Kardiyak Kas Hücresine Dayalı Aktüatör ve Kendiliğinden Sertleşen Biorobot - Bölüm 2

Bu çalışmanın genel amacı, mikrofabrikasyon cihazları kalp kası hücreleri ile doldurmak ve bu cihazlardaki hücrelerin biyokimyasal ve biyomekanik özelliklerinin yanı sıra zaman içindeki performanslarını karakterize etmektir. Burada açıklanan madde, mikrofabrikasyon cihazlarda yüksek yoğunluklu hücre ilavesi gerektiren diğer deneyler için kolayca değiştirilebilir. Bu videoda geliştirilen biyoaktüatörün ana avantajı, başka herhangi bir hücre tipinin hücre büzülme kuvvetlerini ölçmek için kolayca benimsenebilmesidir.

Kök hücrelerin farklılaşmaya uğrarken biyomekanik özelliklerindeki değişiklikleri incelemek için de kullanılabilir. Hücre tohumlama adımlarının metinlerden açıklamalarla öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Uygun biyolojik işlev için gerekli olan konsol kolları üzerinde birleşik hücre bağlanmasını sağlamak için uygun şekilde gerçekleştirilmeleri gerekir.

Prosedürü göstermek laboratuvarımdan Neerajha Nagarajan olacak. Biyorobot ile T25 şişesinde başlayın. Şişenin dibinde yerinde tutmak için bir mıknatıs kullanın.

Biyolojik aktüatörler için mıknatısa gerek yoktur, çünkü tabandaki cam boncuğun ağırlığı nedeniyle hareket etmezler. Huni olarak kullanmak için küçük bir kare plastik tabaka yuvarlayın ve steril huniyi biyorobotlardaki aktüatörlerin üzerine yerleştirin. Şişenin üst kısmı sıkıldığında sıkıca oturacak şekilde daha geniş uçtaki çapı ve yüksekliği ayarlayın.

Huninin uyumunu test etmek ve ayarlamak için ayrı bir şişe kullanın. Huninin tam oturması, ortamın geri kalanına belirtildiği gibi hücrelerin sızmamasını sağlayacaktır. Bu, konsol kolunun birleşik kapsama alanını sağlamak için gereklidir.

Huni yerindeyken, kardiyomiyositleri mililitre başına 16 milyon hücre yoğunluğunda tam DMEM'de yeniden süspanse edin ve her bir huni boyunca cihazlara 400 mikrolitre süspansiyonu yavaşça bırakın. Ardından, içindeki cihazları veya hunileri rahatsız etmeden şişeleri yavaşça inkübatöre geri taşıyın. Hücrelerin 37 santigrat derecede 24 saat bağlanmasına izin verin.

Kuluçka döneminden sonra, huniyi yavaşça çıkarın. Numuneleri PBS ile nazikçe yıkayın ve her şişeyi 10 mililitre taze DMEM ile doldurun. Ardından, mıknatısı biyorobottan yüzecek şekilde çıkarın ve şişeleri tekrar kuluçka makinesine yerleştirin.

Kültürdeki cihazları görselleştirmek için inkübatöre yakınlaştırma lensi ile donatılmış bir kamera monte edin. Ardından, ışık kaynağı olarak kullanmak için bir LED ışık şeridi ekleyin. Ardından, kamerayı bir bilgisayara bağlayın ve görüntüleme programını açın.

Programa girdikten sonra, tüm kamera seçeneklerini açmak ve bağlı kamerayı seçmek için Dosya sekmesindeki kamera görüntüsüne tıklayın. Sekmeler listesinden Canlı'yı seçin ve lens kadranını ayarlayarak görüntüyü manuel olarak netleştirin. Ardından, üst panelden ilgilenilen bölgenin mahsulünü seçin.

Ardından, ilgilenilen bölgeyi işaretlemek için video karesine biyolojik aktüatör cihazını ve konsol kollarını çevreleyen manuel olarak bir dikdörtgen çizin. Biyorobotlar söz konusu olduğunda, cihazın yüzme hareketini kaydetmek için tüm ekranı yakalayın. Ardından, Kamera Ayarları'nı seçin ve canlı görüntünün pozlamasını ve piksel oranını ayarlayarak kare hızını ayarlayın.

Kare hızlarını saniyede yaklaşık 30 kareye ayarlayın. Son olarak, videoları kaydetmeye başlamak için kayıt düğmesine tıklayın. Simgeye tıklayarak programlama yazılımını açın.

Yüklendikten sonra Dosya, Aç'a tıklayın ve görüntü analizini çalıştırmak için m komut dosyasını seçin. Kaydedilen TIF görüntülerinin ve AVI sürümlerinin m dosyasıyla aynı klasörde olduğundan emin olun ve ardından komut dosyasını çalıştırmak için Çalıştır'a tıklayın. Gerçek programı başlatmak için Oynat'a basın.

Çalıştırdıktan sonra, tıklayın Açılış düğmesine basın ve analiz edilecek TIF veya AVI dosyasını bulun. Ardından, temel düğmesine tıklayın. Konsolun üst kısımdaki tabana bağlandığı noktayı seçin ve Enter'a basın.

Bu, konsol tabanının konumunu belirtmek için her kare için görüntüye kare bir işaretleyici yerleştirecektir. Ardından, ölçek düğmesine tıklayın ve ardından cam boncuğun bir kenarına manuel olarak tıklayın. Fare işaretçisini cam boncuğun karşı tarafına getirin ve Enter tuşuna basın.

Bu, cam boncuğun çapını ölçen bir çizgi çizecek ve çapı görüntülenen piksellerle ilişkilendirecektir. Analiz Et düğmesine tıklayın. Ardından, konsol tabanını temsil eden ilk kare işaretleyiciden kısa bir mesafede konsol boyunca tıklayın.

Uç da dahil olmak üzere konsol boyunca tıklamaya devam edin ve bittiğinde Enter'a basın. Bu, konsol üzerinde tıklanan her noktaya bir X yerleştirecektir. Son olarak, üst üste binen dairenin konsol profilini doğru bir şekilde izleyip izlemediğini kontrol edin.

Doğruysa, sonraki kare düğmesine tıklayın. Bu, TIF dosyasındaki bir sonraki kareye geçecektir. Bu işlemi tüm kareler için tekrarlayın.

Tüm çerçeveler işlendikten sonra, Dışa Aktar düğmesine tıklayın. Görüntü analiz yazılımını açarak ve yüzme biyorobot video dosyasını yükleyerek başlayın. Ardından, elektronik tablo yazılımını açın.

Yüklenen biorobot videosunda, cam boncuk gibi bir boyut referansı bulun. Cam boncuk boyunca bir çizgi çizmek için Düz aracını kullanın. Ardından Analiz Et'e tıklayın ve Ölçeği Ayarla'yı seçin.

Bilinen mesafe alanını 3.000 mikrometre olarak ayarlayın ve Tamam'a tıklayın. Bir aygıtta, işaretçi görevi görmesi için kareler arasında yalpalamayan bir nokta seçin ve bu noktanın X ve Y koordinatlarını elektronik tabloya kaydedin. Görüntü analizi yazılımı penceresine geri dönün ve sonraki kareye geçmek için sağ ok tuşuna basın. İşaretçinin üzerine tekrar gelin ve yeni X ve Y koordinatlarını elektronik tabloya kaydedin.

Bu işlemi tüm çerçeveler için tekrarlayın ve verileri, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi biyorobotun hareketini analiz etmek için kullanın. Aktüatörün statik ve dinamik gerilmeleri, her gün yüzey gerilmesinden çıkarıldı. Statik stres, hücrelerin dinlenme durumunda yüzeyde sergilediği kasılma stresidir ve dinamik stres, hücreler tarafından maksimum kasılmada üretilen strestir.

Hücreler kültürde olgunlaştıkça, zamanla statik ve dinamik streslerde kademeli bir artış gözlendi. Altıncı günde metre başına maksimum 50 milinewton hücre çekiş kuvveti ve metre başına yaklaşık 165 milinewton maksimum büzülme kuvveti sergilediler. Statik ve dinamik streslere paralel olarak, kardiyomiyosit olgunlaşması, büyümesi ve yayılması ve hücre ara bağlantısı için belirteçler de altıncı güne kadar artar.

Video analizine dayanarak, farklı yüzme profillerine sahip üç biyorobot için ortalama yüzme hızı, vuruş sıklığı ve kulaç başına hareket edilen mesafenin karşılaştırması burada gösterilmektedir. Dikey biyorobotlar en küçük vuruş frekansına sahip olmalarına rağmen, en yüksek yüzme hızını ve kat edilen mesafeyi sergilediler. Bu videoyu izledikten sonra, biyolojik aktüatörler ve biyorobotlar olarak işlev görebilecek mikrofabrikasyon cihazlarda kalp kası hücrelerinin nasıl tohumlanacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu videoda açıklanan görüntü elde etme ve müteakip veri analizi süreci, hücre davranışını ve cihaz performansını karakterize etmenin uygun bir yolunu göstermektedir. Bu prosedürü denerken, kardiyomiyositlerin ömrünün sınırlı olduğunu ve hücrelerin aktivitesinin altıncı günde zirve yaptığını hatırlamak önemlidir. Bundan sonra zamanla azalır.