Name: Multifektral Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak LC3, p62 ve LAMP1 Birlikte Lokalizasyonu Ölçülerek Otofajik Fluxın Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Keşfedin: Otofajik flux ölçümü için LC3, p62 ve LAMP1 birlikte lokalizasyonunu çok spektrumlu görüntüleme akış sitometrisi ile nicel analiz yöntemi. Jurkat hücrelerinde objektif ve istatistiksel olarak güçlü sonuçlar elde edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MilliporeSigma, Philip J. Morrissey ve Sherree L. Friend&#39;deki meslektaşlarımıza yıllar boyunca destek ve rehberlik yaptıkları için teşekkür etmek istiyorum. Vidya Venkatachalam&#39;a ve Bryan R. Davidson&#39;a, IDEAS yazılımındaki BDC3 özelliği ile ilgili yardımlarından ötürü teşekkür ediyorum , bu el yazması için Raymond Kong&#39;a yardımcı olmak için Ryan P. Jessup çekim gününde yardım ve özel teşekkürler Makyaj sanatçısı Cynthia Xamonthiene&#39;e.

<ol><li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+by+self-digestion%3A+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li>
<li>Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+should+autophagic+flux+be+assessed%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Why should autophagic flux be assessed?</a> Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).</li>
<li>Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18425443">LC3 and Autophagy.</a> Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).</li>
<li>Larsen, K. B., Lamark, T., Øvervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bjørkøy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reporter+cell+system+to+monitor+autophagy+based+on+p62%2FSQSTM1%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1.</a> Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).</li>
<li>Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+flow+cytometry+for+measurement+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Applications of flow cytometry for measurement of autophagy.</a> Methods. 75, 87-95 (2015).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+mammalian+autophagy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).</li>
<li>Arsov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC-mediated+transgenic+expression+of+fluorescent+autophagic+protein+Beclin+1+reveals+a+role+for+Beclin+1+in+lymphocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development.</a> Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).</li>
<li>Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+death+pathways+in+desmin-related+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy.</a> Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).</li>
<li>Altman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+essential+to+suppress+cell+stress+and+to+allow+BCR-Abl-mediated+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis.</a> Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).</li>
<li>Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gammaherpesvirus+68+infection+of+endothelial+cells+requires+both+host+autophagy+genes+and+viral+oncogenes+for+optimal+survival+and+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence.</a> J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).</li>
<li>Tra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li>
<li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li>
<li>Leveque-El Mouttie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+required+for+stem+cell+mobilization+by+G-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF.</a> Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).</li>
<li>Watson, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+limits+proliferation+and+glycolytic+metabolism+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia.</a> Cell Death Discov. 1, 15008(2015).</li>
<li>Stranks, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+Controls+Acquisition+of+Aging+Features+in+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages.</a> J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).</li>
<li>Clarke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+activated+in+systemic+lupus+erythematosus+and+required+for+plasmablast+development%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development.</a> Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).</li>
<li>Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+assays+for+the+study+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric assays for the study of autophagy.</a> Methods. 82, 21-28 (2015).</li>
<li>Bjørkøy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p62%2FSQSTM1+forms+protein+aggregates+degraded+by+autophagy+and+has+a+protective+effect+on+huntingtin-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death.</a> J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).</li>
<li>Phadwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+autophagy+detection+in+primary+cells%3A+Impaired+levels+of+macroautophagy+in+immunosenescent+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells.</a> Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).</li>
<li>Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+autophagosomes+and+autolysosomes+in+cells+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).</li>
<li>Kwok, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HspB8+mutation+causing+hereditary+distal+motor+neuropathy+impairs+lysosomal+delivery+of+autophagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes.</a> J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).</li>
<li>Lopez-Herrera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleterious+Mutations+in+LRBA+Are+Associated+with+a+Syndrome+of+Immune+Deficiency+and+Autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity.</a> Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).</li>
<li>Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF4+orchestrates+a+program+of+BH3-only+protein+expression+in+severe+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia.</a> Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).</li>
<li>Pike, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+up-regulation+of+ULK1+by+ATF4+contributes+to+cancer+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival.</a> Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).</li>
<li>Pugsley, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+autophagy%3A+Measuring+LC3+puncta+and+autolysosome+formation+in+cells+using+multispectral+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry.</a> Methods. 112, 147-156 (2017).</li>
<li>IDEAS. <a target="_blank" href="https://www.amnis.com/images/PN_780-00959-00_RevC_IDEAS_User_Manual.pdf">Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2</a>. , (2015).</li>
</ol>

Bu çalışmada kullanılan Amnis markası ImageStream&#39;in yapımcısı MilliporeSigma tarafından istihdam edildim.

Bu analiz yapılırken göz önüne alınması gereken birkaç nokta var. Uygun kontrol örneklerine sahip olmak önemlidir. Bu deney için iki farklı kontrol kullanıldı: Kontrol ve Kontrol + Klorokin. Bölgeler için eşik değeri belirlemek için Kontrol örneği kullanıldı. Otofajinin temel seviyesini lizozomal bozunmayı durdurmadan gösterir ve Starved örneğinin kontrolüdür. Bununla birlikte, Kontrol örneği, Starved + Chloroquine örneğindeki sonuçlar ile karşılaştırmak için uygun bir kontrol değildir; çünkü klorokin kontrol numunesini etkiler. Dolayısıyla, bir Control + Chloroquine örneği almak gerekiyordu. Otofaj için herhangi bir analiz yapmadan önce, yalnızca odaklanan tek hücre ( yani, RMS, 60&#39;dan büyük gradyan) üzerinde analiz etmek / kapamak önemlidir, çünkü birden fazla hücre varsa veya görüntüler etkilenebilir odak dışı. OtofagosomunEs ve lizozomlar uygun nokta sayımı ve BDC3 analizi için odaklanmaktadır. Otofaji analizinden önce apoptotik hücreler çıkartılmalıdır, çünkü sonuç çarpıtabilir ve eklenmemelidir. Her üç belirteç için de uygun boyama yapılmalıdır ( yani, LC3, p62 ve LAMP1). Örneğin, üç belirteçin tümü hücrelerarasıdır ve noktalamalı bir işaret içermelidir; Sinyal işaretli değilse veya hücrenin yüzeyinde bulunuyorsa boyama uygun olmayacak ve deney / boyanma yeniden yapılmalıdır. Buna ek olarak, BDC3&#39;ün doğru olması için, ilgilenilen üç flüoresan markeri için parlak olan hücreleri kaplamak gereklidir. Olumlu olaylar üzerinde geçiş, BDC3&#39;ün spesifik olmayan bağlanma, görüntüleme eserleri ve / veya gürültü üzerindeki ölçümünü önlemek için gereklidir. BDC3, gerçek sinyaller olmayan eserleri potansiyel olarak artırabildiği için bu çok önemlidir. BDC3 yalnızca parlak olumlu olaylar üzerinde gerçekleştirilebildiğinden, birçok hücre son analizde yer almayabilir; Bu especLC3, p62 ve / veya LAMP1 birikimine sahip olmayan kontrol hücreleri için geçerlidir. Bu nedenle, bu tahlilde bir sınırlama, BDC3&#39;ün yalnızca üç markör için de pozitif olan hücreleri inceler, bu da tüm otofajy deneyleri için uygun olmayabilir. Daha önce 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 olarak bildirilen BDS gibi, BDC3 tek başına, birlikte lokalize olan otofaji organellerin sayısını hesaba katmaz, bu da büyük bir dereceye neden olur Otofagozom sayısındaki değişkenlik. Bu nedenle, Rajan ve ark. Tarafından sunulan iki değişkenli yaklaşım ; kullanılmıştır. İki değişkenli parsele baktığımızda,Hücreler LC3, p62 ve LAMP1 için pozitif olmalıdır; Neden 0 noktalı çok fazla hücre var? Bunun nedeni, LC3 sinyalinin birlikte lokalizasyon için yeterince parlak olabilmesidir, ancak bunun dikkate alınması için gerekli olan tepe maskesinin (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 4)) belirlediği eşiğe gelmeyebilir yer. Burada sunulan protokol, otofajik akıyı ölçmek için LC3 noktalamasını saymak için MIFC&#39;yi ve üç otofaji belirteçinin birlikte lokalizasyonunu kullandı. Bazal şartlar altında (kontrol örneği), otofagozom sayısı düşük ve &quot;Yüksek Noktalar&quot; ile çok az hücre bulundu. Otofagozom / lizozom füzyonunu inhibe eden klorokin ilavesi ile LC3 lekelerinin sayısında bir artış olmuştur. Lizozom otofagozomu ve otofagozomda bulunan p62&#39;yi parçalayamadığından, LC3, p62 ve LAMP1 otolizozom birikiminin birlikte lokalizasyonunda artışa neden olur. Bu etki, besleyici starvatIyon, otofajiye neden olur. Bununla birlikte, klorokin ilavesi olmaksızın, büyük olasılıkla otofajik döngü oranındaki artıştan ötürü otofogozom sayısındaki belirgin bir artış görülmemiştir. Hücreler klorokin varlığında aç bırakıldığında, açlığın otofajik akıyı arttırdığı sonucunu destekleyen otofagozomların birlikte lokalizasyonunda ve sayısında bir artış oldu. EBSS, otofajinin güçlü bir uyarıcısı olarak bilinir. Dolayısıyla, artışın büyük olması bekleniyor. Otofajiyi indüklemek için uyuşturucu indüksiyonu gibi başka bir yöntem kullanılırsa, kontrol ve muamele edilmiş numuneler arasındaki fark daha ince olabilir. Bu özel protokol, insan hücre dizilerindeki otofajiyi ölçmek üzere tasarlanmıştı, ancak tahlil, bu türler için antikora geçiş yaparak diğer türlere adapte edilebilir. Buna ek olarak, analiz yöntemi, birlikte lokalizasyonu gerektiren herhangi bir hücre içi uygulama için kullanılabilirÜç prob / belirteçten oluşur.

Bundan sonra otofajinin olarak anılacaktır Macroautophagy, zarar görmüş ya da işlevsel parçalar, uzun ömürlü proteinler ve organeller lizozom ile parçalanan ve 1 geri dönüştürülür edildiği bir katabolik geçiş yoludur. Otofaji, bir otofagosom oluşumunu içeren dinamik, çok aşamalı bir süreçtir; Otoflikozomun lizozom ile kaynaşması, otolizozomun oluşturulması; Ve otolizozomun içeriğinin bozunması 2 . Membran sistemlerinde otofajiyi tanımlamak için kullanılan kritik biyolojik belirteç otofajozomal membranı oluşturan mikrotübüle bağlı protein 1A / 1B-hafif zincir 3 (LC3) &#39;dur. Otofaji sırasında sitosolik LC3-1, LC3-II oluşturmak üzere fosfatidiletanolamine konjüge edilir; Daha sonra LC3-II, otofajozomal zar 3 içine dahil edilir. Otofajik akı için yaygın olarak kullanılan bir diğer marker, otofaj reseptör sekestozomu 1 (SQSTM1, p62) olup, bunlar fiziksel olarak liAutophagic membran 4 , 5&#39;e otofajik yük getirir. Geleneksel olarak otofajiyi ölçmek için kullanılan yöntemler Western lekeleri ve floresan mikroskobu 7&#39;dir . Ancak bu yöntemlerin hiçbirinin &quot;altın standart&quot; olarak kabul edilir 2, bu tekniklerin her ikisi ile ilişkili zorluklar vardır 6 olarak. Western lekeleri ortalama verir çünkü homojen bir örnek kullandıklarından, gözlemciler tek tek hücrelerde neler olduğunu göremezler. Öte yandan, flüorür mikroskobu, tek hücre seviyesinde bir gözlemci bilgi verir, ancak, objektif ve istatistiksel olarak titiz değerlendirmelerin elde edilmesini zorlaştıran üretim kapasitesinden yoksundur. Son yıllarda, multispektral görüntüleme akış sitometrisi (MIFC, Malzeme Tablosuna bakınız) ile LC3 ve p62 ölçümü popülasyon kazanmaktadırNiceliksel gücü, yüksek işleme kapasitesi, çoklama potansiyeli ve her hücrenin imajını oluşturma yeteneği nedeniyle çok sayıda. Otofaji kendi kendine analiz yazılımıyla (bkz . Malzemelerin Tablosu ) birlikte kullanarak otofajiyi ölçmek için en yaygın kullanılan yöntemlerden biri, LC3 punktasının veya otofagozomların 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14&#39;ün nokta sayımı yoluyla yapılır , 15 , 16 , 17 . Bununla birlikte, otofagozomlarda bir artış, mutlaka, otofajide bir artış olduğu anlamına gelmez çünkü süreçte bir blokaj da gösterebilir 2 . LC3-II cirosu, varlıklardaki hücreleri analiz ederek otofajik akıyı ölçmek için yararlı bir parametredir veKlorosin gibi bir lizozomal bozunma önleyicisinin bulunmaması. Klorokuin, böylece 18 oluşabilir lizozomal bozulması önce otofajik akı durdurulması ile otofajinin derecesinin bir ölçüsü olarak, otofagozom oluşumunun miktarının belirlenmesine izin veren lizozoma otofagozom füzyonunu inhibe eder. Buna ek olarak, p62 öncelikle otofaji ile bozundur ve otofagozomun ve içeriğinin lizozomal parçalanması engellendiğinde, p62&#39;nin birikimi 17 , 19 olması beklenir. Otofaji çok aşamalı bir süreçtir ve LC3 veya p62&#39;nin tek başına ölçümü, hücrelerde olup bitenenin tam bir resmini vermez. Yakın tarihli yayınlar, otolizozomun eşzamanlı oluşumunu inceleme ihtiyacını vurgulamıştır 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 - lizozom 15 otofagozom ko-lokalizasyonunu görüntüleme ile autolysosome oluşumunu ölçmek için benzersiz mümkün. Buna ek olarak, P62 ve MIFC kullanılarak LC3 eş yerleşimi de otofajik akı 5 ölçmek için incelenmiştir. Referans analiz yazılımında, birlikte yerelleştirmeyi ölçen &quot;özellik&quot;, &quot;Parlak Detay Benzerliği R3&quot; (BDS) olarak adlandırılır ve iki görüntünün küçük, parlak görüntü ayrıntılarını karşılaştırmak için özel olarak tasarlanmıştır. BDS, 3 piksel veya daha düşük bir yarıçapa sahip lokalize parlak noktaların log dönüşümlü Pearson korelasyon katsayısıdır; Başka bir deyişle, BDS hesaplar o derecesiİki farklı flüoresan kanalından pikseller verlapping. Parlak noktalar ya birbiriyle ilişkilendirilir (diğer bir deyişle, aynı uzaysal konum) veya ilişkisizdir ( yani, farklı uzaysal yerler). Bu nedenle korelasyon katsayısı 0 (korelasyonsuz) ile 1 (mükemmel korelasyon) arasında değişir. Katsayı aralığı sıfırdan sonsuza 26 , 27&#39;ye çıkarmak için log dönüşümlüdür. BDS tek başına yeterli olmayabilir; Rajan ve ark. Sadece BDS&#39;nin kullanılması yanlış-pozitif veya yanlış-negatif sonuçlara neden olabileceğini bulmuştur 21 . BDS, otofajinin iki belirteçinin birlikte lokalizasyonunu değerlendirir, ancak otofagozom sayısını dikkate almaz. Otofagozom sayısını açıklamak için Rajan ve ark. LC3 puncta 21&#39;in nokta sayımını içermektedir. Rajan ve ark. BDS&#39;ye karşı LC3 nokta sayımının bir iki değişkenli dağılım grafiğini kullanarak önerdi. Bu iki değişkenli arsa kullanılarak iki popülasyonİlk tanımlanan: biri yüksek seviyede LC3 lekelerine sahip hücreler ve diğeri düşük seviyeli LC3 lekelerine sahip hücreler. Yüksek eş-lokalizasyonu (yani otolizozomlara birikmesi), düşük (diğer bir deyişle, otofagozomların birikmesi) eş-lokalizasyonu ve hücreler ile hücrelerin: Yüksek LC3 nokta popülasyonu ayrıca iki popülasyona sınıflandırılmıştır. Bu iki değişkenli arsa, az sayıda otofagozomlu hücreler ile otofagozom birikimi ve / veya otolizozomlar 21 olan hücreleri ayırt etmeyi sağlar. Şimdiye kadar, LC3, p62 ve LAMP1&#39;in (lizozomal markör) eş zamanlı birlikte lokalizasyonu, MIFC tamamlayıcı analiz yazılımında tek bir &quot;Özellik Türü&quot; kullanarak mümkün değildi (Malzeme Tablosuna bakın). Bununla birlikte, kısa süre önce 6.1 sürümünde tanıtılan yeni bir özellik, Parlak Ayrıntı Ayrıntılı Yerleştirme 3 (BDC3) olarak adlandırılır. BDC3, üç görüntünün her birinden parlak ayrıntı resimlerini karşılaştırır (bu durumda, LC3, p62 ve LAMP1) ve üç sondanın birlikte lokalizasyonunu niceleştirir ( yani, LC3, p62 ve LAMP1). BDC3 özelliği, Pearson korelasyon katsayısını üç görüntüye kadar genişletmek için hesaplar. Üç görüntünün parlak noktaları ya korelasyonlu ya da korelasyonsuz olduğundan, korelasyon katsayısı 0 (korelasyonsuz) ile 1 (mükemmel korelasyon) arasında değişir. Katsayı, 0 ile sonsuz arasındaki dinamik aralığı arttırmak için günlüğe dönüştürülür. BDS özelliğini BDC3 özelliğiyle değiştirerek, Rajan ve ark. Tarafından sunulan analiz yöntemi, Autophagy&#39;yi aynı anda bir sistemde ölçmek için en çok kullanılan üç markörü bir araya getirebilir. Otofajinin bu üç belirteçinin tek bir deneyde birlikte lokalize edilmesi, otofajinin indüksiyonunda ve düzenlenmesinde yeni anlayışlara yol açabilir. Aşağıdaki protokol, Jurkat hücrelerinde otofaji indirecek adımları özetlemektedir; Hücreleri LC3, p62 ve LAMP1 antikorları ile etiketleyin; Multisp hakkında veri edininEktral görüntüleme akış sitometresi; Ve otofajik akıyı değerlendirmek için verileri analiz eder.

<table><tbody><tr><td>15 mL santrifüj tüpü</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL santrifüj tüpü</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 etiketli Eşek anti-Fare - IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Eşek anti-Fare IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 647. Konsantrasyon 2 mg / mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr><tr><td>anti-insan CD107a-PE (LAMP1)</td><td>BioLegend</td><td>328607</td><td>Klonu H4A3. Konsantrasyon 400 ve mikro; g/mL'dir. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>anti-insan CD45- AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>Klon HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>anti-insan CD45- PE & nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>Klon HI30.&nbsp; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td></tr><tr><td>anti-insan CD45-AF647&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>Klonu HI30.&nbsp; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td></tr><tr><td>Anti-LC3 (İnsan) mAb klonu 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>Klonu 4E+12.&nbsp; Konsantrasyon 2 mg / mL.&nbsp; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td></tr><tr><td>Anti-SQSTM1 / p62 antikoru [EPR4844] - Otofagozom Marker (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>Klon EPR4844.&nbsp; Konsantrasyon 0.5 mg / mL.&nbsp; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>Klorokin difosfat Tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>Temizleyici - Coulter Clenz&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>Kabı 200 mL Temizleyici ile doldurun.&nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr> <tr><td>DAPI Lekesi 5 mg / mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td></tr><tr><td>Kabarcık Çözücü - %70 İzopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>Kabı 200 mL Debubbler ile doldurun.&nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu 10x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-2010-B</td><td>&nbsp; Ca++Mg++ Ücretsiz&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu 1x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++Mg++ Ücretsiz&nbsp;</td></tr><tr><td>Earle'ün Dengeli Tuz Çözeltisi 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit, %10, metanol içermez, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>Bu, %4 ve %1 Formalin için kullanılan şeydir. DİKKAT: Formalin/Formaldehit, solunduğunda ve yutulduğunda toksiktir. Gözleri, solunum sistemlerini ve cildi tahriş eder. Solunması veya cilt teması ile hassasiyete neden olabilir. Gözlerde ciddi hasar riski. Potansiyel kanser tehlikesi. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr> <tr><td>Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat, Klon E6-1 (ATCC TIB-152)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler 100x</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>405nm, 488nm ve 642nm lazerlerle donatılmış 2 kameralı ImageStreamX Mark II kullanıldı. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>MIFC analiz yazılımı - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>MIFC'ye eşlik eden yazılım (ImageStreamX MKII).&nbsp; IDEAS sürüm 6.2</td></tr><tr><td>MIFC yazılımı - INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>Bu, MIFC'yi (ImageStreamX MKII) çalıştıran yazılımdır. INSPIRE sürüm 200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE anti-insan CD107a (LAMP-1) Antikor klonu H4A3</td><td>BioLegend</td><td>328608</td><td>http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>Peniklin / Streptomisin / Glutamin çözeltisi 100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>Durulama - Ultra saf su veya deiyonize su</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Herhangi bir ultra saf su veya deiyonize su kullanabilirsiniz. Kabı 900 mL Durulama ile doldurun.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Orta 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Kılıf - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>Bu, Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuz 1X ile aynıdır. Ca++MG++ ücretsiz.&nbsp; Kabı 900 mL Kılıf ile doldurun.</td></tr><tr><td>Silikonize polipropilen mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>Fisherbran Silikonize Düşük Tutmalı Mikrosantrifüj Tüpleri 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat çözeltisi (100 mM)</td><td>HyClone</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizatör - %0,4 - 0,7 Hipoklorit</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>Bu, Clorox ağartıcının su ile tuzunun giderilmesiyle yapılabilen yaklaşık %10 Clorox ağartıcıdır.&nbsp; Kabı 200 mL Sterilzer ile doldurun.</td></tr><tr><td>Sistem Kalibrasyon Reaktifi - SpeedBead</td><td>MilliporeSigma</td><td>400041</td><td>Her tüp ~ 10 mL. &nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&nbsp;</td></tr><tr><td>T75 şişesi</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100, PROTEİN SINIFI Deterjan, %10 Çözelti, Steril Filtreli</td><td>MilliporeSigma</td><td>648463-50ML</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td></tr><tr><td>Su, Hücre Kültürü Sınıfı&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr></tbody></table>

multifektral görüntüleme akış sitometrisi kullanılarak lc3, p62 ve lamp1 birlikte lokalizasyonu Ölçülerek otofajik fluxın değerlendirilmesi

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Otofaji, büyüme ve farklılaşma esnasında biriken normal veya işlevsel olmayan hücresel bileşenlerin lizozom ile parçalanması ve geri dönüşüme tabi tutulduğu katabolik bir yoludur. Otofaji sırasında, sitoplazmik LC3 proteini lipidize edilir ve otofagosomatik membranlara işe alır. Otofagozom daha sonra autosfosome vezikülün parçalanması ve içeriğinin bulunduğu otolizozomu oluşturmak için lizozom ile birleşir. LC3&#39;e bağlanan ubiquitin ile ilişkili protein p62, otofajik akıyı izlemek için de kullanılır. Otofajyondan geçen hücreler, p62, LC3 ve lizozomal belirteçlerin birlikte lokalizasyonunu göstermelidir. İmmünofloresan mikroskobu, LC3 punktasını, p62&#39;yi ve / veya lizozomları hücre başına bazında görsel olarak tanımlamak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, objektif ve istatistiksel olarak titiz bir değerlendirme yapmak zor olabilir. Bu problemlerin üstesinden gelmek için multispektral görüntüleme akım sitometrisi ve parlak de-Üç otofaji belirteçlerinden (LC3, p62 ve lizozomal LAMP1) kuyruk görüntüleri üretir ve otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçmek için LC3 nokta sayımı ile kombinasyon halinde birlikte lokalizasyonunu nicelendirir.

Bu analiz metodu, otofajik akışını değerlendirmek için birden fazla özellik kullanmaktadır. Nihai iki yönlü çizimi tam olarak anlamak için, önce bireysel analiz özellikleri araştırılmalıdır. Otofagozomların sayımı, otofajiyi ölçmek için mantıklı bir yöntemdir; Bununla birlikte, LC3 noktalannın boyutu / şekli / parlaklığı, hücreler arasında büyük ölçüde değişebilir. Varyasyon, otofagozomları manuel olarak veya analiz yazılımında bir nokta sayımı özelliği kullanarak saymayı zorlaştırabilir. Bu nedenle, otofagosomlardaki bu büyük değişkenlik nedeniyle nokta sayma özelliği mükemmel olmayacaktır. Bununla birlikte, çoğu nokta hücresinde iyi bir nokta sayımı özelliği çalışacaktır 26 . Şekil 3 , farklı spot maskeleri kullanan Jurkat hücrelerinde LC3 punktasının spot maskeleme örneğini göstermektedir. Bu veri seti için seçilen nokta sayımı özelliği, Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 4) _4&#39;tür; bu, nokta sayımı özelliğinin nokta(Parlak, 4) nokta-hücre arka plan oranıyla 11 kanalında (Ch11-LC3-AF647) varsayılan kanal 11 maskesinde (M11) tanımlanan ak maskesi. Şekil 4 , anti-LC3-AF647 ile etiketlenmiş Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved + Kloroquin Jurkat hücreleri için ortalama nokta sayısı için nokta sayım histogramlarını ve temsili görüntüleri göstermektedir. Kontrol ve Açlık ortalaması spot sayıları önemli ölçüde farklı değildir; Klorokuin ilavesi ile, Starved + Chloroquine&#39;e kıyasla Control + Chloroquine ortalamasında büyük bir fark vardır. Araştırılacak bir sonraki özellik BDC3&#39;tür. BDC3, bu durumda, LC3, p62 ve LAMP1 olmak üzere üç belirteç / probun ortak lokalizasyonunun bir ölçümüdür. Şekil 5A - 5D , anti-p62-AF488 ile etiketlenmiş Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved ve Starved + Chloroquine Jurkat hücreleri için BDC3 histogramlarını göstermektedir, Anti-LAMP1-PE ve anti-LC3-AF647. Kontrol ortalama ile Açlığa ortalam arasında bir kayma vardır, bunun yanında Kontrol + Klorokin ortalama + Klorokin ortalaması anlamına gelir. Bununla birlikte, Şekil 5E ortalama BDC3 puanlardan hücre görüntüleri bakarak - 5H, inanmak için bir neden olabilir histogramlar daha örnekler arasında büyük bir fark vardır. Bunun nedeni, BDC3&#39;ün aynı lokalize olduğu otofaji organellerin sayısını göz önünde bulundurmaması ve aynı BDC3 skoru için otofagosom sayısının büyük ölçüde değişmesine neden olmasıdır. Çoğu durumda, üç prob arasında da çakışma vardır, çünkü bazal seviyelerde bile, p62, LAMP1 ve LC3, belirli bir seviyede, hücrelerdeki benzer bölgelerde birlikte lokalize olmalı veya kalmalıdır. Aksine, birlikte lokalize edilmemesi gereken üç probun bir örneği, Şekil 6&#39;da gösterilen Starved + Chloroquine örneği için anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 ve DAPI nükleer boyadır. &lt;/ P&gt; Nokta sayımı özelliği ve BDC3 özelliği birleştirildiğinde, çeşitli örnek / koşulları ayırt etme becerisini geliştiren farklı alt popülasyonların varlığı belirgindir. Şekil 7 , dört örnek için BDC3 p62 / LAMP1 / LC3&#39;e karşı LC3 spot sayımının iki değişkenli grafiğini göstermektedir: Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved ve Starved + Chloroquine. Kontrol örneği üç popülasyon için geçiş stratejisini belirlemek için kullanıldı: Düşük Noktalar, Yüksek Nokta / Düşük BDC3 ve Yüksek Nokta / Yüksek BDC3. Kontrol örnekleri, hücrelerin% 98&#39;den fazlasının 1 veya daha az noktaya sahip olduğunu göstermiştir. Yüksek Nokta / Düşük BDC3 ve Yüksek Nokta / Yüksek BDC3 arasındaki sınır, BDC3 skoru 1 olarak ayarlandı, çünkü Kontrol örneğinin% 91&#39;den fazlası bir BDC3 puanı 1&#39;den daha düşüktü. İki değişkenli parseller için sonuçların özeti Tablo 1&#39;de gösterilmektedir. yaş = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> Şekil 1: MIFC Enstrüman Ayarı. Protokolün 8. adımında özetlenen, bu deney için kullanılan MIFC cihaz ayarlarının bir ekran görüntüsü. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> Şekil 2: Analiz Yazılımı Geçitleme Stratejisi. Protokolün 9. adımında ana hatlarıyla verilen analiz yazılımları geçiş planının bir ekran görüntüsü. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3: LC3 Nokta Maskelemesi. Jurkat hücre görüntüleri ve maskeleri, nokta sayımı özelliğini oluşturmak için kullanılıyordu. Gösterilen BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 2), Zirve (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 4), Zirve (M11, Ch11-LC3-AF647 , Parlak, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 5,3,1) ve Nokta (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 6,2,1). Gösterilen tüm hücreler için en iyi sonucu veren maske Peak&#39;ti (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> Şekil 4: LC3 Spot-sayımlı Histogramlar. Nokta sayımı özelliği Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 4) _4 ve LC3-AF647 Kontrol ( A , açık mavi), Kontrol + Klorokin için spot-sayım histogramları kullanılarakE ( B , mavi), Starved ( C , pembe) ve Starved + Chloroquine ( D , kırmızı). Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved ve Starved + Chloroquine için ortalama nokta sayısı sırasıyla 0.07, 1.13, 0.10 ve 2.77&#39;dir. BF, LC3-AF647 (kırmızı), DAPI nükleer boya (mavi) ve ortalama nokta sayımı için temsili hücrelerin LC3-AF647 ve DAPI görüntüsünün bir bileşimi Kontrol ( E , 0 noktalar), Kontrol + Klorokin F , 1 nokta), Starved ( G , 0 lekeler) ve Starved + Chloroquine ( H , 3 lekeler). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> Şekil 5: p62 / LAMP1 / LC3&#39;ün BDC3 Histogramları. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 histogramlarıKontrol ( A , açık mavi), Kontrol + Klorokin ( B , mavi), Starved ( C , pembe) ve Starved + Chloroquine ( D , kırmızı). Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved ve Starved + Chloroquine için ortalama BDC3 skoru sırasıyla 0.57, 0.82, 0.74 ve 0.98&#39;dir. BF; P62-AF488 (yeşil); LAMP1-PE (sarı); LC3-AF647 (kırmızı); Ve ortalama BDC3 için temsili hücrelerin p62-AF488, LAMP1-PE ve LC3-AF647 görüntülerinin bir bileşimi, Kontrol ( E ), Kontrol + Kloroquin ( F ), Starved ( G ) ve Starved + Chloroquine H ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> Şekil 6: p62 / L&#39;nin BDC3 HistogramlarıStarved + Chloroquine Örneği için C3 / DAPI. ( A ) Starved + Chloroquine örneği için BDC3 p62 / LC3 / DAPI histogramı gösterilmektedir. BDC3 ortalama puanı 0.07&#39;dir. ( B ) BF; P62-AF488 (yeşil); LC3-AF647 (kırmızı); DAPI (mavi); Ve Starved + Chloroquine örneği için ortalama BDC3 için temsili hücrelerin p62-AF488, LC3-AF647 ve DAPI görüntülerinin bir bileşimi gösterilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> Şekil 7: LC3 Nokta Sayısı ile BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 arasındaki İki Değişkenli Grafikler. ( A ) Control, Control + Chloroquine, Starved ve Starved + Chloroquine Jurkat hücreleri için LC3 spot sayısına karşılık BDC3 p62 / LAMP1 / LC3&#39;ün iki değişkenli parselleri. ( B ) BF; P62-AF488 (yeşil); LAMP1-PE (sarı); LC3-AF647 (kırmızı); Ve Starved + Chloroquine örneği için üç bölgeden ( yani, Düşük Noktalar, Yüksek Noktalar / Düşük BDC3 ve Yüksek Nokta / Yüksek BDC3) p62-AF488, LAMP1-PE ve LC3-AF647 görüntülerinin bir bileşimi gösterilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Hücre Sayısı </td><td> Parlak Ayrıntılı Kolokalizasyon 3 Ortalama </td><td> Nokta Sayısı LC3 Ortalama </td><td> Düşük Nokta </td><td> Yüksek Spot / Düşük BDC3 </td><td> Yüksek Spot / Yüksek BDC3 </td></tr><tr><td> Kontrol </td><td> 439 </td><td> 0.57 </td><td> 0.07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0.0 </td></tr><tr><td> Kontrol + Klorokin </td><td> 1432 </td><td> 0,82 </td><td> 1.13 </td><td> 68.9 </td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> hasret </td><td> 1204 </td><td> 0.74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0.6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> Starved + Chloroquine </td><td> 1811 </td><td> 0.98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36.9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Jurkat LC3 Noktası Özeti BDC3 P62 / LAMP1 / LC3 değişkenli grafiği Sayısı

Burada, otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçmek için, 3 autofagy markörün parlak detaylı görüntülerini karşılaştıran ve LC3 nokta sayımı ile birlikte lokalizasyonunu niceleyen analitik bir özelliğe sahip multispektral görüntüleme akış sitometrisi kullanılmıştır.

Multifektral Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak LC3, p62 ve LAMP1 Birlikte Lokalizasyonu Ölçülerek Otofajik Fluxın Değerlendirilmesi

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Bu deneyin genel amacı, otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak güvenilir bir şekilde ölçmek için üç otofaji belirtecinin kolokalizasyonunu LC3 puncta kantifikasyonu ile birlikte belirlemektir. Bu yöntem, üç otofaji belirtecinin kolokalizasyonunun tek bir analizde ölçülmesine olanak tanıyarak otofajinin indüksiyonu ve regülasyonuna ilişkin potansiyel olarak yeni bilgiler sağlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, üç otofaji belirtecinin aynı anda, objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak güvenilir bir şekilde ölçülebilmesidir.Uygun örnek isimleriyle etiketlenmiş ayrı 15 mililitrelik santrifüj tüplerine iki kez 10⁶ Jurkat hücresi ekleyerek başlayın. Ardından, her bir örneğin son hacmini 15 mililitreye tamamlayacak kadar yıkama tamponu ekleyin ve santrifüj ile örnekleri çöktürün. Peletleri 100 µL %4'lük formalinde yeniden süspande edin, ardından örnekleri etiketlenmiş silikonize polipropilen mikrosantrifüj tüplerine aktarın.Oda sıcaklığında 10 dakika beklettikten sonra, örnekleri bir mililitre taze yıkama tamponu ile yıkayın. Peletleri, oda sıcaklığında, ışıktan korunarak karanlıkta 30 dakikalık inkübasyon için permeabilizasyon tamponu içindeki 100 mikrolitre ilgili ilk antikor ile yeniden süspande edin. Etiketlenmiş ve permeabilize edilmiş hücreleri bir mililitre taze permeabilizasyon tamponu ile yıkayın ve az önce gösterildiği gibi bir sonraki ilgili antikor ile etiketleyin.Tüm örnekler son antikor ile işaretlendikten sonra, peletleri %1'lik formalin çözeltisi içinde yeniden süspande edin ve ardından 10 µL 10x DAPI nükleer boya ekleyin. Hücreleri hafifçe vorteksleyerek karıştırın, ardından örnekleri oda sıcaklığında, ışıktan koruyarak 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, multispektral görüntüleme akış sitometresinde varsayılan şablonu yükleyin ve uygun lazerleri seçin.Her lazer düğmesinin yanındaki pencereye istenen lazer gücünü girin, ardından 1.5 milliliter tüpü cihaza yüklemek için yükleme düğmesine tıklayın. Tüm popülasyon için bir alan M01'e karşı görünüm oranı M01 nokta grafiği oluşturun ve hücrelerin etrafına bir bölge çizin. Bu bölgeyi Hücre olarak adlandırın.Kazanım parametrelerini ayarlayın. Hedef klasörü ve dosya adını belirleyin ve olay sayısını 5.000 olarak değiştirin, ardından hücre popülasyonunu seçin ve dosyayı kazanmak için acquire seçeneğine tıklayın; ardından diğer örnekleri, az önce gösterildiği gibi aynı lazer ayarları altında çalıştırın. Dosyayı topladıktan sonra, örnek tüpünü geri almak için return seçeneğine tıklayın.Multispektral görüntüleme akış sitometrisi verilerini analiz etmek için, görüntüleme analiz yazılımındaki açık dosya sihirbazını çalıştırmak üzere analiz başlat'a tıklayın, ardından apoptoz sihirbazını açmak için apoptoz sihirbazı simgesine ve sihirbazı seç düğmesine tıklayın. Tüm apoptotik hücreler analizden çıkarıldıktan sonra, apoptotik olmayan hücrelerin etrafına bir bölge oluşturun ve bu popülasyonu hücreler olarak etiketleyin. Ardından, yapı taşları simgesine tıklayın.Tek renkli floresan pozitifleri seçin, hücre popülasyonunu ve MC kanalı üç yoğunluğunu seçin. X eksenini yoğunluk lamp one olarak etiketleyin ve 10,000'den büyük yoğunluğa sahip hücreleri içeren bir bölge çizin. Bu bölgeyi lamp one pozitif olarak etiketleyin.P62 ve LC3 pozitif hücreler aynı şekilde kapılandıktan sonra, analiz sekmesine tıklayın ve maskeyi seçin. Yeni'ye ve ardından fonksiyon'a tıklayın. Fonksiyon altında, peak seçeneğini belirleyin.Maske (mask) altında M11'i seçin. Kanal (channel) altında kanal 11'i seçin. Nokta/hücre arka plan oranını dört olarak ayarlayın.Ardından, tanımlanmış maske fonksiyonu penceresini kapatmak için tamam'a, ardından maskeyi maske listesine eklemek için tamam'a tıklayın. Maske yöneticisinden çıkmak için kapat'a tıklayın, ardından analiz sekmesine tekrar tıklayın ve özellikleri seçin. Yeni'ye tıklayın.Özellik türü (feature type) altından nokta sayımını (spot count) seçin ve az önce oluşturulan pik maskesini seçin. İsim kısmına spot count LC3 yazın ve tamam'a tıklayın. Tekrar yeni (new) düğmesine tıklayın.Özellik tipi (feature type) kısmından, parlak detay kolokalizasyonu üç (bright detail colocalization three) veya BDC3 seçeneğini seçin. Maske (mask) kısmından MC'yi seçin. Birinci görüntü (image one) kısmından P62 için kanal ikiyi (channel two) seçin. İkinci görüntü (image two) kısmından lamba bir (lamp one) için kanal üçü (channel three) seçin.Üçüncü görüntünün altında, LC3 için kanal 11'i seçin. İsim kısmına BDC3p62/LAMP1/LC3 yazın, ardından özellik yöneticisinden çıkmak için tamam ve kapat'a tıklayın. Yeni dağılım grafiği simgesine tıklayın ve LAMP1 pozitif p62 pozitif LC3 pozitif popülasyonunu seçin.X ekseni için BDC3/p62/LAMP1/LC3'ü, Y ekseni için ise spot sayımı LC3 özelliğini seçin ve tamam'a tıklayın. Dosya menüsü altından veri analiz dosyasını kaydet seçeneğini belirleyin; açlık artı klorokin verilerini bir veri analiz dosyası olarak kaydetmek ve dosyanın önceki sürümünün üzerine yazmak için kaydet ve evet'e tıklayın. Şimdi kontrol dosyasını açın ve uygun kompanzasyon matrisi ile şablon olarak açlık artı klorokin veri analiz dosyasını seçin.Tamam'a tıklayın. Otofazozom birikimi ve otolizozom birikimi için bölgeler oluşturmak adına, kontrol örneğini açın ve X ekseni koordinatlarının 0,1 ile 3'ü ve Y ekseni koordinatlarının 1,5 ile 0,3'ü arasında dikdörtgen bir bölge çizin. Bu bölgeyi düşük lekeler olarak adlandırın.Ardından, X ekseni koordinatlarının 0.1 ile 1'i ve Y ekseni koordinatlarının 17.5 ile 1.5 arasını kapsayan bir bölge çizin ve bu bölgeyi "high spot low BDC3" olarak adlandırın; daha sonra X ekseni koordinatlarının 1 ile 3'ü ve Y ekseni koordinatlarının 17.5 ile 1.5 arasını kapsayan bir bölge çizin ve bu bölgeyi "high spots/high BDC3" olarak adlandırın. Kontrol dosyasını, bir şablon olarak kullanılabilecek şekilde kaydedin ve ardından, daha önce gösterildiği gibi kontrol dosyasını şablon olarak kullanarak açlık artı klorokin dosyasının da dahil olduğu diğer dosyaları açın. Farklı nokta maskeleri kullanılarak Jurkat hücrelerindeki LC3 puncta'larının bu nokta maskelemelerinde gözlemlendiği üzere, LC3 puncta'larının boyutu, şekli ve parlaklığı hücreler arasında önemli ölçüde farklılık gösterebilir.Bu deney için en iyi sonuç veren maske, hücre arka planı ile nokta oranı dört olan peak maskesiydi. Anti-LC3 ile işaretlenmiş Jurkat hücrelerinin bu temsili nokta sayımlarında, kontrol ve açlık durumundaki ortalama nokta sayıları arasında anlamlı bir fark yoktur. Klorokin eklendiğinde, kontrol artı klorokin ortalaması ile açlık artı klorokin ortalaması arasında büyük bir fark gözlemlenmektedir.Bu deneyde, ölçülen kontrol BDC3 kolokalizasyon ortalaması ile açlık ortalaması arasında ve kontrol artı klorokin ortalaması ile açlık artı klorokin ortalaması arasında bir kayma gerçekleşmiştir. BDC3, kolokalize olan otofaji organellerinin sayısını dikkate almaz, bu da aynı BDC3 skoru için otofagozom sayısında yüksek derecede değişkenliğe yol açar. Nitekim, çoğu durumda üç prob arasında örtüşme görülmektedir; çünkü Beyza seviyelerinde bile p62, LAMP1 ve LC3, hücrelerin benzer bölgelerinde belirli bir ölçüde kolokalize olmalıdır.Buna karşılık, burada birlikte yerelleşmemesi gereken üç prob üzerinde BDC3 özelliğine bir örnek verilmiştir: P62, LC3 ve DAPI. Nokta sayısı ve BDC3 özellikleri birleştirildiğinde, çeşitli örnekler ve koşullar arasındaki ayrımı yapabilme yeteneğini artıran farklı alt popülasyonların varlığı belirgin hale gelmektedir.Bu teknik bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde yaklaşık sekiz saat içinde tamamlanabilir. Ancak, farklı bir nokta sayım özelliği gerekirse, ek analiz süresi gerekecektir. Bu prosedür uygulanırken, uygun kontrollerin kullanıldığının hatırlanması önemlidir.Örneğin, Beyza seviye eşiklerini belirlemek için kontrol örneği kullanın ve açlık artı klorokin örneği için kontrol artı klorokin örneğini kontrol olarak kullanın. Bu prosedür, sadece ilgili antikorlar değiştirilerek üç farklı markörün kolokalizasyonunu gerektiren diğer hücre içi uygulamalar için de kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin otofaji markörleri ile nasıl işaretleneceği, çok spektrumlu bir görüntüleme akış sitometresi ile nasıl veri elde edileceği ve otofajik akışı değerlendirmek için verilerin nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Formalin ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür uygulanırken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanımı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

assessing-autophagic-flux-measuring-lc3-p62-lamp1-co-localization

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bozulma ve geri dönüşüm için maya vakuol asidik lümen organelleri teslim izlemek için sağlam bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yöntem, genetik olarak kodlanmış çift emisyon floresan pH biyosensör ve floresan mikroskobu kullanarak tek tek hücrelerin görselleştirme hedef organellerin özel etiketleme dayanmaktadır.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Otofaji hücreler protein ve organellerin aşağılamak ve geri dönüşüm sağlayan her yerde bulunan bir süreçtir. Biz görselleştirmek ve küçük ölçmek için gelişmiş floresan mikroskop geçerli, ama autolysosomes içine oluşumu ve autophagosomes ve lizozomlar dağılımı, ve füzyon da dahil olmak üzere otofaji indüksiyon ile ilgili temel, fiziksel değişiklikler,.

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Floresan etiketli otofaji belirteçlerin zaman atlamalı mikroskopi yüksek temporal çözünürlük ile dinamik otofaji yanıt izleme sağlar. 3 farklı renklerin bir kombinasyonu belirli Otofaji ve organel belirteçleri kullanarak, güçlü bir mekansal ve zamansal bağlamda autophagosome oluşumuna bir protein katkısı takip edebilir.

Erken Otofaji Etkinlikler Hücre Görüntüleme Canlı: Omegasomes ve Ötesi

Aktif otofaji, Kas Kök Hücresi (MuSC) aktivasyonu için gerekli olan üretken kas rejenerasyonu ile ilişkilidir. Burada, LC3'ün in situ tespiti için bir protokol sunuyoruz, kontrol ve yaralı farelerdeki kas dokusu bölümlerinin MyoD pozitif MuSC'lerinde bir otofaji markörü.

Otofajinin Kas Hücrelerinde Yerinde İmmunofloresan Boyanması

Memeli hücreleri toplu autophagic tutma etkinliği ölçmek için basit ve iyi doğrulanmış bir iletişim kuralı burada açıklanmıştır. Bu yöntem laktat dehidrogenaz (karaciğer) oranı miktarının toplam hücresel karaciğer düzeylere göre sedimentable hücre kesirler dayanır.

Laktat dehidrogenaz haciz tahlil — Toplu Autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir Yöntem

Protein katabolizmindeki biyolojik ritimleri otofaji ve fare karaciğerinde proteozom yoluyla ölçme protokolümüzü tanımlıyoruz.

Otophagic ve Proteasomal Akı'da Diurnal Ritimlerin Ölçülmesi

Mitofaji, mitokondriyal kalite kontrolünün birincil mekanizmasıdır. Bununla birlikte, in vivo mitofajinin değerlendirilmesi, güvenilir kantitatif tahlillerin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, hücre pervasıtalı yeşil-floresan mitokondri boyası ve kırmızı-floresan lizozom boyası kullanılarak canlı hücrelerde mitofajinin gözlemlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Mitokondri ve Lizozom için Floresan Boyalarla Mitopajinin Görselleştirilmesi

Bu protokolün amacı, LC3 immünofloresan ve LC3 nokta ölçümü yoluyla pankreas kanseri ve pankreas asinar hücrelerinde otofajik düzeyleri belirlemektir.

LC3 İmmünofloresan Kullanılarak İki Farklı Pankreas Hücre Modelinde Otofaji Düzeylerinin Değerlendirilmesi

Burada, hücresel üst yapı ile ilgili olarak nadir proteinlerin lokalizasyonunu araştırmak için bir araç olarak endojen, floresan etiketlemeye dayalı optimize edilmiş kesit korelasyonlu ışık-elektron mikroskobu için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşımın gücü, Bafilomisin tedavisi olmadan aç bırakılmış hücrelerde endojen LC3'ün ultrastrüktürel lokalizasyonu ile gösterilmiştir.

Kesit Üzerinde Korbağül Işık-Elektron Mikroskobu ile Endojen LC3'ün Ultrastrüktürel Lokalizasyonu

Burada, hücre dışı veziküllerde (EV'ler) otofagozom belirteç LC3-II seviyelerini immünoblotlama ile özlü bir şekilde değerlendirmek için metodolojiyi sunuyoruz. EV'lerde, otolizozom oluşumunda ve omegazom oluşumunda LC3-II seviyeleri için analiz, otofagozom-lizozom füzyonu inhibe edildiğinde LC3-II-pozitif EV'lerin salınmasında STX6'nın yeni rolünü göstermektedir.

Hücre İçi LC3 Pozitif Veziküllerin Birikimi ile İlişkili Olarak Hücre Dışı Veziküller Yoluyla LC3-II Salınımının Değerlendirilmesi

Keşfedin: Otofajik flux ölçümü için LC3, p62 ve LAMP1 birlikte lokalizasyonunu çok spektrumlu görüntüleme akış sitometrisi ile nicel analiz yöntemi. Jurkat hücrelerinde objektif ve istatistiksel olarak güçlü sonuçlar elde edin.

Multifektral Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak LC3, p62 ve LAMP1 Birlikte Lokalizasyonu Ölçülerek Otofajik Fluxın Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal

Multifektral Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak LC3, p62 ve LAMP1 Birlikte Lokalizasyonu Ölçülerek Otofajik Fluxın Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet