Name: Analiz için Protein-tRNA Agaroz Jel Retardasyon Testleri K 6 Threonylcarbamoyladenosine TcdA Function (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Keşfedin TcdA ve tRNA(UUU) arasındaki etkileşimi agaroz jel retardasyon testleriyle. Bu yöntem RNA-bağlayıcı proteinleri karakterize etmek için hızlı ve bilgilendirici sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MCV, CIB İleri Düzey Programı &quot;Daha İyi Yaşam için Moleküler Makineler&quot; (MACBET) üyesidir. Bu sonuçlara götüren araştırmalar, İspanyol Enstitü Salud Carlos III (PI12 / 01667&#39;den MCV&#39;ye), İspanya Ekonomi Bakanlığı Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R ve SAF2015-72961-EXP&#39;den MCV&#39;ye) tarafından finanse edildi. ), Madrid Bölge Hükümeti (S2010 / BD-2316&#39;dan MCV&#39;ye) ve Avrupa Komisyonu (Çerçeve Programı 7 (FP7)) projesi olan ComplexINC (Sözleşme No. 279039&#39;dan MCV&#39;ye). Fon sağlayanlar, çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayın yapma kararı veya el yazmasının hazırlanmasında rol oynamadı.

Dikkat: Kullanmadan önce ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formlarına (MSDS) başvurun. Bu protokolde kullanılan kimyasallardan birçoğu toksik ve aşındırıcıdır. Davlumbaz ve kişisel koruyucu ekipmanlar (emniyet gözlükleri, eldivenler, laboratuar önlükleri, tam pantolonlar, kapalı pabuçlar, vb .) Dahil olmak üzere fenol kullanarak tRNA&#39;nın özümlenmesinde uygun uygulamaları kullanın. Bu protokol, toksik olmayan bir nükleik asit lekesi kullanıyor. Alternatif lekelerin kullanılması, toksik ve / veya kanserojen olan durumlarda ek önlemler ve lekelenme ajanının özel olarak imha edilmesini gerektirebilir ( örn ., Etidyum bromür). 1. Agaroz Jelinin Hazırlanması <ol><li> 2 g agaroz tartın ve bir% 2 w / v agaroz jel hazırlamak için bir cam şişeye ekleyin. </li><li> Agaroz içeren şişeye 100 mL 1x tris-borat-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (TBE) akan tampon ekleyin. Bir mikrodalga fırında ısıtarak eritin. 30 saniyelik aralıklarla içeriği karıştırıp karıştırınIyi ve agaroz tamamen çözünene kadar bu adımı tekrarlayın. Agaroz çözeltisinin yaklaşık 50-60 ° C&#39;ye soğumasını bekleyin. </li><li> Jel tepsisinin açık kenarlarını bir kalıp oluşturmak için bantlayın, kuyuları oluşturmak için uygun bir tarağı yerleştirin ve eritilmiş agarozu içine dökün. Kabarcık oluşumundan kaçının ve oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin. </li><li> Katılaştıktan sonra, jel tepsisini bir elektroforez birimine yerleştirin ve jel tamamen kaplanıncaya kadar TBE tamponuyla doldurun. </li></ol> 2. tRNA&#39;nın hazırlanması <ol><li> E coli&#39;de tRNA (UUU) <ol><li> Sabah, düşük tuzlu Luria Broth (LB) çizgisi oluşturmak için pET23d-EcUUU 2 ifade geni ( E. coli tRNA&#39;sını (UUU) kodlayan liman) ile dönüştürülen donmuş E. coli BL21&#39;in (DE3) bir şişesini kullanın. 100 ug / mL ampisilin ile desteklenmiş plaka. Plakayı ters çevirin ve koloniler görünene kadar 37 ° C inkübatöre yerleştirin (geç dönem)) Oon. </li><li> İyi yetişmiş tek bir koloni, 5 mL LB artı 100 μg / mL ampisilin içinde inoküle edin ve gece boyunca 37 ° C&#39;de 220 rpm&#39;de büyütün. </li><li> Ertesi sabah, hücreleri peletleyin (4 ° C&#39;de 10 dakika 6,500 xg) orta ile 5 mL taze LB artı 100 μg / mL ampisilin ve tekrar süspansiyon ile değiştirin. 200 mL LB artı 100 μg / mL ampisilin inoküle etmek için bu süspansiyon kullanın. 37 ° C&#39;de 220 rpm&#39;de 5 saat büyütün. </li><li> Kültürün 590 nm&#39;de (OD 590 ) optik yoğunluğu 0.6 - 0.8&#39;e ulaştığında, tRNA (UUU) geninin ekspresyonunu tetiklemek için kültüre 1 mM IPTG ekleyin. 37 ° C&#39;de 3 saat inkübe edin. </li><li> Kültürü 6,500 xg&#39;de 4 ° C&#39;de 10 dakika santrifüj ederek hücreleri hasat edin. </li></ol></li><li> Lizis ve ekstraksiyon <ol><li> Hücre peletini 5 mL liziz tamponu (0.3 M sodyum asetat, 10 mM EDTA) içinde tekrar süspanse edin. Bu noktadan sonra otoklavda kullanılan tamponları kullandı ve tüm tRNA içeren örnekleri 4 ° C&#39;de tutarak tRNA bozunması. </li><li> Davlumbazdaki yeniden asılmış hücre pelletine 1 hacim asit fenol (pH 4.3) ilave edin. Hücreleri çözmek için 1 dakika karıştırın ve 10.000 xg&#39;de (10 dakika, 4 ° C) santrifüjleyin. </li><li> Organik (alt) fazı aspirememek için dikkatli bir pipet kullanarak çözünür tRNA (UUU) (ve diğer tRNA havuzlarının daha küçük konsantrasyonları) içeren üst sulu fazı toplayın. Organik faz ve hücre artıklarından oluşan alt tabaka ve peleti uygun bir kaba atın. </li><li> Çözünür (sulu) fazı, hacimce% 100 v / v etanol ile 1 saat süreyle 4 ° C&#39;de ters çevirerek iyice karıştırarak tRNA&#39;yı çökeltin. Karışımı 15,000 xg&#39;de (30 dakika, 4 ° C) santrifüjleyin. </li><li> Süpernatanı dikkatlice boşaltın ve tRNA zengin pelleti 4 mL jel filtrasyon tamponunda (20 mM sodyum fosfat veya potasyum fosfat, pH 7.4, 0.1 mM EDTA) tekrar süspansiyon haline getirin. % 2 w / v agaroz jeli üzerine 5 μL tekrar süspansiyon haline getirilmiş tRNA havuzunu çalıştırın. NOT:Kaliteli tRNA, tek bir bant (50-100 bp arasında molekül boyutu) olarak görünür. </li></ol></li><li> TRNA&#39;nın saflaştırılması (UUU) <ol><li> Standart kromatografi uygulamasını 12 takiben, daha önce jel filtrasyon tamponunda dengelenmiş bir yüksek çözünürlüklü hazırlayıcı jel filtrasyon sütununa (boyutlar: 16 x 600 mm, yatak hacmi: 120 mL, çözünürlük aralığı: 1,000-70,000 Da) yeniden askıya alınmış tRNA&#39;yı (UUU) yükleyin (mobil aşama). Numunelerin ayrılması için akış oranını 1 mL / dakika olarak ayarlayın. NOT: tRNA (UUU) zirvesi yaklaşık 75.5 mL&#39;de elüte edilir. Tipik olarak, 0.5-1.0 mg / L kültür tRNA verimi elde edilebilir. </li><li> Örnekleri% 5 w / v agaroz jeli üzerinde her bir örnekten 5 - 10 uL elektroforezleyerek temsil eden elüsyon hacimlerinde analiz edin. </li></ol></li></ol> 3. Numune Hazırlama <ol><li> López-Estepa ve ark.na göre TcdA&#39;yı ifade edin ve arıtın. 2 . NOT: 250 μm&#39;ye kadarÇalışma için TcdA kullanılabilir. </li><li> Tablo 1&#39;e uygun olarak 1.5 mL santrifüj tüplerine uygun etiketli TcdA&#39;yı karşılık gelen miktarda pipetleyin. 1.6 mM tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) (nihai konsantrasyon) ilave edin ve bir pipet kullanarak hafifçe karıştırın. Kapağı kapatın ve karışımı oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> 10 uM adenosin trifosfat (ATP) ve 50 mM MgCl2 (nihai konsantrasyonlar) ilave edin. Bir pipetle karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> Tablo 1&#39;e göre saflaştırılmış tRNA (UUU) (bölüm 2.3) ekleyin, bir pipet ile karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> 100 μL son hacme kadar fosfat tamponlu tuz (PBS) ekleyin. Doğru şekilde karıştırın ve% 10 v / v son konsantrasyona kadar gliserol ekleyin. </li><li> Numuneyi vorteksleyin ve tüpün içeriğini kısaca boşaltın (10,000 xg, 1 dakika, 4 ° C). </li></ol> 4. Jel Yükleme ve Elektroforez Geliştirme<ol><li> Elektroforez ünitesi, elektroforez işlemi sırasında bölmeyi 4 ° C&#39;de tutmak için ezilmiş buz dolu bir tepsi içine yerleştirin. </li><li> Dikkatle, ilgili kuyucuğa her bir örneğin 5 μl&#39;unu pipetleyin. Uygun bir DNA boyutu işaretleyicisi ekleyin. </li><li> Elektrotları güç kaynağı ünitesinin ilgili yuvalarına takın. Güç kaynağı birimini açın ve voltajı 100 V olarak ayarlayın ve jeli 90 dakika boyunca çalıştırın. </li></ol> 5. tRNA-Protein Etkileşimini Gözlemlemek İçin Jel Boyaması <ol><li> Boyama solüsyonunu 50 mL TBE&#39;yi 1x uygun bir DNA lekesi ile karıştırarak hazırlayın. Boyama kabını alüminyum folyo ile kaplayarak boyama çözümünü güneş ışığına maruz bırakmayın. NOT: DNA lekeleri genellikle 10.000 veya 20.000x konsantre stok olarak saklanır. </li><li> 90 dakika boyunca elektroforezden sonra jelini tepsiden dikkatlice çıkarın ve boyama solüsyonu içeren bir kaba yerleştirin. Oda sıcaklığında düşük salınan hızda bir rocker üzerine yerleştirin30 dakika bekleyin. </li><li> Agaroz jeli lekelenme kabından çıkarın, fazlalık sıvıyı çıkarmak için bir parça selüloz dokusu veya filtre kağıdına dikkatlice vurun ve doğrudan transilluminator üzerine yerleştirin. TRNA içeren bantları görselleştirmek için UV ışığını açın. Jelin fotoğrafını çekin. </li><li> Protein boyama (isteğe bağlı). <ol><li> DNA boyama solüsyonunu güvenli bir şekilde atın (güvenlik prosedürlerine göre) ve 50 mL Coomassie Brilliant Blue (CBB) solüsyonuyla değiştirin. Tepsiyi oda sıcaklığında bir rocker üzerine koyun ve bir gece boyayın (&gt; 12 saat). CBB boyama çözüm atın ve aşırı boya kaldırmak için 50 ml PBS ile değiştirin. Bir rocker üzerinde 1 saat bekleyin. </li></ol></li><li> Bir ışık transilluminatör altında protein içeren tRNA kompleksleri görselleştirmek ve tRNA UV jel resmi ile karşılaştırmak için jel fotoğraflarını çekin. </li></ol>

<ol><li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gel+retardation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li>
<li>López-Estepa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+and+small-angle+X-ray+analysis+of+CsdL%2FTcdA+reveal+a+new+tRNA+binding+motif+in+the+MoeB%2FE1+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily.</a> Plos One. 10 (4), e0118606(2015).</li>
<li>Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cyclic+form+of+N6-threonylcarbamoyladenosine+as+a+widely+distributed+tRNA+hypermodification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification.</a> Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).</li>
<li>Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+protein-protein+interactions+within+the+Cysteine+Sulfinate+Desulfinase+Fe-S+cluster+biogenesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system.</a> J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).</li>
<li>Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+heteromeric+CsdA-CsdE+cysteine+desulfurase%2C+assisting+Fe-S+cluster+biogenesis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).</li>
<li>Fried, M. G., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+studies+of+the+cyclic+AMP+receptor+protein-DNA+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction.</a> J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).</li>
<li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions%3A+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assays+for+RNA-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).</li>
<li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li>
<li>Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+mobility+shift+assays+to+detect+protein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions.</a> Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).</li>
<li>Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+agarose+gel+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+quantitating+protein%3A+RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions.</a> Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).</li>
<li>Hagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-filtration+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gel-filtration chromatography.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 10, Unit 10.9 (2001).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada tarif edilen protein-tRNA agaroz jel geciktirme deneyi, çeşitli şekillerde modifiye edilebilir. Birincisi, jelin içindeki agaroz yüzdesi, burada analiz edilen protein (120 kDa) &#39;dan önemli ölçüde daha büyük protein-tRNA komplekslerinin ayrılması ve görselleştirilmesine izin vermek için azaltılabilir. İkincisi, hedef protein termolabilitedeyse, elektroforez cihazını soğuk bir odaya taşıyarak veya üretilen ısıyı derhal dağıtmak için elektroforez haznesi içindeki buz paketlerini kullanarak sıcaklıkların maksimum...

<html> Jel gerilik testi 1 (elektroforetik mobilite kaydırma deneyi EMSA olarak da bilinir), protein-nükleik asit etkileşimlerini incelemek ve karakterize etmek için tasarlanmış bir elektroforetik yöntemdir. Protein-DNA&#39;nın yanı sıra protein-RNA etkileşimlerinin ve özellikle de tRNA ve tRNA-bağlayıcı proteinler arasındaki etkileşimlerin saflaştırılmış bileşenleri veya kompleks protein karışımları ( örn. , Hücre lizatları) veya nükleik asitler ( örn. , TRNA havuzları). Antikoodon kök döngüsünde (ASL) A37&#39;ye bağlanan threonylcarbamoyl yan zincirini siklize eden saflaştırılmış tRNA (UUU) ile TcdA, bir N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) dehidrataz arasındaki etkileşimin incelenmesine jel geciktirme testleri uyguladık TRNA&#39;ların siklik t6&#39;ya (ct 6 A) 2 , 3&#39;e dönüştürülmesi . TcdA ayrıca CsdL 3 olarak bilinir ,Fc &gt; 4. tcdA / csdL geni sistein desulfurase&#39;ı ve sistein sulfinase desulfinate (CSD) sisteminin sülfür akseptörünü kodlayan csdA ve csdE genleri 5 ile bir küme oluşturur ve canlı ortamda TcdA fonksiyonunu sürdürmek için gereklidir 3 . Jel retardasyon deneylerinin ardındaki mantık, serbest nükleik asit molekülleri, büyük negatif yüklerinden ötürü akrilamidin veya agaroz jellerinin önüne hızla göç ederken, aynı nükleik asitlerin protein komplekslerinin elektroforetik hareketliliği dramatik bir şekilde azalır. Hareketlilikteki azalma, ayrı bantlar olarak çözümlenen nükleik asit-protein komplekslerinde &quot;kayma&quot; olarak görülebilir. Pozitif yüklü ve daha büyük nükleik asit-protein kompleksi, bir jel üzerinde hareketlilikte daha büyük bir kayma veya azalma gösterir. Kompleksin yükle nötrleştirilmesi evrensel bir fenomendirProtein-nükleik asit kompleksleri için, jel retardasyon tahlili geniş bir kompleks yelpazesine ve nükleik asit tiplerine uygulanabilir. Yöntem basit, ucuzdur ve minimum ekipmanlarla laboratuvarlarda yürütülebilir. Sadece az miktarda protein ve tRNA gerekir. Bu, genellikle daha büyük miktarlarda numuneyi tüketen alternatif biyofiziksel teknikler üzerinde bir avantajdır. Jel retardasyon tahlili transkripsiyon faktörlerinin incelenmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Deney, birçok farklı DNA dizisi için transkripsiyon faktörlerinin bağlanma kinetiği, mukavemeti ve özgünlüğünü analiz etmek için kullanılmıştır. Gerçekten de bu alanda EMSA ilk önce 6 , 7 geliştirildi. RNA 8 , 9 , 10 , 11 ve tRNA molekülleri ile jel geciktirme testleri ribozom araştırmasında da kullanılmıştırVe burada yaptığımız gibi, transkripsiyonel olarak tRNA nükleozidlerini değiştiren enzimleri analiz etmek. Birçok farklı parametre, sıcaklık, protein kalitesi ve tRNA örneği gibi jel retardasyon tahlilinin sonucunu ve bağlanma kuvvetini etkiler. Deneyin dikkatli planlanması ve uygulanması, serbest nükleik asit ve protein bağlı türlerin sonuçlarının yorumlanması için çok önemlidir. Burada, tRNA&#39;yı (UUU) kodlayan sentetik geni, promotörü Shine-Dalgarno ribozom bağlanma yerinden yoksun bir ifade vektörüne klonlandı ve büyük miktarda tRNA 2 sentezine yol açtı. Bu ayrıntılı protokol, yaygın hatalar önlenirken tRNA jel geciktirme deneyleri gerçekleştirmek için net bir kılavuz sağlamak üzere hazırlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>E. coli BL21(DE3)</td><td>Novagen</td><td>70235</td><td>DE3 lizojen, IPTG indüksiyonu üzerine T7 polimeraz içerir.</td></tr><tr><td>pET23d</td><td>Novagen</td><td>69748-3</td><td>pET23d, ampisilin'e direnç sağlar; T7 destekleyicisi.</td></tr><tr><td>LB Et Suyu, Düşük Tuz (Lennox L Et Suyu), Granül</td><td>Melford</td><td>GL1703</td><td>Konvansiyonel LB Et Suyu, Yüksek Tuz da kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10419313</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör Çalkalayıcı (Termostatlı)</td> <td>NBS</td><td>Excella E24&nbsp;</td><td>Sıcaklık kontrollü herhangi bir çalkalayıcı inkübatör kullanılabilir.</td></tr><tr><td>İzopropil-beta-D-tiyogalaktopiranosid (IPTG), >=%99</td> <td>Acros Organics</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat, susuz, %>99Melford</td><td></td> <td>B4017</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA), Disodyum tuzu, %>99</td> <td>Acros Organics</td><td>AC327205000</td><td>Solunması halinde zararlıdır.</td></tr><tr><td>Santrifüj (soğutmalı)</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj (soğutmalı) rotor</td><td>Eppendorf</td><td>5430/5430P</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Sorvall</td><td>RC5C</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj rotoru</td><td>Sorvall</td><td>SLA-3000</td><td></td></tr><tr><td>Fenol çözeltisi, 0.1 M sitrat tamponu ile doymuş, pH 4.3 &plusmn; 0.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>Akut toksisite (oral, dermal, soluma), aşındırıcı</td></tr><tr><td>Analiz için mutlak etanol,% 100 v / v</td><td>Merck Millipore</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik dihidrat, Na2HPO4, >=% 99</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum dihidrojen fosfat, KH2PO4</td><td>Merck</td><td>48,730,250</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 75&nbsp;</td><td>GE Sağlık</td><td>28989333</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>Tris [Tris(hidroksimetil) aminometan HCl]</td><td>Melford</td><td>T1513</td><td></td></tr><tr><td>Borik Asit</td><td>Melford</td><td>B0503</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodalga</td><td>Haier</td><td>HDA-2070M</td><td></td></tr><tr><td>TCEP [Tris(2-karboksietil)fosfin hidroklorür]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td>Metaller ve cilt için aşındırıcıdır.</td></tr><tr><td>ATP [Adenozin 5 & prime; -trifosfat disodyum tuzu hidrat], Derece I, > =% 99</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür (MgCl 2 ), susuz, > =% 98</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl),% >99</td> <td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl),% ></td><td>99Melford</td><td>P0515</td><td></td></tr><tr><td>NZYDNA Merdiven VI</td><td>NZYtech</td><td>MB8901</td><td></td></tr><tr><td>Güç kaynağı</td><td>Consort</td><td>EV261</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforez ünitesi</td><td>Gerçek Laboratuvar</td><td>RELSMINI10</td><td></td></tr><tr><td>Gerçek Güvenli nükleik asit boyama</td><td>Gerçek Laboratuvar</td><td>RBMSAFE</td><td>20.000X stok</td></tr><tr><td>UV Transilluminator (G: Box / EF)</td> <td>Syngene</td><td>2216498</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Rocker (Gyro-Rocker)</td><td>Stuart</td><td>SSL3</td><td></td></tr><tr><td>Mikser Vortex&nbsp;</td><td>Fisher marka</td><td>13214789</td><td></td></tr></tbody></table>

analiz için protein-trna agaroz jel retardasyon testleri<em&gt; k</em<sup&gt; 6</sup&gt; threonylcarbamoyladenosine tcda function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Escherichia coli&#39;de tRNA&#39;nın (UUU) eksprese edilmesi ve saflaştırılması için yöntemler ve tRNA&#39;nın (UUU) TcdA, bir N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) dehidrataz ile bağlanmasının jel geciktirme deneyleri ile analizi, bu, threonylcarbamoyl TRNA&#39;ların antikodon kök döngüsünde (ASL) A37&#39;ye bağlanmış yan zincirin siklik t6A&#39;ya (ct 6 A) dönüştürülmesi. TRNA (UUU) kodlayan sentetik genin transkripsiyonu E. coli&#39;de 1 mM izopropil β-D-l-tiogalaktopiranozit (IPTG) ile indüklenir ve tRNA içeren hücreler indüksiyonun 24 saat sonra hasat edilir. RNA fraksiyonu asit fenol ekstraksiyon yöntemi kullanılarak saflaştırılır. Saf tRNA, küçük boyutlu tRNA moleküllerini bozulmamış veya parçalanmış nükleik asitlerden verimli bir şekilde ayıran bir jel filtrasyon kromatografisiyle elde edilir. TRNA&#39;ya (UUU) TcdA bağlanmasını analiz etmek için, TcdA tRNA&#39;ya (UUU) karıştırılır ve doğal bir agaroz jelinde 4 ° C&#39;de ayrılır.Serbest tRNA (UUU) daha hızlı göç ederken, TcdA-tRNA (UUU) kompleksleri jel boyama sırasında gözlemlenebilen bir mobilite geriliğine uğrarlar. TcdA&#39;nın bir tRNA (UUU) bağlayıcı enzim olduğunu kanıtlıyoruz. Bu jel gerilik testi, TcdA mutantlarını ve katkı maddelerinin ve diğer proteinlerin bağlanma üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir.

Büyük miktarda tRNA (UUU), güçlü bir indüklenebilir T7 promotörü kontrolü altında E. coli&#39;de tRNA geninin eksprese edilmesi ile elde edilebilir. İfade edilen tRNA (UUU), sitoplazmada birikir ve doğal olarak bol miktarda bulunan tRNA&#39;ların havuzunda zenginleştirilir. EMSA dereceli tRNA elde etmek için bir yakalama / ekstraksiyon basamağı ve bir jel filtrasyon / parlatma aşaması içeren iki aşamalı bir saflaştırma işlemi kullanılmıştır. Yakalama / ekstraksiyon basamağı prot...

TRNA (UUU) üretimi ve agaroz jel geciktirme testleri ile TcdA enzimi ile kompleks içinde tRNA (UUU) analizi için bir protokol sunulmuştur.

Analiz için Protein-tRNA Agaroz Jel Retardasyon Testleri<em&gt; K</em<sup&gt; 6</sup&gt; Threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Bu prosedürün genel amacı, RNA bağlayan proteinlerin keşfi ve karakterizasyonu için tasarlanmış bir RNA jel retardasyon analizini göstermektir. Bu analizin uygulaması, TcdA ile transfer RNA arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılır. Agaroz jel retardasyon yöntemi, RNA biyolojisi alanındaki temel sorulara yanıt sağlayabilir.Örneğin, belirli bir proteinin RNA ile etkileşime girip girmediği, etkileşimin diziye özgü olup olmadığı ve etkileşimin gücü gibi sorulara yanıt aranır. Bu tekniğin temel avantajları, protein ve RNA örneklerinden çok küçük miktarlarda kullanması ve protein-RNA etkileşimleri hakkında oldukça hızlı bir şekilde çok açıklayıcı sonuçlar vermesidir. Bu yöntem protein-tRNA kompleksleri hakkında bilgi sağlayabilmesinin yanı sıra; ribozomal RNA, haberci RNA ve diğer her türlü RNA molekülü gibi birçok farklı sisteme de uygulanabilir.Sabah saatlerinde, pET-23D EC triple-U ekspresyon vektörü ile transforme edilmiş dondurulmuş bir tüp E coli BL21 DE3 çıkarın. Mililitre başına 100 mikrogram ampisilin eklenmiş düşük tuzlu luria broth veya LB plağına ekim yapın. Plağı ters çevirin ve öğleden sonra geç saatlerde koloniler oluşana kadar 37 degrees Celsius'lik bir inkübatöre

protein-trna-agarose-gel-retardation-assays-for-analysis-n6

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu protokol hazırlanması için sentetik bir tRNA substrat...

Entamoeba histolytica DNA ve tRNA Metiltransferaz Dnmt2 (Ehmeth) Enzim ile in vitro tRNA Metilasyon Testi

Telomeraz yenidoğan beyninde ve ayrıca yetişkin beyninin farklı bölgelerinde ifade edilir. Fare beyninin çeşitli bölgelerindeki telomeraz aktivitesinin analizi ve erkek ve dişi fare beyinleri arasındaki telomeraz aktivitesindeki farklılıkların tespiti için toksik olmayan, zaman kazandıran bir TRAP testi sunuyoruz.

Fare Beyin Çeşitli Bölgelerinde Telomeraz Aktivite: Radyoaktif olmayan Telomeraz Amplifikasyon Protokolü tekrarlayın (TRAP) Deneyi

Galyum (III) 'ün 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole ve serbest baz analog düşük mikromolar hücre sitotoksisite arzetmemiştir. Bu yazıda corroles transkripsiyon inhibisyonunu değerlendirmek için, UV-Vis spektroskopisi ile bir RNA transkripsiyon reaksiyonu, etidyum bromür ile boyanmış jel ile görüntüleme RNA ve RNA miktarının açıklar ve antikanser aday özelliklerin değerlendirilmesi için basit bir yöntem ortaya koymaktadır.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Enzimatik Deneyi Galyum (III) ve H Transkripsiyon İnhibisyonunu Tedbir<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentaflüorofenil) corroles

Bu protokol, HIV-1 nükleokapsid proteininin şaperon aktivitelerini in vitro olarak inhibe edebilen moleküllerin hızlı bir şekilde tanımlanmasına izin veren bir test olan NAME'yi tanımlar.

Nucleocapsid Tavlama Dolayımlı Elektroforez (ADI) Testi HIV-1 Nükieokapsit inhibitörlerinin Hızlı tanımlanması sağlar

Transkripsiyon faktörü (TF) DNA bağlanmasını etkileyen kodlamayan genetik varyantları tanımlamak için stratejik bir plan ve protokol sunuyoruz. Genotipe bağlı TF DNA bağlanmasının elektroforetik hareketlilik kayma testi (EMSA) ve DNA afinite çökeltme testi (DAPA) analizi için ayrıntılı bir deneysel protokol sağlanmıştır.

Elektroforetik Hareketlilik Assay (EMSA) ve Shift kullanarak Fonksiyonel Olmayan kodlama Genetik Türevleri için tarama DNA afinite Yağış Deneyi (DAPA)

İnsan revers transkriptaz (TERT) hem de çift iplikçikli RNA RNA'ya bağımlı RNA polimeraz faaliyetleri ile telomeric DNA sentezler. Burada, RNA'ya bağımlı RNA polimeraz etkinliği endojen TERT algılamak için yeni kurulan bir tahlil açıklayın.

İnsan revers transkriptaz protein RNA'ya bağımlı RNA polimeraz aktivitesinin yarı kantitatif algılama

Burada, maya RNA-modifiye enzim, Mod5, biyokimyasal karakterizasyonu için bir iletişim kuralı tanımlamak ve nasıl diğer RNA enzimler için bu iletişim kuralı uygulanırsa tartışıyorlar.

TRNA-Isopentenyl transferaz aktivite tespit etmek için bir In Vitro tahlil

Burada, sentetik veya in vitro transkripsiyonu RNA üzerinde metiltransferaz aktivitesinin doğrudan analizi için antikor içermeyen bir in vitro tahlil açıklanmıştır.

RNA metiltransferaz aktivite analizi için Antibody Içermeyen tahlil

In vitro transkripsiyon reaksiyonlarını düzenlemek için yeni bir DNA bağlı T7 RNA polimerazının mühendisliğini anlatıyoruz. Protein sentezi ve karakterizasyonu için adımları tartışıyoruz, kavram kanıtı transkripsiyonel düzenlemeyi doğrulıyoruz ve moleküler bilgi işlem, teşhis ve moleküler bilgi işlemedeki uygulamalarını tartışıyoruz.

Programlanabilir In vitro Transkripsiyon ve Moleküler Hesaplama için DNA-Bağlı RNA Polimeraz

ATP'ye bağımlı kromatin remodeler'in DNA ligand ile etkileşimi CD spektroskopisi kullanılarak açıklanmaktadır. Üretilen zirveler tarafından analiz edilen bir gen promotöründeki indüklenen konformasyon değişiklikleri transkripsiyonal regülasyon mekanizmasını anlamak için kullanılabilir.

DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi

Burada, ligaz, nükleaz ve polimeraz enzimlerinin örnekleri kullanılarak nükleik asit metabolize edici enzimlerin tahlili için bir protokol sunulmaktadır. Test, enzim davranışının karakterizasyonuna izin veren, RNA ve/veya DNA hasarlarını veya yol ara ürünlerini taklit eden dupleksler oluşturmak için birleştirilebilen floresan etiketli ve etiketsiz oligonükleotidleri kullanır.

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Keşfedin TcdA ve tRNA(UUU) arasındaki etkileşimi agaroz jel retardasyon testleriyle. Bu yöntem RNA-bağlayıcı proteinleri karakterize etmek için hızlı ve bilgilendirici sonuçlar sağlar.

Analiz için Protein-tRNA Agaroz Jel Retardasyon Testleri

Daha fazla video keşfet