Vitro Simüle mikrogravite altında fare Preantral follikül gelişimi

Simüle edilmiş mikrogravite altında fare preantral foliküllerinin in vitro büyütülmesi. Tüm prosedür dört kısma ayrılabilir. Birinci kısım, stereomikroskop altında iğneler kullanılarak foliküllerin overlerden mekanik olarak izole edilmesidir.

İkinci bölümde, tekil folikülü her bir aljinat boncuğunun ortasına pipetleyerek kapsülleyin. Üçüncü bölümde, tekil foliküller içeren aljinat boncukları, simüle edilmiş mikro yerçekimi oluşturan rotasyonel kültür sistemindeki kültür medyası damlacıklarına aktarın. Dördüncü bölümde, aljinat boncukları toplayın ve folikülleri Alginat lyase ile desteklenmiş medyumda 37 °C'de 30 dakika inkube ederek aljinat boncuklardan çıkarın.

Folikül izolasyonu ve enkapsülasyonu. Overleri taşıma ortamı içinde toplayın ve ardından orleri merkezli bir kuyucuk plakasına yerleştirin. Bir stereomikroskop altında, foliküller iki iğne yardımıyla overlerden izole edilir.

Vazomembranın zarar görmemesine dikkat edin. Besiyeri damlacıklarıyla bir kap hazırlayın ve üzerini yağ ile kaplayın. Folikülleri hazırlanan kaba aktarın.

Folikülleri yeni ortamda yıkayın ve ardından ortam damlacıklarının içine aktarın. Her bir ortam damlacığı tek bir folikül içerir. Merkezli bir kültür kabı hazırlayın ve dış halkaya enkapsülasyon solüsyonunu ekleyin.

%0,8'lik aljinat çözeltisinden bir şişe hazırlayın. Kabın merkezine 0,5 µL aljinat çözeltisi ekleyin. Kabın dış halkasındaki enkapsülasyon çözeltisinin içine aljinat çözeltisinden damlacıklar ekleyin.

Folikülü, kabın merkezindeki aljinat çözeltisine aktarın. Folikülleri aljinat çözeltisi ile durulayın. Folikülleri, çözeltinin yumuşak yüzeyinden geçerek her bir aljinat boncuğun ortasına aktarın.

Her bir aljinat boncuğu tek bir folikül içerir. Boncukların katılaşması için aljinat boncuklarını enkapsülasyon çözeltisi ile durulayın. Aljinat boncuklarını, içinde taşıma medyumu bulunan yeni bir kaba aktarın.

Simüle edilmiş mikro yerçekimi işlemi altında kapsüllenmiş foliküllerin in vitro kültürü. Kontrol grubu için, yeni bir kaba 150 mililitre kültür ortamı ekleyin ve üzerini yağ ile kapatın. Üç alginat boncuğu ortam damlacığına aktarın.

Petri kabını kültür için bir karbondioksit inkübatöründe inkübe edin. Simüle edilmiş mikrogravite tedavisi için, yağ içeren bir kap hazırlayın, port kapağını çıkarın ve kap neredeyse dolana kadar açık port üzerinden yağı kaba ekleyin. Yağın içine 50 milliter kültür ortamı ekleyin.

Üç adet alginat boncuğunu ortam damlacığına aktarın. Açık port kapağını tekrar kapatın. Kap içindeki hava kabarcıkları giderilmelidir.

Şırınga portu kapağını çıkarın. Şırınga portuna yağ yüklü iki şırınga yerleştirin. Şırınga portunun altındaki hava kabarcıklarını dışarı doğru hareket ettirin.

Baloncukları şırıngaya çekin ve diğer şırıngadan aynı hacimde yağı dışarı enjekte edin. Kapta hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Vanaları kapatın, şırıngaları çıkarın ve şırınga port kapağını yerine takın.

Aljinat boncukları içeren dört kabı önceden hazırladık. Şimdi kapları döner tabana sabitleme zamanı. Ortam damlası denge durumuna gelene kadar dönme hızını ayarlayın.

Kültür için her iki kabı ve tabanı bir karbondioksit inkübatörüne aktarın. Kültür ortamını değiştirme. Açık port kapağını çıkarın, alginat boncuklarını ve yağı yeni bir kaba toplayın.

Aljinat boncuklarını bulun ve taşıma ortamı içeren bir kaba aktarın. Damar kültür sistemini daha önce olduğu gibi yeniden kurun. Folikül geri kazanımı.

Açık port kapağını çıkarın, alginat boncukları ve yağı yeni bir kaba toplayın. Alginat liyaz ile desteklenmiş taşıma ortamında 37 °C'de 30 dakika inkübe ederek, alginat boncukları ve kapsülsüz folikülleri alginat boncuklardan ayırın. Sonuçlar. Hücre canlılığı analizi, normal yerçekimi koşullarında kültüre edilen tekil foliküllerin, simüle edilmiş mikroçekim koşullarında kültüre edilen foliküllere göre daha fazla canlı hücreye ve daha az ölü hücreye sahip olduğunu göstermiştir.

Her iki yerçekimi koşulunda da folikül boyutu önemli ölçüde artmıştır.Sonuç. Yöntemimiz, simüle edilmiş mikro yerçekimi koşulu altında oosit ve granüloza hücrelerinin in vitro gelişim süreçlerinde yer alan mekanizmaları incelemek için bir model sunmaktadır.