Yaşlanmaya Bağlı Translasyon Sonrası Değişiklikleri İncelemek İçin Birden Fazla Fare Dokusundan Ara Filament Proteinlerinin İzolasyonu

Bu biyokimyasal prosedürün genel amacı, farklı dokuya özgü ara filament proteinlerinin translasyon sonrası modifikasyonlarını incelemek için çoklu fare dokusundan ara filamentle zenginleştirilmiş fraksiyonları izole etmektir. Bu yöntem, memeli yaşlanması sırasında bu önemli stres koruyucu hücre iskeleti proteinlerinin işlevinin ve düzenlenmesinin nasıl etkilendiği gibi ara filament alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, otomatik bir doku lizis adımının dahil edilmesinin, kullanıcıların birden fazla doku örneğini hızlı ve verimli bir şekilde işlemesine izin vermesidir.

Başlamak için, proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş bir mililitre buz gibi Triton X-100 tamponunu bir cam tüp homojenizatöre ekleyin ve buzun üzerine yerleştirin. Sıvı nitrojen deposundan küçük bir doku parçası çıkarın ve doğrudan cam homojenizatöre yerleştirin. Daha sonra homojenizatörü ve numuneyi her zaman buz üzerinde tutarken, kabarcık oluşumunu en aza indirirken numuneyi homojenize etmek için yaklaşık 50 vuruş politetrafloroetilen pastil kullanın.

Lizatı buz üzerinde 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve numuneyi 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 20.000 kez G'de santrifüjleyin. Ardından, Triton X çözünür süpernatan fraksiyonunu ayrı bir tüpte toplayın. Bu fraksiyon, immüno-çökeltme ve deterjanda çözünür IF proteinleri havuzunun analizi için kullanılabilir.

Daha sonra, doku peletine proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş bir mililitre yüksek tuz tamponu ekleyin. Temiz bir homojenizatöre aktarın ve 100 vuruş yapın. Homojenatı tekrar mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpü bir saat boyunca soğuk odada dönen bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.

Homojenatları 20 dakika boyunca dört santigrat derecede 20.000 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Peletin içine bir mililitre buz gibi soğuk PBS EDTA tamponu ekleyin ve son temizleme adımı olarak temiz bir homojenizatöre aktarın. Homojenizasyondan sonra, numuneyi yeni bir tüpe aktarın ve IF proteini açısından zengin yüksek tuz ekstraktı veya HSC'yi elde etmek için 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 20.000 kez G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı atın ve peleti 300 mikrolitre önceden ısıtılmış indirgeyici olmayan SDS numune tamponunda çözün. Başlangıçta pipetleme ve girdap ile peleti parçalayın. Ardından numuneleri 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın.

Peletin tamamen çözüldüğünden emin olmak için gerektiği gibi sarın ve pipetleyin, bu birkaç dakika sürebilir. Analize kadar tüm numuneleri eksi 20 santigrat derecede saklayın. RNA ekstraksiyonunu gerçekleştirmek için, lizin matrisi D içeren bir tüpe lizis tamponu ekleyin, ardından numune dokusunu doku lizörüne ekleyin ve her biri 25 saniye boyunca iki kez vurun.

Protein ekstraksiyonu için, toplam lizat hazırlıyorsanız Triton X-100 veya SDS numune tamponu ekleyin. Lizin matrisi SS ile bir lizin tüpüne. Ardından örnek dokuyu ekleyin. Karıştırmak için numuneyi kısa bir süre çekin.

HSC'yi hazırlamak için, paslanmaz çelik boncuğu tüpten çıkarmak için bir mıknatıs kullanın ve tüpleri 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 20.000 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatan ve pelet fraksiyonlarını ayırın ve videoda daha önce gösterildiği gibi devam edin. 10 mililitre PBS pH 20 ila 50 mililitre PBS pH 7.4 ekleyerek PBST tamponunu hazırlayın.

Daha sonra 200 mikrolitre PBST'ye bir ila 10 mikrogram antikor ekleyerek PTM antikor çözeltisi hazırlayın. 50 mikrolitre manyetik boncukları bir mikro santrifüj tüpüne alın. Mıknatısın üzerine yerleştirin ve boncuk saklama solüsyonunu aspire edin.

Boncukları antikor çözeltisinde yeniden süspanse ederek ve numuneyi oda sıcaklığında bir döndürücü üzerinde 20 dakika inkübe ederek boncukları immünopresipitasyon antikoruna konjugasyon yapın. Tüpleri mıknatısın üzerine yerleştirin ve antikor çözeltisini aspire edin. Daha sonra antikor konjuge boncukları bir kez durulamak için 200 mikrolitre PBST kullanın ve çözeltiyi çıkarın.

Boncuklara 0.6 ila bir mililitre doku lizatı ekleyin. Hafifçe pipetleyerek karıştırın ve çözeltiyi soğuk bir odada bir döndürücü üzerinde üç saat inkübe edin. Tüpleri mıknatısın üzerine yerleştirin ve lizatı çıkarın, ardından boncukları beş kez yıkamak için 200 mikrolitre PBST kullanın.

Son yıkama adımından sonra, boncukları ve 100 mikrolitre PBS'yi toplayın ve boncukları yeni, temiz bir tüpe aktarın. Tüpü mıknatısın üzerine yerleştirin, ardından PBS'yi aspire edin. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve 100 mikrolitre indirgeyici olmayan numune tamponu ekleyin.

Tüpten 50 mikrolitre alın ve indirgeyici numuneler yapmak için% 5 2ME ile birleştirin. Numuneleri beş dakika boyunca 95 santigrat dereceye ısıtın. Tüp mıknatıs üzerindeyken, boncuklardan IP fraksiyonunu toplayın ve yeni bir tüpe aktarın.

Numuneleri analize kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Kütle spektrometresi analizi için protein numunelerinin kontaminasyonunu önlemek için, tüm jelleri işlemek için temiz eldivenler kullanın ve bunları yalnızca DD H2O ile yıkanmış temiz kaplarda inkübe edin. Standart koşullara göre bir SDS sayfa jeli üzerinde 20 ila 50 mikrolitre HSE numunesi çalıştırın.

Jeli metin protokolüne göre boyadıktan sonra, jeli plastik tabaka koruyucuların arasına yerleştirin. Ardından eksize edilecek bantları tarayın ve işaretleyin. IF protein bantlarını çıkarmak için yeni, temiz bir tıraş bıçağı kullanın ve bantları kütle spektrometresi analizine göndermeden önce buz üzerindeki temiz mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin.

Bu şekil, hızlı yöntem kullanılarak izole edilen dokuz fare dokusundan elde edilen HSE'lerin tipik bir sonucunu göstermektedir. Bu yöntemin pankreas ve dalak üzerinde iyi çalışmadığını ve kalın bağırsak örneğinde ek bantlar verdiğini unutmayın. Bu gen ekspresyonu analizi, Keratin 8'in yaşlanma sırasında yukarı regüle olduğunu göstermektedir.

Ek olarak, batı lekeleri, Keratin 8'in yaşlı farelerin karaciğerlerinde güçlü bir şekilde düzenlendiğini göstermektedir. Burada, otomatik protokol kullanılarak elde edilen bir karaciğer HSE, jel üzerindeki Keratin 8 ve 18'in güçlü bir şekilde zenginleştiğini göstermektedir. Kütle spektrometresi analizi, yaşlı bir fareden alınan karaciğerdeki K8 ve K18'in, genç farenin karaciğerinde bulunmayan çoklu fosforilasyon ve asetilasyon bölgelerine sahip olduğunu göstermektedir.

Karaciğerdeki keratin değişikliklerine benzer şekilde, QPCR ile beyin dokusunun analizi, üç aylık farelere kıyasla 24 aylık beyinlerde beş kat GFAP mRNA indüksiyonu olduğunu ortaya koymaktadır. Son olarak, Coomassie boyası ile yüksek tuz ekstraktlarının protein analizi ve toplam ve asetil lizin ile zenginleştirilmiş fraksiyonların immün lekeleri, GFAP proteininin yaşlı fare beyninde yukarı regüle edildiğini ve asetillendiğini ortaya koymaktadır. Bu prosedürü takiben, kütle spektrometresi bazlı proteo karışımı gibi diğer yöntemler, farklı fizyolojik ve patofizyolojik koşullar sırasında ara filament proteinlerinin önemli translasyon sonrası modifikasyonları ve bağlanma ortakları nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, farklı memeli dokularından ara filament proteinlerinin nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.