Analiz için Protein-tRNA Agaroz Jel Retardasyon Testleri K 6 Threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Bu prosedürün genel amacı, RNA bağlayıcı proteinlerin keşfi ve karakterizasyonu için tasarlanmış bir RNA jel geciktirme testini göstermektir. Bu testin uygulanması, TcdA ve transfer RNA arasındaki etkileşimi araştırmak için kullanılır. Agaroz jel geciktirme yöntemi, RNA biyolojisi alanındaki temel sorulara cevaplar sağlayabilir.

Örneğin, belirli bir proteinin RNA ile etkileşime girip girmediği, etkileşimin dizilere özgü olup olmadığı ve etkileşimin gücü. Bu tekniğin temel avantajları, çeşitli küçük miktarlarda protein ve RNA örnekleri kullanması ve protein-RNA etkileşimleri hakkında oldukça hızlı bir şekilde çok bilgilendirici sonuçlar vermesidir. Bu yöntem protein-tRNA kompleksleri hakkında bilgi sağlayabilse de, ribozomal RNA, haberci RNA ve diğer herhangi bir RNA molekülü gibi diğer birçok sisteme de uygulanabilir.

Sabah, pET-23D EC triple-U ekspresyon vektörü ile dönüştürülmüş bir şişe donmuş E coli BL21 DE3 alın. Mililitre ampisilin başına 100 mikrogram ile desteklenmiş düşük tuzlu bir luria suyu veya LB plakası çizin. Plakayı ters çevirin ve öğleden sonra geç saatlerde koloniler görünene kadar 37 santigrat derecelik bir kuluçka makinesine yerleştirin.

İyi büyümüş bir tek koloniyi beş mililitre LB artı mililitre ampisilin başına 100 mikrogram ile aşılayın ve gece boyunca büyütün. Ertesi sabah, hücreleri peletleyin. Santrifüjlemeyi takiben, ortamı beş mililitre taze LB artı mililitre ampisilin başına 100 mikrogram ile değiştirin ve yeniden askıya alın.

200 mililitre LB artı mililitre ampisilin başına 100 mikrogram aşılamak için bu süspansiyonu kullanın. Hücreleri 220 RPM ve 37 santigrat derecede beş saat büyütün. Kültürün 590 nanometredeki optik yoğunluğu 0.6 ila 0.8'e ulaştığında, tRNA üçlü-U geninin ekspresyonunu tetiklemek için kültüre atdd1 milimolar IPTG.

Hücreleri 37 santigrat derecede üç saat inkübe ettikten sonra, kültürü dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 6500 kez g'de santrifüjleyerek hücreleri hasat edin. Lizizi gerçekleştirmek için, önce hücre peletini beş mililitre lizis tamponunda yeniden askıya alın. Çeker ocakta yeniden süspanse edilmiş hücre peletine bir hacim asit fenol ekleyin ve hücreleri parçalamak için ters çevirerek bir dakika karıştırın.

Daha sonra, 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 10 bin kez g'de santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak çözünür tRNA üçlü-U'yu içeren üst sulu fazı toplayın. Organik alt fazı aspire etmemeye dikkat edin.

Çözünür fazı hacim başına 2.5 hacim %100 hacim etanol ile dört santigrat derecede bir saat ters çevirerek iyice karıştırarak tRNA'yı çökeltin. Daha sonra, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 15 bin kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice boşaltın, ardından tRNA açısından zengin peleti dört mililitre jel filtrasyon tamponunda yeniden süspanse edin.

Standart kromatografik uygulamayı takiben, yeniden süspanse edilmiş tRNA üçlü-U'yu daha önce jel filtrasyon tamponunda dengelenmiş, yüksek çözünürlüklü bir hazırlayıcı jel filtrasyon kolonuna yükleyin. Numuneleri elüte etmek için akış hızını dakikada 1 mililitreye ayarlayın. Numune hazırlamaya başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi karşılık gelen miktarda TcdA'yı uygun şekilde etiketlenmiş 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine pipetleyin.

1.6 milimolar TCEP'lik son bir konsantrasyon ekleyin ve bir pipet kullanarak hafifçe karıştırın. Kapağı kapatın ve karışımı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından adenozin trifosfat ve magnezyum klorür ekleyin.

Karışımı oda sıcaklığında beş dakika inkübe etmeden önce bir pipetle karıştırın. Ardından, metin protokolüne göre saflaştırılmış tRNA üçlü-U ekleyin ve numuneyi bir pipetle karıştırın. Numuneyi oda sıcaklığında beş dakika inkübe ettikten sonra, 100 mikrolitrelik nihai hacme kadar fosfat tamponlu salin ekleyin.

Düzgün bir şekilde karıştırın ve tüpün içeriğini kısa bir süre döndürmeden önce numuneyi %10'luk bir nihai konsantrasyona kadar gliserol ekleyin. Agaroz jeli metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Elektroforez çalışması sırasında odayı dört santigrat derecede tutmak için elektroforez ünitesini kırılmış buzla dolu bir tepsiye yerleştirin.

Her numuneden beş mikrolitreyi ilgili kuyucuğa dikkatlice pipetleyin. Ayrıca uygun bir DNA boyutu işaretleyicisi ekleyin. Ardından, elektrotları güç kaynağı ünitesinin ilgili yuvalarına takın.

Güç kaynağı ünitesini açtıktan sonra voltajı 100 volta ayarlayın ve jeli 90 dakika çalıştırın. Daha sonra, 50 mililitre TBE'yi 1X uygun bir DNA boyası ile karıştırarak boyama çözeltisini hazırlayın. 90 dakikalık elektroforezden sonra, jeli tepsiden dikkatlice çıkarın ve boyama solüsyonu içeren bir kaba koyun.

Kabı düşük sallanma hızında bir külbütöre yerleştirin ve 30 dakika oda sıcaklığında sallayın. Agaroz jeli boyama kabından çıkarın ve fazla sıvıyı çıkarmak için bir parça selüloz kağıda dikkatlice vurun. Ardından, jeli doğrudan bir transilluminatörün üzerine yerleştirin.

tRNA içeren bantları görselleştirmek için UV ışığını açın. Son olarak, jelin bir fotoğrafını çekin. Burada, jel geciktirme testleri için tRNA saflaştırmasının temsili sonuçları gösterilmiştir.

Kromatogramda, 254 nanometredeki elüsyon fraksiyonlarının absorbansı kaydedilir. Aşırı eksprese edilmiş tRNA üçlü U bakımından zenginleştirilmiş tRNA havuzu, en yüksek zirvede ortaya çıkar. tRNA havuzunun kalitesi ve miktarı agaroz jel elektroforezi ile incelenir.

RNA jel geciktirme testi, TcdA'nın tRNA konsantrasyonuna bağlı şekilde tRNA üçlü-U ile stabil bir kompleks oluşturduğunu ve bu da jelin önündeki serbest tRNA'dan daha yavaş göç eden bir protein-tRNA bandı ile sonuçlandığını ortaya koymaktadır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik iki saatten daha kısa sürede yapılabilir. Bu protokolü denerken, tRNA'nın kimyasal stabilitesini sağlamak için sıkı laboratuvar tekniklerini takip etmeyi unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, TcdA veya başka herhangi bir RNA türü ile olduğu gibi, seçtiğiniz proteinin tRNA ile etkileşimini araştırmak için agaroz jel geciktirme testinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.