt ucuna bir delik açın, ardından yumurtanın sivri ucunda, çizilen dairenin yakınına ikinci bir delik açın.Yumurta kabuğunun dış kısmından küçük bir parçayı çıkarmak için 19-gauge iğne kullanın ve pens yardımıyla iç yumurta zarına ait küçük bir parçayı uzaklaştırın. Ardından, üç mililitrelik bir şırıngaya takılı 19-gauge iğneyi yumurtanın küt ucundaki delikten içeri sokun ve 1.5 ile 2.5 mililitre arasında albümin çekin. Yumurtanın küt ucundaki deliği bir santimetre çarpı bir santimetre boyutunda bir bant parçasıyla kapatın ve ardından çizilen daireyi ve ikinci deliği 2.5 santimetre çarpı dört santimetre boyutunda bir bant parçasıyla kapatın.2,5 santimetre kesme kenarına sahip kavisli makaslar kullanarak ve makasları yumurta kabuğuna paralel tutarak, işaretli daire içinde bir pencere açın. Plazmidi enjekte etmek için picospritzer'ı açın ve cihazın ayarını beş mikrosaniye boyunca 18 PSI basınç uygulayacak şekilde düzenleyin, ardından hava tankını ve diseksiyon mikroskobunun lambasını açın. Sonrasında, ticari olarak satın alınan India Ink'in steril PBS içindeki 30 mililitre stok çözeltisini hazırlayın.India Ink solüsyonunu bir mililitrelik bir şırıngaya çekin, ardından 27 gauge bir iğne takın ve şırıngada oluşan tüm hava kabarcıklarını giderin. Embriyoyu görüntülemek için iğneyi vitellus membranının hemen altına, embriyodan yaklaşık iki ila üç milimetre uzağa yerleştirin ve yaklaşık 0.2 mililitre India Ink enjekte edin. Ardından pencere açılmış yumurtayı, diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirilmiş bir yumurta tutucuya aktarın ve plazmid enjeksiyon bölgesini en iyi şekilde görebilmek için en yüksek büyütme kademesine geçin.Enjeksiyon bölgesini kapatan membranı pensle çıkarın. Otosistleri bulun ve bunları, yakında yer alan, nucleus magnocellularis ve nucleus laminaris'in ortaya çıktığı beşinci ve altıncı rombomereyi belirlemek için referans noktaları olarak kullanın. Bir mikromanipülatör kullanarak, DNA içeren pipeti otosistlerin arasında, R5-R6 bölgesinin üzerinde yer alan nöral tüpe konumlandırın.Pikospritzer kullanarak DNA'yı nöral tüpe enjekte edin. Elektroporasyona başlamak için voltaj stimülatörünü açın, ardından PBS ile önceden doldurulmuş üç mililitrelik bir şırıngaya 0,22 mikronluk bir şırınga filtresi takın ve embriyonun üzerine filtrelenmiş PBS'den bir ila iki damla ekleyin. Ardından, mikromanipülatör yardımıyla bipolar bir elektrodu embriyoya doğru hareket ettirin ve pozitif elektrodu R5-R6'nın lateralinde tutarken negatif elektrodu enjeksiyon bölgesinin üzerine konumlandırın.Voltaj stimülatörü ile, bir saniyelik aralıklarla bir milisaniye boyunca 50 voltluk 20 pals uygulayın. Elektrot ucunun yakınında kabarcıklar göreceksiniz. Elektroporasyondan sonra, açık olan bölgeye bir damla PBS ekleyin, elektrodu nazikçe çıkarın ve laboratuvar peçetesi ile %70 ethanol kullanarak temizleyin, ardından embriyo üzerindeki pencereyi bantla kapatın.Son olarak, enjekte edilen plazmid tipini ve yumurta kabuğu üzerindeki kuluçka tarihini not edin ve yumurtayı, pencere kısmı yukarıya bakacak şekilde inkübatöre yerleştirin. Yumurtaları, istenen gelişim aşamasına ulaşana kadar 38 °C sıcaklıkta ve %50 nemde inkübe edin. Elektroporasyondan 24 saat sonra yumurtayı inkübatörden çıkarın, pencereyi açın ve bir stereo mikroskop kullanarak hedef plazmid enjeksiyonunun doğru konumda olduğunu doğrulayın.Tet-on vektörleri kullanılmışsa, koriyoallantoik membrana 50 µL Doksisiklin pipetleyin, pencereyi kapatın ve yumurtayı inkübatöre geri koyun. Burada, embriyonik 12. gün civcivinden hazırlanan bir beyin sapı kesitinin diferansiyel girişim kontrastı aydınlatması ve floresan aydınlatma altında çekilmiş fotoğrafları sunulmaktadır. Beyin sapı kesiti içerisinde nucleus magnocellularis ve nucleus laminaris ayırt edilebilir.Floresan aydınlatma altında, her iki yapı da sarı floresan protein ekspresyonunu ortaya koyarak, elektropore edilmiş genlerin etkili mekansal ekspresyonunu doğrulamaktadır. Elektropore edilmiş genin ekspresyonu, embriyonik 18. gün civcivinden elde edilen ve nucleus magnocellularis'i içeren bir beyin sapı kesitinde de gözlemlenebilir. 80 kat büyütüldüğünde, diferansiyel girişim kontrast aydınlatma altında klasik adendritik hücre gövdeleri görülmektedir.Adendritik hücre gövdeleri sarı floresan protein ekspresyonu göstermektedir; bu durum, in ovo elektroporasyonun, işitsel nöron gelişimi çalışmalarına yönelik olarak işitsel beyin sapının spesifik bölgelerinde gen ekspresyonunu indükleyebileceğini bir kez daha kanıtlamaktadır. Uzmanlaşıldığında ve uygun şekilde uygulandığında, bu teknik yaklaşık 12 canlı yumurta için iki ila üç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, gen ekspresyon fenotiplerinin normal işitsel beyin sapı gelişimini nasıl düzenlediğine dair ek soruları yanıtlamak amacıyla biyokimyasal, farmakolojik ve in vitro-in vivo fonksiyonel analizler gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, tavuk işitsel beyin sapında gen ekspresyonunun mekansal ve zamansal olarak nasıl kontrol edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. In ovo elektroporasyon; anatomik ve fizyolojik özelleşmelerin yanı sıra işitsel beyin sapı gelişimindeki iyi tanımlanmış zaman dilimlerinin genetik kontrolüne olanak tanır.

in-ovo-electroporation-in-the-chicken-auditory-brainstem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Ovo elektroporasyon Civciv kuş embriyonun genetik manipülasyon sağlayan bir tekniktir. Bu tekniğin yaygın uygulamalar genlerin fonksiyonel analiz ve olası artırıcı unsurları içerir. Bu video HH 10 civciv embriyosunda nöral tüp elektroporasyon göstermektedir. Enjeksiyon tekniği ve uygun yumurta taşıma tartışılmıştır.

HH Sahne 10 Tavuk Embriyolar Ovo Electroporations

Bu video nöronların genetik olarak tanımlanan gruplar aksonal yollar kullanarak embriyonik civciv omurilik görselleştirmek için nasıl...

Nöronlar, Genetik Tanımlı Gruplar Aksonal tanımında kullanılması Civciv Nöral Tüp Deşifre Ovo Elektroporasyon

Tavuk işitsel beyin sapı Binoral ses işleme için sorumlu çekirdekleri oluşur. Kültürlü bir yaklaşım, nöron yapısı ve işitsel fonksiyonu, moleküler, hücresel ve ağ seviyelerinde gelişimini incelemek için eşsiz bir hazırlık sağlarken tek bir koronal dilim hazırlık tüm devre tutar.

Tavuk İşitsel Beyin Sapı Dilimleri hazırlanması ve Kültür

Bu videonun genel amacı hedef retina enjeksiyon nasıl gerçekleştirileceği göstermek için...

Embriyonik Chick Retina Ovo Elektroporasyon

Işlevi ve orta beyin dopaminerjik nöron gelişimi sırasında genlerin düzenlenmesi değerlendirmek için, içeren bir yöntem...

Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında

İşitme organı işitmeye aracılık eder. Burada, gelişmekte olan tavuk işitme organında işitsel progenitör hücre proliferasyonu ve farklılaşmasını incelemek için optimize edilmiş modifiye edilmiş bir in ovo mikro-elektroporasyon yöntemi sunuyoruz.

Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından<em&gt; Ovo olarak</em&gt; Mikro-elektroporasyon

Burada, bir beyin sapı dilimi içinde tonotopik özelliklerin ve gelişimsel yörüngelerin araştırılması için tavuk embriyosunun koronal olmayan işitsel beyin sapı dilimlerinin elde edilmesine yönelik bir protokol sunuyoruz. Bu dilimler, geleneksel koronal kesitlerin tek bir dilim düzlemi içindeki daha büyük tonotopik bölgeleri kapsayan sagital, yatay ve yatay / enine bölümleri içerir.

Tonotopik gradyanları ve mikrodevreleri değerlendirmek için embriyonik tavuk işitsel beyin sapının dilimlenmesi

Standart işitsel beyin sapı yanıtı (ABR) tekniklerini kullandık ve bunları işitsel işlev için erken bir kuş modeli olan yavru tavuklara uyguladık. Protokol, hayvan hazırlama ve ABR edinme tekniklerini, diğer kuş veya kemirgen modellerine çevrilebilecek adımlarla ayrıntılı olarak özetlemektedir.

Tavuk Yavrularında İşitsel Beyin Sapı Yanıtının Değerlendirilmesi

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

Ovo elektroporasyonunu kullanarak, devre montajının ayrı dönemlerinde kırılgan X mental retardasyon proteininin hücre grubuna özgü bir nakavtını sağlamak için tavuk embriyolarındaki işitsel iç kulağı ve koklear çekirdeği seçici olarak transfekte etmek için bir yöntem geliştirdik.

In Ovo Electroporation tarafından İşitsel Bir Devrede Kırılgan X Mental Retardasyon Proteininin Hücre Otonom Fonksiyonunun Diseksiyonu

Öğrenin, tavuk işitsel beyinsapında gen ifadesini in ovo elektroporasyonla uzamsal ve zamansal olarak nasıl kontrol edeceğinizi. Bu yöntem, işitsel nöron gelişimini ve patofizyolojik olayları incelemek için etkili bir yaklaşım sunar.

Tavuk İşitsel Beyinsapındaki Ovo Elektroporasyonunda

Daha fazla video keşfet