April 17th, 2017
Burada tarif afinite ve dört yaygın biçimde kullanılan biyosensör platformları kullanarak kinetiği bağlayıcı antikor-antijen ölçümü için protokolleri.
Bu biyosensör çalışmasının amacı, rutin olarak kullanılan dört biyosensör platformunun kaliteli kinetik veri sağlama yeteneğini karşılaştırmak ve yüksek afiniteli antikor-antijen etkileşimlerini değerlendirmek için deneysel tasarımlardaki teknik zorluklar ve hususlar hakkında içgörüler sağlamaktır. Bu çalışma, terapötik antikor adaylarını değerlendirirken en güvenilir sonuçlara izin veren biyosensör platformlarının ve test formatlarının seçimi için ilaç keşfi alanındaki temel soruları yanıtlamaktadır. Bu çalışmanın temel avantajı, veri tutarlılığı, kalitesi ve operasyonel verimlilik açısından çeşitli biyosensör platformlarının doğrudan ve kapsamlı bir karşılaştırmasını sağlamasıdır.
Dört protokolün video gösterimi, çok az uygulamalı deneyime sahip yeni kullanıcıların bu cihazlar üzerinde nasıl deney yapacaklarını öğrenmelerine yardımcı olduğu için kritik öneme sahiptir. Biacore T100'deki kinetik ölçümler için Dosya, Yeni Yöntem Aç'a tıklayın ve yöntem dosyasını açın. Yöntemdeki parametreleri gözden geçirin.
Döngü Türleri'nde, temas süresini akış yolu 2 üzerinden yakalama 1 için 220 saniye, akış yolu 3 üzerinden yakalama 2 için 110 saniye ve akış yolu 4 üzerinden yakalama 3 için 55 saniye olarak ayarlayın. Akış hızı, tüm yakalama döngüleri için dakikada 10 mikrolitredir. Örnek 1'i seçin ve örnek çözeltiyi bir değişken olarak kontrol edin.
Ardından, akış yolu 1, 2, 3, 4 üzerinden temas süresini 600 saniyeye ve ayrışma süresini 2.700 saniyeye ayarlayın. Akış hızı dakikada 30 mikrolitre olarak ayarlanmıştır. Ardından, Rejenerasyon 1'i seçin, çözelti alanına glisin HCl pH 1.5'i girin ve temas süresini akış yolu 1, 2, 3, 4 üzerinden 20 saniyeye ayarlayın.
Değişken Ayarlar'da, döngü 1-3 için 100 nanomolar ila 6,25 nanomolar, döngü 4-8 için 50 nanomolar ila 3,12 nanomolar ve döngü 9-10 için 5 nanomolar ila 0,323 nanomolar olmak üzere iki katlı titrasyon konsantrasyonları girin. Kurulum Çalıştırı'nda 2-1, 3-1, 4-1 algılama akış yolunu seçin ve ardından ileri'ye tıklayın. Çalıştırmadan önce astarı kontrol edin ve ardından tekrar ileri'ye tıklayın.
Numune ve Reaktif Rafı 1'i seçin ve reaktiflerin konumunu tanımlayın. Reaktifleri uygun şekilde ayrı numune şişelerine pipetleyin ve rafı cihaza yerleştirin. Numune tepsisi bölmesi kapağını açmak için Eject Rack'e tıklayın ve ardından sample rafını cihaza yerleştirin.
Ardından Başlat'a tıklayın ve çalıştırmayı başlatmak için kaydedilecek bir deneme adı girin. ProteOn XPR36'daki kinetik ölçümler için, Protokoller'i ve ardından Numuneler'i seçerek immobilizasyona başlayın. H1-H6 kuyularında aktivatör olarak EDC/Sulfo-NHS'yi, G1-G6'da ligand olarak protein A/G'yi, F1-F6'da deaktivatör olarak etanolamin, E1-E6'da rejeneratör olarak glisini, D1-D6'da boş olarak PBS-T-EDTA'yı, C1-C6'da ligand olarak monoklonal antikor X örneğini ve B1-B6 kuyularında analit olarak insan PCSK9'u tanımlayın.
Adımlar'ı seçin ve ardından protokol düzenleyicisinde İmmobilizasyon'a çift tıklayın. Adımlar, müteakip üç yatay EDC / Sulfo-NHS, protein A / G ve bir molar etanolamin enjeksiyonunu içerir. Her enjeksiyonun dakikada 30 mikrolitre akış hızı ve 300 saniyelik bir temas süresi olmalıdır.
Ardından, Yeniden Oluştur'u tıklayın. Hem yatay hem de dikey yönlerde dakikada 100 mikrolitre hızında üç adet 18 saniyelik glisin darbesi enjekte edin. Bunu, her iki yönde de dakikada 25 mikrolitrede iki adet 60 saniyelik PBS-T-EDTA darbesi ile takip edin.
Ardından, Ligand'a tıklayın ve dakikada 25 mikrolitre akış hızı ve 160 saniyelik bir temas süresi kullanarak monoklonal antikor 1, monoklonal antikor 2'yi dikey yönde enjekte edin. Analit'e tıkladıktan sonra, aynı anda altı yatay kanal üzerinde boş bir tampona beş konsantrasyonda insan PCSK9 enjekte edin. 600 saniyelik ilişkilendirme süresi için dakikada 40 mikrolitre kullanın, ardından 2.700 saniyelik ayrışma süresi izleyin.
Ardından, Yeniden Oluştur'a tıklayın ve hem yatay hem de dikey yönlerde dakikada 100 mikrolitrede 18 saniyelik iki glisin darbesi enjekte edin. Daha sonra, numuneleri ve reaktifleri, tanımlanan reaktif konumlarına göre 96 oyuklu bir plakada hazırlayın. Plakayı cihaza aktarın ve ardından Çalıştır sekmesine tıklayın, protokolü seçin ve Başlat'a tıklayın.
Canlı deneysel verilerin kaydedilmesindeki altı iğneli paralel enjeksiyon gösterilmiştir. Octet RED384'teki kinetik ölçümler için, önce Deney'e, ardından Yeni Deney Sihirbazı'na, Yeni Kinetik Deneyi'ne ve ardından veri toplama yazılımında Temel Kinetik'e tıklayarak deneysel yöntemi ayarlayın. Ardından Plakaları Değiştir'e tıklayın ve hem Plaka 1 hem de Plaka 2'de 96 Kuyuyu 384 Kuyu olarak değiştirin.
Plakadaki numune tiplerini ve konumlarını metin protokolünde açıklandığı gibi tanımlayın. Deney kurulumunu tanımlamak için tahlil tanımına gidin. Deney düzeneği, 30 saniyelik bir temel süre, 30 saniyelik bir rejenerasyon süresi, 18 saniyelik bir dengeleme süresi, 200 saniyelik bir yükleme, 500 saniyelik bir ilişkilendirme süresi ve 1.800 saniyelik bir ayrışma süresi olarak tanımlanır.
Sarsıntı hızı 1.000 RPM olarak ayarlanmıştır. Adımları tahlil adımları listesine eklemek için önce bir adıma tıklayın ve ardından numunede veya reaktif plakasında bulunan kuyucuklara tıklayın. İlk olarak, anti-insan Fc yakalama sensörlerini, 1XKB'de 15 saniyelik düşüşlerle dönüşümlü olarak glisin içinde 15 saniyelik üç döngü ile ön koşullandırmak için dengeleme rejenerasyon talimatlarını girin.
Ardından, monoklonal antikor örneklerini 200 saniye boyunca anti-insan Fc yakalama sensörlerine yakalamak için yükleme talimatlarını girin. Ardından, ilişkilendirme adımından 60 saniye önce biyo-katman interferometri sinyalini oluşturmak için temel talimatları girin. Sensörleri, 500 saniyelik bir ilişkilendirme süresi boyunca değişen konsantrasyonlarda insan PCSK9 içeren kuyulara daldırmak için ilişkilendirme adımını girin.
PCSK9'a bağlı sensörleri 1.800 saniyelik bir ayrışma süresi boyunca 1XKB'lik yeni kuyulara daldırmak için ayrıştırma adımına girin. Son olarak, rejenerasyon adımı için, monoklonal antikor PCSK9'a bağlı sensörleri, her bağlanma döngüsü arasında iki adet 18 saniyelik darbe ile glisin kuyularına daldırın. Deneyleri Gözden Geçir'e gidin, adımlar arasında kaydırın, ardından örnek bölmesini açmak için yeşil açma düğmesine tıklayın.
Numune plakalarını cihaza aktarın. Deneyleri Çalıştır'a gidin, 60 saniyelik bir gecikme süresi girin ve beklerken numune plakasını sallayın. Plaka sıcaklığını 25 santigrat dereceye ayarlayın, deney çalıştırması adını girin ve ardından veri toplamanın burada gösterildiği Go.Live basın.
IBIS-MX96'da çok döngülü kinetik ölçümler için sensör çipini sürekli akışlı mikrospotter'a takın. CFM2.0 yazılımını açın, ardından Ayarları Yükle'ye ve 96 Amin Çifti'ne tıklayın. İki numune ve reaktif plakasını CFM yazıcısına yerleştirin.
Antikor dizisini oluşturmak için, yazıcıyı başlatmak için Çalıştır'a basın ve reaktif plakasının üst yarısındaki EDC/Sulfo-NHS'yi 48 mikro kanal kullanarak sensöre iletin ve bunları sensör yüzeyi üzerinde beş dakika boyunca döndürün. Kaynak plakasının üst yarısındaki monoklonal antikor örneklerini sensöre verin ve bunları 10 dakika boyunca aktif yüzeyler boyunca döndürün. Ardından, immobilizasyon tamponunu 50 mililitrelik konik bir tüpten antikor yüzeyi üzerinde beş dakika boyunca iletin.
Yazdırılan sensör çipini cihaza yerleştirin. Kontrol yazılımında, Dosya, Ölçümü aç, Mevcut ölçüm öğesine tıklayın ve yöntem dosyasını seçin. Yazdırılan sensör çipini cihaza aktarın.
Genel menüde, Tam sistem komut dosyası altında G-System Prime'ı seçin. Ardından, 150 mikrolitre bir molar etanolamin enjekte ederek monoklonal antikor yüzeylerini devre dışı bırakmak için G-Quench'i seçin. Analiz Döngüsü'nde, IBIS Komut Dosyaları altında A-AP Standart Çalıştırma'yı seçin.
Taban çizgisi için 1,0 dakika, ilişkilendirme için 10,0 dakika ve saniyede sekiz mikrolitre hızında ayrışma için 90 adım ayarlayın. Döngülerin içinde, beş tampon enjeksiyonunu takiben insan PCSK9'u her seferinde bir konsantrasyon enjekte edin. Monoklonal antikor yüzeylerini her bağlanma döngüsü arasında glisin ile yenileyin.
Bire bir kinetik model uyum kaplamalarında kaydedilen bağlanma sensorgramları, dört cihazda insan PCSK9 ile etkileşime giren antikorlar için gösterilmiştir. Antikorların çoklu yoğunluklardaki bağlanma profilleri, aletler arasında benzerdir. Antikorların her biri ile ilişkili hız sabitleri aletler arasında değişse de, sıralama sıraları çoğunlukla aynı kaldı.
Çoklu antikor yüzeyleri üzerindeki kinetik oranlardaki afinitelerin tekrarlanabilirliği ve tutarlılığı araştırıldı. Burada gösterildiği gibi, Biacore T100 ve ProteOn XPR36 kullanılarak oluşturulan tüm hız sabitleri için güçlü bir doğrusallık gözlendi. Bununla birlikte, Octet RED384 tarafından üretilen hız sabitleri, bazı kapalı oranlardaki dalgalanmalar nedeniyle daha az doğrusaldı.
Bu, potansiyel olarak mikroplakada zamanla numune buharlaşmasından kaynaklanmıştır. IBIS-MX96 tarafından üretilen hız sabitleri de yüzey heterojenliklerindeki dalgalanmalar nedeniyle daha az doğrusaldı. Sistemlerin çoğu ile ilişkili antikor bağlama aktiviteleri tutarlıydı, oysa IBIS-MX96'dan amin bağlı yöntem için yaklaşık on kat daha düşük bir aktivite gözlendi.
Bu muhtemelen antikor inaktivasyonundan veya antijen bağlanmasına iletken olmayan antikor yönelimlerinin üretilmesinden kaynaklanıyordu. Bu videoyu izledikten sonra, dört biyosensör platformunun her birinde deneylerin nasıl kurulacağını ve kendi araştırma amacınız için uygun biyosensör teknolojisini nasıl seçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Kafa kafaya karşılaştırma çalışmamız, her bir biyosensör platformunun kendine özgü avantajları ve dezavantajları olduğunu göstermektedir.
Enstrümantasyondaki bazı doğal sistematik sınırlamalara rağmen, hem ilişkilendirme hem de ayrışma hızı sabitlerinin doğrudan sırası bu enstrümanlar arasında yüksek oranda korelasyon gösterdi. Aday sıralaması amacıyla, numune sayısının ve malzeme miktarının sınırlayıcı faktörler olmadığı varsayılarak, bu araçlardan herhangi biri kullanılabilir, çünkü ithalat aletinden bağımsız olarak antikorları karşılaştırılabilir şekilde ayırt edebilirler. Veri güvenilirliği ve örnek aktarım hızı arasında bir denge vardır.
Biacore T100 ve ardından ProteOn XPR36R, en iyi veri kalitesini ve tutarlılığını sergiledi. Octet RED384 ve IBIS-MX96 ise veri doğruluğu ve tutarlılığından ödün vererek yüksek esneklik ve verim gösterir. Hassas ve güvenilir algılama gerektiren çalışmalar için Biacore T100 veya ProteOn XPR36 en uygunudur.
Hızın kritik bir faktör olduğu ve çok sayıda numunenin söz konusu olduğu çalışmalar için Octet Red384 veya IBIS-MX96 tercih edilir. Sürekli akışlı akışkan X'e sahip cihazlar, yavaş ayrışma oranlarına sahip etkileşimleri çözmek için yüksek kaliteli veriler sağlar. BRI sıvı yıpranma cihazı için en büyük sınırlama, mikroplakada zamanla numune buharlaşmasıdır, bu da yukarı doğru kaymaya neden olarak veri doğruluğunu tehlikeye atabilir.
Bu çalışma, dört yaygın olarak kullanılan biyosensör platformu kullanarak antikor-antijen bağlanma afinitesi ve kinetiklerini ölçmek için protokoller sunmaktadır. Bu platformların güvenilir kinetik veriler sağlamada performansını karşılaştırmayı amaçlamaktadır.
This study provides a direct comparison of four biosensor platforms for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions, a critical step in therapeutic antibody candidate selection. By assessing data consistency, quality, and operational efficiency across platforms, it supports informed decisions in early discovery where predictive confidence in target binding is essential. The findings help de-risk target validation by identifying platforms that balance throughput with reliable kinetic measurements for lead identification workflows.
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where binding kinetics inform prioritization of antibody candidates for further development.