Name: Akım altında Trombosit Degranülasyonu ve Salgılamanın Canlı Hücreli Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Öğrenin trombosit degranülasyonunu ve salgılamasını akım altında canlı hücre görüntüleme ile. Bu yöntem, tromboz ve hemostaz mekanizmalarını araştırmak için değerli bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CM, C1 Hastalığı Önleyici Eksiklikler (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht ve Kan Transfüzyon Araştırması için Landsteiner Vakfı (LSBR) için Uluslararası Hasta Kuruluşu tarafından maddi desteği onayladı.

Utrecht Üniversite Tıp Merkezi&#39;nin Yerel Medikal Etik Komitesi, bu çalışmanın da dahil olduğu ex vivo araştırma amaçları için kan çizimini onayladı. 1. Çözüm Hazırlama <ol><li> 10 mM HEPES, 0.5 mM Na2HPO4, 145 mM NaCl, 5 mM KC1, 1 mM MgS04 ve 5.55 mM D-HPO4 çözeltisi ile bir 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) Tyrode tamponu hazırlayın. Damıtılmış su içindeki glikoz. <ol><li> Tamponun iki çeşidi yapın: pH seviyelerini sırasıyla 6.5 ve 7,4 olarak ayarlayın. Deneylerin her günü için taze tampon yapın. Belirtildiği yerlerde, 10 ng / mL prostasiklin ile tamamlayın. </li></ol></li><li> Damıtık suda 50 mM Tris ve 150 mM NaCl eriterek TRIS tamponlu salin (TBS) hazırlayın ve pH&#39;ı 9.0&#39;a ayarlayın. </li><li> 85 mM Tri-sodyum sitrat, 71 mM sitrik asit ve 111 mM D-glükozun çözündürülmesi ile asit sitrat dekstrozu (ACD) hazırlayınTatlı su. </li><li> HEPES Tyrode tamponu, pH 7.4&#39;e% 2 (v / v) paraformaldehit (PFA) ilavesiyle bir fiksatif solüsyon hazırlayın. Çözünecek şekilde ısıtın (50-70 ° C) ve pH&#39;ı 7.4&#39;e ayarlayın. -20 ° C&#39;de ayırın ve saklayın. Kullanımdan önce 37 ° C&#39;de çözünür. </li><li> % 1 (m / v) insan serum albümini (HSA), HEPES Tyrode tamponu (pH 7.4) içinde çözülerek bloke edici tampon hazırlayın </li><li> 12 g gliserole 4.8 g polivinil alkol ilave ederek bir polivinil alkol çözeltisi yapın ve iyice karıştırın. 12 mL damıtılmış su ilave edin ve gece boyunca oda sıcaklığında bir rotatorda bırakın. <ol><li> 24 mL 0.2 M Tris-HCL, pH 8.5 ilave edin. 30 dakika karıştırılarak 50 ° C&#39;ye ısıtılır. 1.25 g 1,4-diazabisiklo [2.2.2] oktan (DABCO) ilave edin ve iyice karıştırın. 5 dakika boyunca 1,500 xg&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı (1 mL, 15-20 slayt için yeterlidir) alınız ve -20 ° C&#39;de saklayınız. Alikotları bir kez kullanın. </li></ol></li></ol> 2. Kapak Cam Hazırlığı <ol><li> Yağ alma örtüsü(25 x 50 mm2) gece boyunca seyreltilmemiş kromosülfürik asit içerisinde kuluçkalandı. Kapak gözlüklerini damıtılmış suyla durulayın ve bir gece boyunca 60 ° C&#39;de fırında kurutun. </li><li> Bir damla su ile bir laboratuar tezgahının üzerine bir parafin filmi şerit (10 x 15 cm2) yapıştırın ve parafin filmi yumuşatarak havayı alın. Parafin film üzerine 80 μL, 10 μg / mL VWF veya 100 μg / mL fibrinojenden pipetleyin. Gözlükleri damlaların üzerine yerleştirin; Protein çözeltisi iki yüzey arasında camın tüm arka tarafını örterek yayılır. Oda sıcaklığında (RT) 1.5 saat inkübe edin. </li><li> Parafin filmi çıkartın ve kaplama bardaklarını, kaplama yüzü bloke edici tamponlu 4 gözlü bir plakaya gelecek şekilde yerleştirerek bloke edin. 37 ° C&#39;de 1 saat veya gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. Kontrol olarak, VWF veya fibrinojen ile kaplanmamış bir kapak camını kapatın. </li></ol> 3. Trombositten zengin plazmanın (PRP) hazırlanması </p&gt; <ol><li> Sitrik tam kan (son konsantrasyon:% 0.32 sodyum sitrat (M / V)) damar tıkanması ile toplayın. </li><li> Kan 160 xg&#39;de ve frensiz 15 dakika boyunca santrifüje tabi tutun. Süpernatantı ( yani, PRP) bir plastik Pasteur pipeti ile toplayın. NOT: Santrifüjden sonra, üç kat (üstten alta doğru) gözlenebilir: PRP, beyaz kan hücreleri ve kırmızı kan hücreleri. Beyaz ve kırmızı hücreleri içermemeye dikkat edin. Tipik olarak 9 mL&#39;lik bir kan tüpünün santrifüj edildikten sonra 3 mL PRP toplanabilir. </li><li> Deney yıkanmış trombositler ile gerçekleştirilecekse bölüm 4&#39;e geçin. PRP isteniyorsa bir sonraki adıma geçin. </li><li> PRP toplandıktan sonra, kalan kanı (kırmızı hücre peletini içeren) santrifüj ederek frensiz 2.000 xg&#39;de 10 dakika tekrar santrifüjleyin. Trombosit zayıf plazması (PPP) içeren süpernatanı toplayın. NOT: Bu ikinci santrifüj adımından sonra tipik olarak 2 mL toplanabilir. </li><li> P sayısını sayLatelet&#39;leri bir hücre analizöründe analiz edin ve PPP (adım 3.4) ile 150.000 trombosit / μL konsantrasyonuna kadar sulandırın. NOT: Seyreltilmiş PRP&#39;nin toplam hacmi donörün trombosit sayısına bağlıdır. Trombosit sayıları vericiler arasında çok çeşitlidir ve PRP seyrelmesi bireysel bazda değerlendirme gerektirir. 150.000 ve 450.000 trombosit / μL&#39;de trombosit sayıları normal kabul edilir. </li><li> Bölüm 5&#39;e geçin. </li></ol> 4. Yıkanmış Trombositlerin Hazırlanması <ol><li> Bir hücre analizcisi kullanarak PRP&#39;deki ortalama trombosit hacmini (MPV) belirleyin. NOT: Bu, platelet ön-aktifleştirme 11&#39;in bir göstergesidir. Trombosit dinlenmesi için normal bir MPV 7.5-11.5 fL 11&#39;dir . MPV, trombosit yıkama prosedürü sırasında 1,5 fL&#39;den fazla artmamalıdır. </li><li> Trombosit ön-aktivasyonunu önlemek ve frensiz 400 xg ve RT&#39;de 15 dakika süreyle santrifüjlemeyi önlemek için PRP&#39;ye 1/10 hacim ACD ekleyin. Dosyayı kaldırPernatant hale getirin ve topağı HEPES Tyrode tamponunda (pH 6.5) özenle PRP&#39;nin orijinal hacmine yeniden askıya alın. </li><li> 10 ug / mL&#39;lik bir konsantrasyona TBS ilave ederek bir kısım prostasiklin çözülür; Buzda tutun </li><li> Trombosit aktivasyonunu önlemek için, yeniden askıya alınmış trombositlere 10 ng / mL&#39;lik bir nihai konsantrasyonda prostasiklin ekleyin ve hemen fren olmaksızın 400 xg&#39;de ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca santrifüje tabi tutun. Süpernatantı çıkarın ve peleti HEPES Tyrode&#39;un tamponu (pH 7.4) içinde dikkatle süspanse edin. </li><li> Trombosit sayısını sayın (adım 3.5) ve MPV&#39;deki değişikliği belirleyin (adım 4.1) (MPV, 1,5 fL&#39;den fazla değişmemelidir). </li><li> HEPES Tyrode tamponu, pH 7.4 ile trombosit sayısını 150.000 trombosit / μL konsantrasyona ayarlayın. Deneylerden önce oda sıcaklığında 30 dakika kadar iyileşmek için trombositleri bırakın. İzolasyondan 4 saat sonra yıkanmış trombositleri deneyler için kullanın. </li></ol> 5. Akış Odası Meclisi 12&#39;yi kullanmaktadır . Tercihen daha ileri analizler için çıkartılabilen bir kapak camı tuttuğu sürece, çeşitli ticari olarak üretilmiş akış bölmeleri kullanılabilir. Tanımlanan deneyler için kullanılan akış odası, mikroskop ekleme aşamasına tam olarak uyum sağlamak için poli (metil metakrilat) malzemesinden yapılmıştır. Giriş ve çıkış ( Şekil 1A - C ; 1, 2) ve vakum bağlantısı ( Şekil 1A ve C ; 3) içerir. Özelleştirilmiş bir silikon levha ( Şekil 1A ve D ; 4) üstüne yerleştirilir. Kapak camını ( Şekil 1A ; 6) odacığa sıkıca bağlamak için iki kesik boşluklar vakum kanalları oluşturur ( Şekil 1A ve D ; 5). Merkezi bir kesik akış kanalı oluşturur ( Şekil 1A </strong&gt; Ve D ; 7; 2.0 mm genişlik ve 0.125 mm yükseklik). Giriş ve çıkış akış kanalına bağlıdır ve vakum vakum kanalına bağlıdır. <ol><li> Akış odasının üst kısmını damıtılmış su ile örtün ve özelleştirilmiş silikon levhanın pürüzsüz yüzü aşağıda suya yerleştirin. Levhayı yerine koyarken fazla suyu çıkararak sayfayı yerlerine kaydırın. NOT: Bu silikon levha yeniden kullanılabilir (silikon, inert nitelikleri ile bilinir); Genellikle, trombositlerin ona tutunduğu gözlemlenmemiştir. Levhalar deterjanla temizlenebilir ve malzeme hasar görene kadar tekrar kullanılabilir (özellikle kanallar arasındaki alanda yırtılma). Genel olarak, bir sayfa, günde birden fazla deneyle 20 gün boyunca kullanılabilir. </li><li> Silah silikon levhasını akış odasına sıkıca yapıştırmak için artık odayı buharlaştırmak için akış odasını 60 ° C&#39;de 1 saat inkübe edin. </li><li> Bir plastik Pasteur pipetiyle bir damlaTyrode&#39;un tamponunu, pH 7.4&#39;ü akış kanalına geçirir. Kapak camını (bkz. Bölüm 2) kaplamalı yüzü aşağıda olacak şekilde akış kanalına yerleştirin. Vakum pompasını vakum bağlantısına takın ( Şekil 1A ve C ; 3). ~ 10 kPa basınç uygulayın. </li></ol> 6. Trombositlerin ön boyanması ve antikorların hazırlanması <ol><li> Trombosit boyama <ol><li> Karanlıkta 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca yıkanmış trombositleri 10 μg / mL DAPI ile inkübe edin. Bağlanmamış DAPI&#39;yı yıkamak ve trombosit aktivasyonunu önlemek için 10 ng / mL&#39;lik bir nihai konsantrasyonda prostasiklin ekleyin ve hemen 400 xg&#39;de ve frensiz RT&#39;de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Trombosit topağını HEPES Tyrode tamponu (pH 7.4) içinde 150.000 trombosit / μL trombosit konsantrasyonuna getirin. </li></ol></li><li> Antikorların hazırlanması <ol><li> Biyotinle etiketlenmiş antikoru Alexa ile etiketlenmiş strep ile karıştırın1: 1 molar oranda tavidin. Kullanmadan önce oda sıcaklığında minimum 10 dakika inkübe edin (adım 7.6). NOT: Biyotin etiketleme etkinliği farklı yığınlar arasında değişebilir. Hedef moleküllerin görselleştirilmesinde sorunlar olması durumunda, başarılı biotinleme ve spesifik biyotinlenmiş antikorun hedefe bağlanma özelliklerini teyit etmek için kontrol deneyleri yapılmalıdır. </li></ol></li></ol> Perfüzyon <ol><li> Floresan mikroskopu yanı sıra mikroskop yazılımı başlatmak. Tablo 1&#39;de listelenen mikroskop ayarlarını kullanın. NOT: Mikroskop yazılımında uygun bir deney yükleyerek, trombositlerin ve seçilen floresan etiketli antikorların ve / veya boyaların canlı hücre görselleştirilmesi ve kaydedilmesi için mikroskop ve kayıt ayarlarını başlatın. RT de akış deneyleri yapın. </li><li> 10 mL&#39;lik bir şırıngayı boruya bağlayarak ve% 1&#39;lik HSA bloğu emerek giriş tüpünü bloke edinTüpünü giriş borusuna sokun. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Giriş tüpünü, HEPES Tyrode tamponu, pH 7.4&#39;ü giriş borusuna aspire ederek durulayın. </li><li> Kapatılan giriş tüpünü ve işlenmemiş çıkış tüpünü, oda girişine ve çıkışına 1.02 mm çapında ve ~ 20-30 cm uzunluğunda bağlayın. Çıkış tüpüne 10 mL&#39;lik bir şırınga (veya daha düşük doğruluk için daha düşük hacim) bağlayın. Şırınga pompasını çalıştırın. NOT: Şırınganın çapı, pompa üzerinde ayarlanan akış hızı ile birlikte hacimsel akış hızını belirler. Akış kanalının yüzey alanı ile birlikte kesme oranı, formül 13&#39;e göre hesaplanabilir altında. Dolayısıyla şırınga pompasının akış oranını değiştirerek veya akış kanalının boyutlarını değiştirerek makaslama oranını değiştirmek mümkündür. Atım hızı 800-1,600 s -1 arteryel kan akışı için normalde modellenirken, venöz kan için 25 - 100 s-1 modelleriakar. Bu kurulum için, 7.5 μL / dak&#39;lık bir akış hızı, 25 s -1&#39;lik bir makaslanma oranına neden olur. Makaslama hızı = s-1&#39;de 6Q / saat 2 w Burada: Q = hacimsel akış oranı (mL / s), h = yükseklik kanalı (cm) (0.0125 cm, silikon levhanın kalınlığıdır), w = genişlik kanalı (cm) (bu bölmede 0.2 cm). </li><li> 100X&#39;lik bir objektif üzerine bir damla daldırma yağı yerleştirin (1.000X&#39;lik toplam amplifikasyon) ve cam yüzeyi aşağı bakacak şekilde mikroskop üzerine oda monte edin. </li><li> Giriş hortumunu, HEPES Tyrode tamponu, pH 7.4 içeren bir tüp içine yerleştirin. Çıkış tüpüne bağlı şırınganın pistini elle çekin ve havayı sistemden çıkarmak için odanın içinden çözeltiyi çekin. Şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin ( Şekil 1B ve C ; 8) ve pompayı kısaca çalıştırarak pistonu sıkıştırın ve dengeli akış sağlayın. </li><li> Trombosit süspansiyonuna veya PRP&#39;ye antikorlar ve / veya boyalar ekleyin, dikkatlicePlastik bir pipetle karıştırın ve karışımı 1.5 mL&#39;lik bir tüpe aktarın. NOT: Kesme hızında 25 s-1 (7.5 μL / dak) olan tipik bir 30 dakikalık perfüzyon için minimum 225 μL trombosit süspansiyonu gerekir. Temsili sonuçlar için kullanılan antikorlar Tablo 2&#39;de gösterilmektedir. </li><li> Giriş tüpünü sıkarken HEPES Tyrode tamponu pH 7.4&#39;den, ya PRP ya da yıkanmış trombositleri, antikorları ve / veya boyaları ( Şekil 1B ve C ; 9) içeren 1.5 mL&#39;lik bir tüpe getirin. NOT: Havanın hortuma girmesini engellemek için hortumun transferinde hortumun sıkıştırılması (havanın bastırılması) önemlidir. Yapışkan trombositleri, çeşitli yöntemlerle, bir sonraki aşamada, benzer bir şekilde başka bir tüpe aktarılarak işleme tabi tutmak mümkündür. Potansiyel olarak yararlı reaktiflerin bir listesi Tablo 3&#39;te verilmiştir . </li><li> &quot;Canlı görselleştirme&quot; yi seçinN &quot;seçeneğine basın, mikroskopı kaplanmış kaplama camının yüzeyine odaklayın ve trombositler akış odasına ulaşıncaya kadar 1,600 s-1 (484 μL / dak) kesme hızında pompaya başlayın.Bu anda, Şırınga pompasının ayarlarını 7,5 μL / dak&#39;lık bir akış oranına değiştirerek makaslama oranını 25 s-1&#39;e düşürün. </li><li> Kapak camının kaplanmış tarafının yüzeyini izleyin, ilk trombositlerin yapışmasına başlamasını bekleyin, mikroskopu bu trombosit üzerinde odaklayın ve yazılımı yazılımda denemeyi başlatarak kayıt işlemine başlayın. Burada kullanılan kayıt ayarları için Tablo 1&#39;e bakın. </li><li> Canlı kaydı görsel olarak takip edin. 30 dakika sonra şırınga pompasını durdurun. NOT: Deney süresince trombositlerin odakta kalmasını sağlayın. Tipik olarak, 20-30 trombositler 1,000X&#39;lık bir büyütme oranında görüş alanına eklenir; Bu akış kanalının tamamında yaklaşık 2.000-3.000 trombosittir. </li><li> Kullanarak sabitlemeAkış odası (isteğe bağlı). <ol><li> Şırınga pompası durdurulduktan sonra akış durdurulduğunda, giriş tüpünü (hava ücretsiz) sabitleme solüsyonuna aktarın. Pompayı tekrar başlatın ve sabitleme tamponunu 7.8. Adımda belirtildiği gibi aynı akış hızında en az 10 dakika kanal boyunca akıtırın. </li></ol></li><li> Mikroskop odasını çıkarın, daldırma yağı camdan temizleyin, vakum bağlantısını kesin ve 18 G&#39;lik bir iğne ile kapak camını bölmeden dikkatli bir şekilde çıkarın. NOT: Kapak camının silikon tabakasını kırıp hasar görmesini önleyin. </li><li> Kapak sürgüsünü (hücreleri yukarı doğru yönlendirdikçe) damıtık suyla önceden ıslatılmış bir doku üzerine 4 oyuklu bir plakaya yerleştirin. NOT: Bu, kapak camının kuyu yüzeyine yapışmasını önler ve kurumayı engeller. </li><li> Kapak camının üzerine fiksatif çözelti 750 μL Pipetleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Numunelerin doğrudan analiz edilememesi durumunda,Sabit fiksasyon sağlamak için 4 ° C&#39;de% 0.5 PFA (HEPES Tyrode tamponu, pH 7.4 ile seyreltilmiş) içinde saklayın. Görüntüleme için kapak camını işlemek için 8. bölüme geçin. </li><li> Kullandıktan sonra, bölmeyi, boruyu ve tabakayı damıtılmış suyla durulayın ve bir gece boyunca bir deterjan çözeltisi içerisinde inkübe edin. Hazne ve diğer bileşenlerin tekrar kullanılmadan önce damıtılmış su ile yıkayın. </li><li> Tüm meta verileri içeren mikroskop ham veri dosyalarını kaydedin. Gerektiğinde, filmleri .MOV, h.264 sıkıştırılmış veya .AVI sıkıştırılmamış olarak dışa aktarın. Ayrı kareleri JPEG veya TIF dosyaları olarak kaydedin. </li></ol> 8. Konfokal Floresan Mikroskopi için Örnek Hazırlama <ol><li> Kapak gözlüklerini yeni 4 yuvalı plakalara aktarın ve 5 mL 3 mL HEPES Tyrode tamponu, pH 7.4 ile durulayın. 3 mL / oyuk bloke edici tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> Bloke edici tamponu kaldırın; HEPES Tyrode tamponu (pH 7.4) içinde 3 mL / oyuk% 0.15 glisin (M / V) ilave edin; Ve 15 dakika boyunca R&#39;de inkübe edinT. </li><li> Glisin çözeltisini çıkarın ve bloke edici tamponun 3 mL / çukurunda 5 kez yıkayın. İsteğe bağlı olarak, ek boyama için bloke edici tamponda seyreltilmiş fluorofor-konjuge antikorlar ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> Blok tamponu ile 5 kez ve damıtılmış su ile 2 kez yıkayın. Fazla sıvıyı bir doku ile (kenarlardan içe doğru) hücreye dokunmadan kaldırarak camı kurutun. </li><li> Mikroskop slayt üzerine 60 μL polivinil alkol solüsyonu pipetleyin. Kapak camını, hücrelerin aşağı gelecek şekilde damla üstüne koyun ve polivinil alkolün iki yüzey arasında dağılmasına izin verin. Gece boyunca karanlıkta RT kuluçkalayın. </li><li> Konfokal mikroskopi ile hücreleri analiz 14 . </li><li> Tüm meta verileri içeren kaydedilmiş yığın verisinin ham veri dosyalarını kaydedin. Gerektiğinde, ham veri dosyalarını MOV, h.264 sıkıştırılmış veya .AVI sıkıştırılmamış dosyalar olarak işleyin. Ayrı yığınları JPEG veya TIF dosyaları olarak kaydedin. </li></ol>

<ol><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((von+Willebrand+factor%2C+Jedi+knight+of+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li>
<li>Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+granule+exocytosis%3A+a+comparison+with+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11(2013).</li>
<li>May, B., Menkens, I., Westermann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+release+of+serotonin+and+histamine+from+blood+platelets+of+the+rabbit+by+aliphatic+and+aromatic+amines%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines.</a> Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).</li>
<li>Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+C1-+inhibitor.+A+secreted+alpha-granule+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein.</a> J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).</li>
<li>Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+angiogenesis+regulatory+proteins+from+platelet+alpha+granules%3A+modulation+of+physiologic+and+pathologic+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis.</a> Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).</li>
<li>Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+immunofluorescence+mapping+reveals+little+functional+coclustering+of+proteins+within+platelet+%CE%B1-granules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules.</a> Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).</li>
<li>Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfusion+chamber+developed+to+investigate+platelet+interaction+in+flowing+blood+with+human+vessel+wall+cells%2C+their+extracellular+matrix%2C+and+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components.</a> J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).</li>
<li>Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Flow+Chambers+Using+Reconstituted+Blood+to+Model+Hemostasis+and+Platelet+Transfusion+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).</li>
<li>Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphate+colocalizes+with+factor+XII+on+platelet-bound+fibrin+and+augments+its+plasminogen+activator+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity.</a> Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).</li>
<li>Park, Y., Schoene, N., Harris, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mean+platelet+volume+as+an+indicator+of+platelet+activation%3A+methodological+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues.</a> Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).</li>
<li>Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+perfusion+chamber+to+detect+platelet+adhesion+using+a+small+volume+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood.</a> Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).</li>
<li>Slack, S. M., Turitto, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+chambers+and+their+standardization+for+use+in+studies+of+thrombosis.+On+behalf+of+the+Subcommittee+on+Rheology+of+the+Scientific+and+Standardization+Committee+of+the+ISTH%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH.</a> Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).</li>
<li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+confocal+microscopy%3A+present+technology+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends.</a> Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).</li>
<li>Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+CD63+is+in+platelet+dense+granules%2C+is+deficient+in+a+patient+with+Hermansky-Pudlak+syndrome%2C+and+appears+identical+to+granulophysin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin.</a> J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).</li>
<li>Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+dense+granules+contain+polyphosphate+and+are+similar+to+acidocalcisomes+of+bacteria+and+unicellular+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes.</a> J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).</li>
<li>Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+von+Willebrand+Factor+under+Control%3A+Alternatives+for+ADAMTS13%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13.</a> Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).</li>
<li>Tersteeg, C., de Maat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+cleavage+of+von+Willebrand+factor+as+an+emergency+bypass+for+ADAMTS13+deficiency+in+thrombotic+microangiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy.</a> Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).</li>
<li>Basir, A., de Groot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Hemocompatibility+Testing+of+Dyneema+Purity+Fibers+in+Blood+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22Innovations+%28Phila%29%22%5BJournal%5D)">In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact.</a> Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Dünya çapında tromboz önde gelen ölüm ve morbidite nedenidir ve trombositler gelişiminde merkezi bir rol oynamaktadır. Bu çalışma akış altında trombosit degranülasyonunun canlı hücre görüntülemesi için bir yöntemi açıklamaktadır. Genellikle, trombositler harekete geçirildiğinde, tüm granül içeriği çözeltiye doğrudan salınır. Eşlik eden sonuçlar bunun mutlaka geçerli olmadığını göstermektedir. Yapışma ve degranülasyon sırasında, trombositler önemli miktarda polifosfat tutar ( Şekil 4 ). Ek olarak, multim...

Trombositler kan akışında dolaşan anükleat hücrelerdir. Ana işlevi yaralanma yerlerinde vasküler yaraları kapatmak ve kan kaybını önlemektir. Bu yaralanma yerlerinde, subendotelyal kollajen lifleri maruz kalır ve daha sonra multimerik protein olan von Willebrand faktörü (VWF) ile kaplanır. VWF, trombosit hızını yavaşlatan hücre yüzeyi 1 üzerindeki glikoprotein Ibα-IX-V kompleksine bağlı olan bir mekanizma içinde dolaşımdaki trombositler ile etkileşime girer. Bu, yüksek makaslama hızlarında özellikle önemlidir. Trombositler daha sonra kollajenden aktive edici uyaranlar alırken morfolojik değişiklikler yaparlar. Bu, geri döndürülemez yayılma ve nihayetinde platelet toplanmasına yol açar. Her iki işlem de trombosit-platelet çapraz-tokuşunu kolaylaştırmak için granül içeriğinin salgılanmasına bağlıdır. Diğerleri arasında platelet a-granülleri trombosit yapışmasına ve köprüye yardımcı olmak için fibrinojen ve VWF içerirTrombositler integrin bağımlı bir şekilde bir araya getirilir. Trombosit yoğun granülleri, trombosit aktivasyonunu güçlendirmeye yardımcı olan inorganik bileşikler 2 , kalsiyum ve adenosin difosfat (ADP) içerir. Ayrıca, trombositler, (alerjik) inflamasyon 3 , komplement kontrol proteinleri 4 ve anjiyogenez faktörleri 5,6 olan aracı maddeleri içerirler ve bu içeriklerin farklı koşullar altında farklı şekilde serbest bırakılıp bırakılmadığı ve nasıl verildiğine ilişkin sorular ortaya çıkarır. 1980&#39;lerden bu yana, akım modellerinde platelet fonksiyonu çalışması, tromboz mekanizmalarının araştırılması için değerlidir7. O zamandan beri, çok teknik ilerleme kaydedildi ve fibrin oluşumunu içeren akış modelleri şu anda, terapötik trombosit konsantratlarının ex vivo 8 hemostatik potansiyelini test etmek için geliştirildi veyaKesilme hızlarındaki bozulmaların tromboz morfolojisi üzerindeki etkisini araştırır 9 . Stabil yapışma ve fizyolojik tromboz oluşumuna (hemostaz) neden olan patolojik tromboz oluşumuna (tromboz) neden olan moleküler ve hücre-biyolojik mekanizmalardaki farklılıklar çok ince olabilir ve bu subselülerlerin gerçek zamanlı görselleştirilmesine izin veren akış modelleri gelişimini motive edebilir süreçler. Böyle bir kurulumun değerli olacağı bir işlem örneği, hücre içi polifosfatın yeniden (yeniden) dağılımı ve bunun fibrin ultrastrüktürü 10 üzerindeki zaman etkisine bağlı etkiyi ortaya çıkarmak için pıhtılaşma faktörlerinin alınmasıdır. Çalışmalar genellikle son nokta analizleriyle sınırlıdır. Açıklanan yöntemin asıl amacı, trombosit aktivasyonu sırasında akım altında gerçekleşen dinamik subselüler süreçlerin gerçek zamanlı görsel incelemesini sağlamaktır.

<table><tbody><tr><td>4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO<>sub4</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck KGaA</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>D-glikoz</td><td>Merck KGaA</td><td>1.04074</td><td></td></tr><tr><td>Prostasiklin&nbsp;</td><td>Cayman Chemical</td><td>18220</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodyum sitrat</td><td>Merck KGaA</td><td>1.06448</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik asit&nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>1.00244</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camları</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>BBAD02400500#A</td><td>24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm kalınlık.</td></tr><tr><td>Kromosülfürik asit (% 2 CrO3)</td> <td>Riedel de Haen</td><td>07404</td><td>CAS [65272-70-0].</td></tr><tr><td>Von Willebrand faktörü (VWF)</td> <td>kurum içi saflaştırılmış</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinojen</td><td>Enzim Araştırma Laboratuvarları</td><td>FIB3L</td><td></td></tr><tr><td>4 kuyulu çanak, işlenmemiş</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Serumu Albümin Fraksiyonu V</td><td>Haem Technologies Inc.</td><td></td><td></td>823022</tr><tr><td>Kan alma tüpleri, 9 mL, 9NC Pıhtılaşma Sodyum Sitrat %3.2</td> <td>Greiner Bio-One</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>Hücre analizörü</td><td>Abbott Diagnostics</td><td>CELL-DYN hematoloji analizörü</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>30525-89-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>Harvard Aparatı, Holliston, MA</td><td>Harvard aparatı 14,5</td> mm çapında BD biosciences ile 22 <td></td></tr><tr><td>10 mL şırınga</td><td></td><td>305959</td><td>Luer-Lok şırınga</td></tr><tr><td>Anti-CD63-biotin&nbsp;</td><td>Abcam&nbsp;</td><td></td><td></td>AB134331</tr><tr><td>Anti-CD62P-biotin ve nbsp;</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>Dy137</td><td></td></tr><tr><td>4 ',6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür (DAPI)</td> <td>Polysciences Inc.&nbsp;</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 eşlenik</td><td>Thermo Scientific</td><td>S11223&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Daldırma yağı</td><td>Zeiss</td><td>444963-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Deterjan çözeltisi</td><td>Unilever, Biotex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>56-40-6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Polivinil alkol</td><td>Sigma</td><td>9002-89-5</td><td>Mowiol 40-88.</td></tr><tr><td>Tris hidroklorür</td><td>Sigma</td><td>1185-53-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Diazabisiklo[2.2.2]oktan (DABCO)</td><td>Sigma</td><td>280-57-9</td><td></td></tr><tr><td>Koyun Anti-hVWF pAb</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>AB9378</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Parafinn filmi</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>4 inç x 125 ft Rulo.</td></tr><tr><td>Silikon levha, takviyesiz,</td><td>Nagor</td><td>NA 500-1</td>, <td>200 mm x 150 mm x 0.125 mm.</td></tr><tr><td>Perfüzyon ve vakum kanalları ile özel kesim silikon levha</td><td>şirket içinde yapılmıştır</td><td></td><td>Silikon levhadan yapılmıştır takviyesiz (Nagor, NA 500-1)</td></tr><tr><td>1.5 mL tüpler</td><td>Eppendorf AG</td><td>T9661-1000AE</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskop</td><td>Zeiss Observer Z1&nbsp;</td><td></td><td>LED uyarma ışıkları ile donatılmıştır.</td></tr><tr><td>Mikroskop yazılımı</td><td>Zeiss ZEN 2</td><td>blue edition</td><td></td></tr><tr><td>18 G iğne (18 G x 1 1/2 "")</td> <td>BD biosciences</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Riedel de Haen</td><td>31248375</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>10708976</td><td></td></tr><tr><td>Plastik pastör pipeti</td><td>VWR</td><td>612-1681&</td><td>nbsp; 7 mL steril olmayan, 3 mL'ye kadar derecelendirilir.</td></tr><tr><td>Silikon boru</td><td>VWR</td><td>228-0656</td><td>İç çap. x Dış çap x Duvar kalınlığı = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm.</td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>Thermo Scientific</td><td>ABAA000001##12E</td><td>76 x 26 x 1 mm, zemin kenarları 45 >, buzlu uç.</td></tr></tbody></table>

akım altında trombosit degranülasyonu ve salgılamanın canlı hücreli görüntüleme

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Kan trombositleri, hemostazda vasküler ihlalleri gidermek için trombüs oluşumu için önemli oyunculardır. Ayrıca tromboz, vaskülatürü tıkayan tromboz oluşumu ve organları yaralamaya, hayati tehlike oluşturan sonuçlarla ilgilenmektedirler. Bu, trombosit fonksiyonu ve akış koşulları altında gerçekleşen hücre biyolojik süreçlerini izlemek için yöntemlerin geliştirilmesi üzerine bilimsel araştırmalara motive olur. Trombosit yapışması ve toplanması, trombosit biyolojisinde iki temel olgu çalışması için çeşitli akış modelleri mevcuttur. Bu çalışma aktivasyon sırasında akım altında gerçek zamanlı trombosit degranülasyonunu incelemek için bir yöntem açıklamaktadır. Yöntem, geniş alanlı, ters çevrilmiş, LED tabanlı floresan mikroskop altında yerleştirilen bir şırınga pompası kurulumuna bağlı bir akış odası kullanır. Burada açıklanan kurulum, flüoresan etiketli antikorlar veya fluoresc tarafından gönderilen birden fazla florofor eşzamanlı uyarılmasına olanak tanırBoyalar. Canlı hücre görüntüleme deneylerinden sonra kapak gözlükleri statik mikroskopi ( örn. Konfokal mikroskopi veya taramalı elektron mikroskobu) kullanılarak daha da işlenebilir ve analiz edilebilir.

Şekil 1 , akış odasının görüntülerini ve deney düzeneğini göstermektedir; Silikon levhanın konumu ve boyutları; Ve hortum bağlantıları. Şekil 2 , akış haznesinin boyutlarıyla ilgili ayrıntılar sunmaktadır. Şekil 3 ve Film 1 , platelet yapışmasının ve sabitlenmiş VWF üzerine yayılma görüntülerinin bir zaman serisini göstermektedir. CD63, dinlenme plateletlerinin hücre içi yoğun tanec...

Bu çalışma, trombosit yapışması, yayılması ve akış altında salgı çalışması için bir floresan mikroskopi tabanlı yöntem açıklanmaktadır. Bu çok yönlü platform tromboz ve hemostaz üzerine mekanik araştırma için trombosit fonksiyonunun araştırılmasını sağlar.

Akım altında Trombosit Degranülasyonu ve Salgılamanın Canlı Hücreli Görüntüleme

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Bu deneyin genel amacı, canlı hücre görüntüleme kullanarak akış altındaki trombosit degranülasyonunu ve sekresyonunu takip etmektir. Bu yöntem, trombosit biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, canlı hücrelerdeki trombosit içeriklerinin hücre altı düzeyde çok yönlü bir şekilde incelenmesine olanak tanımasıdır.Bu yöntem trombosit fonksiyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, mast hücreleri gibi diğer hücre tiplerine de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, ön aktivasyon şeklinde gerçekleşen trombosit izolasyonu sorunları nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, trombosit sekresyonunun yalnızca uç nokta aşamalarında değerlendirilebildiğini fark ettiğimizde ortaya çıktı.Gerçek zamanlı görüntüler, trombosit granüler salınımının salınım kinetiği hakkında bilgi sağlar. Trombosit izolasyon prosedürü, enstitümüzden öğrenci Silvia Pignatelli tarafından gösterilecektir. Ardından, Arjan Barendrecht gerçek zamanlı görüntüleme deneylerini gerçekleştirecektir.Başlangıç olarak, lamine camları seyreltilmemiş kromosülfürik asit içinde gece boyunca inkübe ederek yağdan arındırın. Ertesi gün, bunları distile su ile durulayın. Ardından, kurumaları için bir fırında 60 °C'de gece boyunca bekletin.Ardından, laboratuvar tezgahına bir damla su yerleştirin ve tezgah ile film arasındaki havayı uzaklaştırarak damlanın üzerine 10 santimetre x 15 santimetre boyutunda bir parafin film şeridi yapıştırın. Daha sonra, parafin filmin üzerine 80 µL'lik 10 µg/mL von Willebrand faktörü veya 100 µg/mL fibrinojen damlaları pipetleyin. Kuru lamelleri damlaların üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında bir buçuk saat boyunca inkübe edin.Ardından, dört kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa üç mililitre bloklama tamponu ekleyin. Kaplama yapılmış yüzeyleri yukarı gelecek şekilde lamine camları plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. Bunları dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin.Dokuz mililitre sitratlı tam kanı, frenlemesiz olarak 160 xg'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, trombosit bakımından zengin plazma içeren süpernatantı toplamak için plastik bir Pasteur pipeti kullanın. Trombositlerin ön aktivasyonunu önlemek için, hacimce dokuz birim trombosite bir birim asit sitrat dekstroz ekleyin.Ardından trombositleri, ara vermeden 400 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Sonra, trombosit peleti kalacak şekilde süpernatantı uzaklaştırın. Daha sonra peleti, 6.5 pH değerine sahip HEPES Tyrode tamponu içinde, trombosit örneğinin orijinal hacmine geri dönecek şekilde dikkatlice yeniden süspanse edin.Ardından, resüspande edilmiş trombositlere Prostacyclin ekleyin. Örneği hemen santrifüjleyin ve ardından süpernatantı uzaklaştırın. Pelleti, pH değeri 7.4 olan HEPES Tyrode tamponunda dikkatlice resüspande edin.Ardından, yıkanmış trombositleri bir hücre analizörüne yerleştirin ve trombosit sayısını belirleyin. Örnekteki trombosit sayısını, pH değeri 7.4 olan HEPES Tyrode tamponu kullanarak mikrolitre başına 150.000 trombosit konsantrasyonuna ayarlayın. Resüspansiyon işleminden sonra, trombositleri deneyden önce oda sıcaklığında 30 dakika boyunca dinlenmeye bırakın.Akış odasının üst kısmını distile su ile kaplayın ve pürüzsüz tarafı aşağı gelecek şekilde özelleştirilmiş bir silikon levhayı suyun üzerine yerleştirin. Levhayı konumunda tutarken fazla suyu uzaklaştırarak levhanın yerine yerleşmesini sağlayın. Kalan suyun buharlaşması ve silikon levhanın akış odasına sıkıca yapışması için akış odasını 60 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.Plastik Pasteur pipeti ile akış kanalına pH 7,4'te bir damla HEPES Tyrode tamponu ekleyin. Ardından, hazırlanan lamelliği kaplı tarafı aşağı gelecek şekilde akış kanalının üzerine yerleştirin. Vakum pompasını yaklaşık 10 kilopascal basınca ayarlayarak çalıştırın ve vakum pompasını akış hücresinin vakum bağlantısına bağlayın.Yıkanmış trombositlere mililitre başına 10 mikrogram DAPI boyası ekleyin ve trombositleri içeren tüpü alüminyum folyo ile sarın. Ardından, bunları 37 derece Celsius'ta 30 dakika boyunca inkübe edin. Trombosit aktivasyonunu önlemek için, nihai konsantrasyonu mililitre başına 10 nanogram olacak şekilde prostasiklin ekleyin ve bağlanmamış DAPI'yi uzaklaştırmak için trombositleri fren kullanmadan 400 kez G'de 15 dakika boyunca hemen santrifüjleyin.Trombosit peletini ve pH'ı 7.4 olan HEPES Tyrode tamponunu, mikrolitre başına 150.000 trombosit konsantrasyonu ile orijinal hacme getirin. Ardından, floresan mikroskobunu açın ve mikroskop yazılımını yükleyin. Görüntüleme parametrelerini, beraberindeki metin protokolünün birinci tablosunda açıklandığı şekilde ayarlayın.10 mililitrelik bir şırınga bağlayıp giriş tüpüne bloklama tamponu aspire ederek giriş tüpünü tıkayın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bloklayın ve ardından giriş tüpüne HEPES Tyrode tamponu 7.4 aspire ederek giriş tüpünü durulayın. Bloklanmış giriş tüpünü ve işlem görmemiş çıkış tüpünü, haznenin giriş ve çıkışlarına bağlayın.Ardından 10 mililitrelik şırıngayı çıkış borusuna bağlayın. 100 kat objektifin üzerine bir damla immersiyon yağı damlatın ve hücre odasını, cam yüzeyi aşağıya bakacak şekilde mikroskoba yerleştirin. Sonrasında, giriş borusunu pH değeri 7.4 olan HEPES Tyrode tamponu içeren bir tüpün içine yerleştirin.Çıkış borusuna bağlı şırınganın pistonunu manuel olarak çekerek çözeltiyi hazne boyunca çekin ve sistemdeki havayı tahliye edin. Ardından şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin ve pistonun sıkılaşmasını ve akışın stabilize olmasını sağlamak için pompayı kısa bir süre çalıştırın. Akış sistemi hazır olduğunda, antikorları ve/veya boyaları trombosit süspansiyonuna ekleyin ve dikkatlice karıştırın.Ardından giriş tüpünü sıkın ve tampon çözeltiden işaretli trombositleri içeren tüpe taşıyın. Yazılımda canlı görüntülemeyi seçin. Mikroskobu lamella yüzeyine odaklayın ve pompayı dakikada 484 µL hızda çalıştırın.Trombositler akış odasına ulaşana kadar pompayı çalıştırın. Ardından, akış hızını 7,5 microliters per minute seviyesine düşürün. Lamyör yüzeyini izleyin.İlk trombosit yapışmaya başladığında, mikroskobu bu trombosite odaklayın ve yazılım üzerinden deneyi başlatarak kayda geçin. 30 dakika boyunca kayıt yapın ve ardından şırınga pompasını durdurun. Tüm meta verileri içeren mikroskop ham veri dosyalarını kaydedin.Gerektiğinde, videoları MOV H 264 sıkıştırılmış veya AVI sıkıştırılmamış formatında dışa aktarın. Ayrı kareleri JPEG veya TIF dosyaları olarak kaydedin. Görüntüleme işlemi tamamlandığında, hazneyi mikroskoptan çıkarın, cam üzerindeki imersiyon yağını temizleyin, vakumu kesin ve 18 gauge bir iğne ile örtü camını hazneden dikkatlice çıkarın.Hücreler yukarıya bakacak şekilde konumlandırılmış olan lamel kapağını, distile su ile önceden ıslatılmış bir doku üzerine, yeni bir dört kuyucuklu plakaya yerleştirin. Ardından, lamel kapağının üzerine 750 µL fiksasyon çözeltisi pipetleyin ve oda sıcaklığında, karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin. Numunelerin doğrudan analiz edilemediği durumlarda, stabil fiksasyon sağlamak için 4 °C'de %0,5 paraformaldehit içerisinde saklayın.Bu görüntü, immobilize edilmiş von Willebrand faktörü ile kaplanmış cam lamlar üzerindeki trombosit adezyonunun ve yayılımının zaman serisini göstermektedir. Yeşil renkte gösterilen CD63, trombosit yüzeyine zamana bağlı olarak mobilize olan bir transmembran proteindir. Benzer şekilde, turuncu renkte gösterilen P-selektin de trombositleri durduran hücre içi alfa-granüllerin membranına yerleşmiş bir transmembran proteindir.Bir akış deneyini takiben, trombosit yapışmasının eğim serisini (tilt series) oluşturmak için konfokal floresan mikroskobu kullanılabilir. Burada görüldüğü üzere, CD63 esas olarak merkezi granülomerde yer alırken, P-selektin tüm hücre gövdesine dağılmış durumdadır ve kenarlarda yoğunlaşmış görünmektedir. Bu deneylerde, nükleer DNA'sı olmayan trombositler, mavi renkte görünen DAPI ile ön inkübasyona tabi tutulmuştur.Bu durumda, DAPI polifosfatları ve yoğun granülleri boyar. Daha sonra yeşil boyama olarak görülen durum, CD63'ün trombosit yüzeyine zamana bağlı mobilizasyonudur. Yoğun granül salınımının belirgin belirtilerine rağmen, tek hücre analizi polifosfatın bu trombositlerin içinde veya dışında tutulduğunu göstermektedir.Bu teknik uzmanlaşıldığında, dört ayrı akış deneyi için altı saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, trombositlerin ön aktivasyonunu önlemek önemlidir. Bu, hücre süspansiyonunun dikkatli bir şekilde manipüle edilmesiyle sağlanabilir.Bu prosedürün ardından, hedef moleküllerin üç boyutlu dağılımı hakkında ek bilgiler edinmek için konfokal mikroskopi gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, tek hücre düzeyinde akış altında trombosit fonksiyonlarının nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

live-cell-imaging-of-platelet-degranulation-and-secretion-under-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Trombosit adezyon kaskad kayma akışı varlığında yer alır, konvansiyonel (statik) iyi plaka deneyleri için bir faktör değildir. Bu makale, fizyolojik kesme akış koşulları taklit etmek için iyi bir mikroakışkan plaka formatı kullanan bir trombosit agregasyonu tahlil raporları.

Mikroakışkan Akış Hücreler kullanarak Akış altında Trombosit Yapışma ve toplama

Burada vasküler inflamasyon ve canlı farelerde trombüs oluşumu sırasında aktive endotel üzerindeki heterotipik trombosit-nötrofil etkileşimleri görselleştirmek için floresan intravital mikroskobu deneysel bir tekniktir rapor. Bu mikroskobik teknoloji vasküler hastalığın moleküler mekanizmasını incelemek ve patofizyolojik durumlardaki farmakolojik ajanları test için değerli olacaktır.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Lökositler paraselüler veya transselüler yolu kullanarak endotel tek tabaka çapraz. Biz endojen junctional dağıtım VE-kaderin ve PECAM-1 lökosit transendotelyal göç sırasında fizyolojik akış altında iki âlemden yolları arasında ayrım için takip basit bir deney geliştirildi.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Trombosit transfüzyonu ve hemostazı, kan bankacılığı trombositlerinin işlevini araştırmak için kan sulandırma ve mikroakışkan akış odaları kullanılarak modellendi. Veriler, trombosit depolama lezyonunun in vitro olarak hemostaz üzerindeki sonuçlarını göstermektedir.

Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma<em&gt; İn Vitro</em

Bu makale aynı zamanda trombosit fonksiyonu ve pıhtılaşmayı ölçen hemostaz deneysel model tanımlamaktadır. Trombosit ve fibrin floresans gerçek zamanlı olarak ölçülür ve platelet yapışma oranı, bir pıhtılaşma hızının, pıhtılaşma başlangıcı belirlenir. Model transfüzyonu için konsantreleri akışı altında trombosit prokoagülan özelliklerini belirlemek için kullanılır.

Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Lökosit heyecanla damar hücreleri ve trombositlerin damar duvar yaralanma sonra veya enflamasyon sırasında etkileşim. Burada, lökosit ve hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmek için basit bir laminar akış tabanlı tahlil açıklayın.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

Koni plaka Viskozimetre kullanılarak trombosit yüzey reseptörlerine Tekdüzen kesme uygulamak için bir çözüm içi yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, diğer hücre türlerine ve hücre parçalara kesme uygulamak için daha geniş ölçüde kullanılabilir ve belirli bir ligand-reseptör çifti hedeflemek gerekmez.

Koni-plaka viskozimetre ile ınsan trombosit ve hücre yüzeyi reseptörleri için Tekdüzen kesme tahlil

Burada iki fotonlu mikroskopi kullanarak canlı farelerin kafatası kemiğinin iliğindeki megakaryositleri ve proplateletleri görüntüleme yöntemini açıklıyoruz.

In Vivo Fare Kafatası Kemik İliği'nde Megakaryositlerin ve Proplateletlerin İki FotonLu Görüntülemesi

Prokoagülan trombosit oluşumu, artmış tromboz riski ile ilişkilendirilmiştir. Burada, prokoagülan trombositlerin ayırt edici özellikleri olan fosfatidilserin ve mikrovezikül salınımının maruziyetini ölçmeyi amaçlayan, yıkanmış trombositleri insan kanından izole etmek için kesin bir protokol sunulmaktadır.

İnsan Saflaştırılmış Trombositlerinden Fosfatidilserin Maruziyeti ve Mikrovezikül Salınımının Ölçülmesiyle Prokoagülan Trombosit Karakterizasyonu

Akış altındaki trombosit fonksiyonu değerlendirilebilir ve simüle edilmiş hemostatik resüsitasyon, travma ve transfüzyon tıbbında uygulamaları olan bir mikroakışkan cihaz kullanılarak modellenebilir.

Trombosit Fonksiyonunun Değerlendirilmesinde Mikroakışkanlar

Trombositler için çok renkli akış sitometrisi, klasik trombosit alt popülasyonları içinde istirahat, agregatör, prokoagülan ve apoptotik trombositler gibi yeni trombosit alt tiplerini tanımlayabilir. Bu, çeşitli trombosit agonistleri tarafından indüklenen farklı alt popülasyon modellerinin karşılaştırılmasına izin verir. Burada, çok renkli bir akış sitometrisi paneli oluşturmak için bir prosedür ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Trombosit Alt Popülasyonlarının Çok Renkli Akış Sitometrisi ile Analiz Edilmesi

Öğrenin trombosit degranülasyonunu ve salgılamasını akım altında canlı hücre görüntüleme ile. Bu yöntem, tromboz ve hemostaz mekanizmalarını araştırmak için değerli bir platform sunar.

Akım altında Trombosit Degranülasyonu ve Salgılamanın Canlı Hücreli Görüntüleme

Daha fazla video keşfet