Name: Dört Biyosensör Platformları kullanma Yüksek yakınlık Antikor-antijen Cilt Kinetiklerinin Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Öğrenin dört biyosensör platformu kullanarak antikor-antijen bağlanma kinetiğini ölçme yöntemlerini. Bu çalışma, ilaç keşfi araştırmalarında güvenilir kinetik veri elde etmek için platform seçiminde rehberlik eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar IBIS MX96 üzerinde teknik yardım için Noah Ditto ve Adam Miles teşekkür ederim.

<ol><li>Cooper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+biosensors+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Optical biosensors in drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).</li>
<li>Van Regenmortel, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antigen-antibody+interactions+with+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Rec%22%5BJournal%5D)">Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors.</a> J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).</li>
<li>Davidoff, S. N., Ditto, N. T., Brooks, A. E., Eckman, J., Brooks, B. D. Surface Plasmon Resonance for Therapeutic Antibody Characterization. Label-Free Biosensor Methods in Drug Discovery. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-2617-6_3">http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-2617-6_3</a> 35-76 (2015).</li>
<li>Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+screening+of+antibodies+from+crude+hybridoma+samples+using+Biacore%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore.</a> Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).</li>
<li>Katsamba, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+high-affinity+antibody%2Fantigen+interaction+performed+by+multiple+Biacore+users%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users.</a> Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+blocking+assays+using+Octet%2C+ProteOn%2C+and+Biacore+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).</li>
<li>Abdiche, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Epitope+Binning+Assays+on+Label-Free+Array-Based+Biosensors+Can+Yield+Exquisite+Epitope+Discrimination+That+Facilitates+the+Selection+of+Monoclonal+Antibodies+with+Functional+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity.</a> PLoS ONE. 9 (3), e92451(2014).</li>
<li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+monoclonal+antibody+market%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).</li>
<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-throughput%2C+label-free%2C+real-time+molecular+interaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li>
<li>Keighley, W. <a target="_blank" href="http://www.ddw-online.com/p-149288">The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process.</a> Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).</li>
<li>Lad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+kinetic+screening+of+hybridomas+to+identify+high-affinity+antibodies+using+bio-layer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry.</a> J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).</li>
<li>Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s12195-008-0036-4">The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions.</a> Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).</li>
<li>Eddings, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+continuous-flow+print+head+for+micro-array+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Improved continuous-flow print head for micro-array deposition.</a> Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet.</a> Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+ProteOn+XPR36+biosensor+into+a+36-ligand+array+expedites+protein+interaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis.</a> Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).</li>
<li>Rich, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+benchmark+study+using+affinity-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A global benchmark study using affinity-based biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).</li>
<li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).</li>
<li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dataset+of+the+binding+kinetic+rate+constants+of+anti-PCSK9+antibodies+obtained+using+the+Biacore+T100+ProteOn+XPR36%2C+Octet+RED384%2C+and+IBIS+MX96+biosensor+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms.</a> Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).</li>
<li>Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165993614001952">Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC.</a> Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).</li>
</ol>

Bu video yazı için Yayın ücretleri Boehringer Ingelheim İlaç tarafından ödendi.

Bizim kafa kafaya karşılaştırma çalışması her biyosensör platformu kendi güçlü ve zayıf yönleri olduğunu gösteriyor. Antikorların bağlanma profilleri (Şekiller 3-6), karşılaştırma yapılarak benzer olsa da, ve elde edilen kinetik hız sabitleri sıra düzeni aletleri üzerinde oldukça tutarlıdır (Şekil 7), elde edilen sonuçlar ile aletleri SPR dayalı olduğunu göstermektedir sürekli akış flüidik) yavaş ayrılma hızlarına sahip, yüksek afiniteli etkileşimler çözülmesi daha iyidirler. Ayrışma safhasında yukarı sürüklenme veri setleri gözlemlenmektedir (örneğin, mAb 2 mAb 5 ve mAb 9; Şekil 5) BLI flüidik içermeyen cihaz tarafından oluşturulan. Bu bulgu, sistemin bir birincil kısıtlamasıdır mikroplakanın, zaman içinde örnek buharlaştırma için büyük ölçüde atfedilebilir. bu içsel sınırlılığı, ile, deneme süresi de en az 12 saat ile sınırlandırılmıştır; Bu yüzden deneyler sh programlandıÖrter kez diğer platformlara kişilerce (10 dakika birlikte ve 45 dakika ayrışma) ile karşılaştırıldığında (500 s birleşme ve 30 dakika ayrışma). BLI tabanlı alet tarafindan üretilen hızı sabitleri, off-hızları bazı dalgalanmalar sonucu (Şekil 8C gibi daha az doğrusallığı gösteren Ancak, deney süresini kısaltarak, veri kalitesi / tutarlılık buharlaştırma etkilerini hafifletmek için görünmedi ). Örnek buharlaştırma ek olarak, kullanılan tutucu reaktifler farklılıklar da elde edilen sonuçlar farklılıklar katkıda bulunmuş olabilir. Protein A / G, tüm üç flüidik tabanlı SPR platformlarında kullanılan iken, AHC sensörleri olmayan flüidik BLI platformu kullanılmıştır. Protein A / G AHC, bir antikor-bazlı biyosensör yüzey protein A / G yüzeylerinden mAb antijen kompleksinin dışı oranları yapay olarak daha hızlı görünebilir yaptığından daha mAb için daha zayıf bir afiniteye sahip muhtemel olduğundan AHC yüzeyden elde edilmiştir. Bu olasılık, b desteklenirY BLI platformu tarafından oluşturulan kapalı-hızı değerleri için diğer araçlar (Şekil 7, kırmızı çizgi) elde edilenlere nazaran tutarlı şekilde daha düşük olduğunu gösteren deneysel veriler. Bununla birlikte, BLI platformu diğer platformlara üzerinde farklı avantajlara sahiptir. Örneğin, bunun nedeni hemen kullanım için çeşitli ön kaplanmış sensörler, sensör seçimi ve deney konfigürasyonu ile ilgili olarak yüksek derecede esnektir. Deneylerde, AHC sensör kullanımı hazırlama süresini azaltmak, ligand immobilizasyon proseslerine olan ihtiyacı ortadan kaldırmıştır. Bundan başka, BLI platformu karmaşık boru ve değer anahtarı yapılandırmaları özelliği diğer flüidik SPR platformları ile kıyaslandığında çok daha az bakım gerektirir. Bu özellik tıkanma ve kirlilik sorunlarına neden olabilir ham örneklem içeren deneyler için bir avantajdır. Terapötik adaylar artar, verimli, hızlı ve doğru tanımlama için talep, bi ihtiyacı olarakosensor verim de artıyor. Dört biyosensör platformlar arasında, 96-ligand dizi baskı yapabilen bir biyosensör ile ilgili verim sonuçta artış bir crisscrossing 36-ligandı biçimi ve 16 kanallı eş zamanlı okuma ile BLI bazlı biyosensör bağlanmış biyosensör ile en yüksek olup sırasıyla 96, 36 ve 16 için tek bir bağlanma döngü ölçülen etkileşim sayısı. Bu verim özellikleri olan tek bir seri akım ile bağlı dört akış hücrelere sahip ile sınırlıdır geleneksel SPR platform, önemli ölçüde daha yüksektir. Bizim deneyler uzun ayrılma süreleri ile çok sayıda yüzey yoğunlukları değerlendirilen 10 mAb&#39;nin nispeten küçük bir numune seti dahil olduğundan, enstrümantal çıktılar deneyler verimliliğinin belirlenmesinde ılımlı bir rol oynamıştır. Üç yüksek verimlilik platformların deneysel zamanlarda önemli bir fark vardı ve her durumda deneyler bir günde tamamlanmıştır. Öte yandan, geleneksel seri akış SPR deneyleri kurulumdan sonra veri toplama yürüyüş uzağa otomasyon rağmen tamamlamak için 3 gün gerektiriyordu. Off-rate sıralaması / kinetik tarama ya da özüdür kümeleştirme amaçlı, (yüzlerce hatta binlerce yani) örneklerin çok sayıda içerir diğer çalışmalarda, üretilen iş kritik bir faktör haline gelir. IBIS MX96 içinde üretilen iş diğer biyosensörlerinin o birkaç kat daha yüksektir ve bu nedenle bu amaçlar için en uygun seçimdir rağmen, birkaç eksiklikleri vardır. Özellikle, CFM ile dizi baskı büyük yüzey tutarsızlıklar (Şekil 1) ve düşürülmüş veri tekrarlanabilirliği (Şekil 8D ve 8E) göstermektedir. doğru kinetik ölçümler için, biyoalgılayıcı yüzey üzerinde ligand miktarı bağlanma tepkileri gibi ikincil faktörlere bozulmazlar sağlamak için kontrol edilmesi gereken kritik bir parametre olduğukütle transferi ya da sterik engelleme. Biacore T100 ve ProteOn XPR36 için en uygun RL seviyeleri araştırma makalesinde 17&#39;de tarif edildiği gibi resim Rmax değerlerinin standart hesaplanması ile belirlenmiştir. Öte yandan, Sekizli RED384 ve IBIS MX96 platformları için mAb yakalama seviyesi ampirik sabit zamanlarda 2-kat seri olarak seyreltilmiş bir antikor serileri kullanılarak elde edildi. Bilgi veya yakalama aşamasının kontrol eksikliği, yüksek yoğunluklu yüzey ve kinetik hız sabitleri doğruluğunu tehlikeye olabilir yüksek bağlanma cevap sinyalleri (Şekil 2) ile sonuçlanmıştır. rejenerasyon içeren çok sayıda bağlanma döngüsü ölçümleri gerçekleştirirken Ayrıca, SPR detektörden gelen yazıcı ayrılması da zordur. çoklu döngüsü kinetiği kurulum gerçekleştirmek için tek yol immobilize edilmiş Protein A / G ile mAb Fc ile ele karşı mAb&#39;ler direkt amin birleştirme yoluyla olduDiğer üç biyosensör platformlarda yüzeyi. Bunun bir sonucu olarak, ek bir rejenerasyon keşif deney optimum dönüşüm koşulları belirlemek için gerekli oldu. Bu kurulum sonucunun daha uzun bir deneme süresinden ek olarak Fc yakalama yöntemi (Şekil 9) ile karşılaştırıldığında bir ~% 90, daha düşük gözlenen yüzey aktivitesi bağlantılıydı. Fc yakalama yöntemi yürütmek için, alternatif bir tek döngüsü kinetik yaklaşım benimsenmiştir. Bu yaklaşım, her bir enjeksiyon (Şekil 2) arasında, yenileme olmaksızın artan konsantrasyonlarda analitin sıralı enjeksiyon içerir. Bu son derece uygun, fakat daha az yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım, sadece deney süresi kısaltılabilir ve reaktif tüketimi düşük değil, aynı zamanda diğer biyosensörler (Şekil 7) elde edilenlere benzer yüksek kinetik hız sabitleri üretti. Bu nedenle, bu tek döngüsü kinetiği yaklaşımı uygulanarak aletin doğal yapılandırma sınırlama üstesinden gelir ve sunuluryüksek verimli bir şekilde yüksek çözünürlüklü kinetik hız sabitlerinin elde etmek için bir fırsat. üretilen iş Biacore T100 önemli bir sınırlama olmasına rağmen, sonuçlarımız topluca en yüksek kalite ile en tutarlı veri oluşturulan olduğunu göstermektedir. Bu ~ 10-kat daha yüksek bir kapasiteye sahip olmasına ProteOn XPR36 izledi. araçların tespit limitleri ulaşıldığında teknik olarak zor olabilir yüksek afiniteli antikor-antijen etkileşimlerini karakterize Yüksek kalitede verileri oluşturmak için kabiliyetleri bir avantajdır. Sekizli RED384 arasında enstrümantasyon sistematik sınırlamalar ayrılma oran sabitleri doğru ölçüm engel ise (yani, duyarlılık altında kalan yavaş off-hızları için yeterli sinyal çürüme gidermek için), her iki Biacore T100 ve ProteOn XPR36 hassas ve güvenilir sağlayabilir farklılaşması için tespiti.

Antikor-antijen etkileşimlerini karakterize etmek için güvenilir kinetik parametrelerin elde edilmesi, ilaç keşfi ve geliştirme sürecinin önemli bir bileşenidir1. Bu etkileşimlerin gerçek zamanlı tespiti için "altın standart" olan Optik Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) biyosensörleri, kriterleri karşılayan terapötik antikor adaylarının erken seçimini sağlamak için yaklaşık yirmi yıldır kullanılmaktadır2,3. Ham süpernatantların hızlı bağlanma taraması ile antikor adaylarının bir afinite sıralaması sağlamanın yanı sıra4 ve saflaştırılmış preparatların titiz kinetik sabit tayinleri5, biyosensörler, epitop gruplama çalışmaları yoluyla öncü adayların fonksiyonel aktivitesini daha da farklılaştırabilir6,7. 
Çeşitli terapötik endikasyonlar için antikor bazlı ürünlerin artan talebini karşılamak için 8, son yıllarda aday tanımlama ve karakterizasyonun verimliliğini artıran çok çeşitli yenilikçi biyosensör cihazları geliştirilmiştir9,10. Bu cihazlar, mikroakışkan kanal konfigürasyon tasarımında ve/veya biyomoleküler etkileşimlerin tespit edilmesinde yer alan optik prensiplerde farklılık gösterir. Özellikle, Octet RED38411, ProteOn XPR3612 ve IBIS MX967, tek bir bağlama döngüsünde ölçülen etkileşim sayısını sırasıyla 16, 36 ve 96'ya genişletti ve bu da geleneksel Biacore platformuna göre önemli verim iyileştirmelerini temsil ediyor. Bu çeşitli biyosensör platformlarının tümü, antikor-antijen etkileşimlerini karakterize etmek için gerekli kinetik verileri sağlasa da, enstrümantal konfigürasyonlardaki farklılıklar nedeniyle deneysel kurulum ve operasyonel prosedürlerde farklılık gösterirler. Örneğin, IBIS MX96'nın SPR görüntüleme dizisi platformunda, multipleks ligand immobilizasyon adımı, dedektörden ayrı bir harici baskı cihazında çevrimdışı modda gerçekleştirilir7,13; Buna karşılık, diğer üç biyosensör platformu, aktivasyon reaktifi, ligand veya analit olsun, sensör yüzeyine bileşen eklenmesinin gerçek zamanlı olarak ve önceden programlanmış komutlar aracılığıyla sıralı olarak kaydedildiği bir "hepsi bir arada" kurulum kullanır. Octet RED384'te, bu BioLayer İnterferometri (BLI) tabanlı platformun benzersiz bir özelliği, anında "daldırma ve okuma" kullanımı için önceden kaplanmış fiber optik biyosensörlerin kullanılabilirliğidir14, SPR tabanlı platformlardaki sensör çipleri için genellikle gerekli olan ligand yüzey hazırlığı ve başlatma/koşullandırma adımlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Bu cihazın akışkan içermeyen tasarımı aynı zamanda mekaniği basitleştirir ve ham numunelerle uğraşırken tıkanma ve kontaminasyon endişelerini önler. ProteOn XPR36'daki yeni 6 x 6 çapraz akışkan tasarımıyla, 36 etkileşim noktası oluşturmak için akış kanallarını yatay ve dikey yönler arasında değiştirerek "tek atışlık" bir kinetik yaklaşım uygulanabilir15. Geleneksel seri akış Biacore T100 platformunda yapıldığı gibi, bir seferde bir ligand veya analit konsantrasyonunun bağlanma kinetiğini değerlendirmek yerine, bu yaklaşım, tek bir bağlanma döngüsünde aynı anda 36'ya kadar farklı etkileşimi izleme yeteneği sunar. 
Farklılıklarına rağmen, bu dört biyosensör platformunun tümü dünya çapında birçok laboratuvar tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır. Uygulamalı biyosensör deneyimi az olan yeni kullanıcılar için, cihaz tasarımındaki farklılıklar göz önüne alındığında, hangi cihazın kullanılacağına karar vermek zorlu bir görev olabilir. Araştırma amaçlarına en uygun enstrümanı belirlemek için veri kalitesi, performans tutarlılığı, verim, kullanım kolaylığı ve malzeme tüketimi gibi faktörlerin toplu olarak dikkate alınması gerekir. Birkaç kıyaslama çalışması, birden fazla laboratuvar ve biyosensörden elde edilen kinetik hız sabitlerinin değişkenliğini araştırmış olsa da5,16, yakın zamanda yayınlanan bir kafa kafaya karşılaştırma çalışması, enstrümantal performans açısından veri güvenilirliğini etkileyen sistematik faktörleri daha fazla ele almaktadır17,18. Bu videoda sağlanan protokoller, deney düzeneğine ve prosedürlerine ayrıntılı olarak odaklanmaktadır ve "Yüksek afiniteli antikor-antijen bağlanma kinetiğinin değerlendirilmesinde biyosensör platformlarının karşılaştırılması" başlıklı araştırma makalesi eşlik etmektedir17. Bu protokoller, yalnızca yeni biyosensör kullanıcılarının bu cihazları araştırma amaçları için uygulamalarına yardımcı olmak için değil, aynı zamanda mevcut biyosensör kullanıcıları için yüksek afiniteli antikor-antijen etkileşimlerini değerlendirmek için deneysel tasarımlardaki teknik zorluklar ve hususlar hakkında ek bilgiler sağlamayı amaçlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>Biacore T100 Sistemi</td><td>GE Sağlık</td><td>28975001</td><td>T100 sistemi, T200</td></tr><tr><td>CM5 Sensör Çipine</td> yükseltildi.<td>GE Sağlık</td><td>BR100012</td><td></td></tr><tr><td>BIAdeğerlendirmesi&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Sürüm 4.1</td></tr><tr><td>Biacore T100 Kontrol Yazılımı</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>T100 kontrol yazılımı T200</td></tr><tr><td>Amin Kaplin Kiti'ne</td> yükseltildi <td>GE Healthcare</td><td>BR100050&nbsp;</td><td>İçeriği: 750 mg 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorür (EDC), 115 mg N-hidroksisüksinimid (NHS), 10.5 mL 1.0 M etanolamin-HCl pH 8.5&nbsp;</td></tr><tr><td>HBS-EP + Tampon 10 kez;</td><td>GE Sağlık</td><td>BR100669</td><td>Konsantre stok çözeltisi&nbsp;</td></tr><tr><td>Plastik Şişeler, o.d. 7 mm</td><td>GE Sağlık</td><td>BR100212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kauçuk Kapaklar, tip 3</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100502</td><td></td></tr><tr><td>Plastik Şişeler ve Kapaklar, o.d. 11 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100214&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ProteOn XPR36 Protein Etkileşim Dizisi Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>1760100</td><td></td></tr><tr><td>ProteOn Manager Yazılımı&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1760200</td><td>Sürüm 3.1.0.6</td></tr><tr><td>GLM Sensör Çipi</td><td>Bio-Rad</td><td>1765012</td><td></td></tr><tr><td>Amin Birleştirme Kiti</td><td>Bio-Rad</td><td>1762410</td><td>EDAC (EDC), sülfo-NHS, etanolamin HCl&nbsp içerir;</td></tr><tr><td>Rejenerasyon ve Kondisyonlama Kiti ve Tamponları</td><td>Bio-Rad</td><td>1762210</td><td>1 adet glisin tamponu (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0) ve NaOH, SDS, HCl, fosforik asit, NaCl; Her biri 50 mL çözelti&nbsp;</td></tr><tr><td>2 L PBS/Tween/EDTA tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>1762730</td><td>Hastane tamponlu salin (PBS), pH 7.4, %0.005 Tween 20, 3 mM EDTA içerir;</td></tr><tr><td>Octet RED384 Sistem</td><td>Kalesi; </td><td></td><td></td>Biyo</tr><tr><td>Veri</td><td>Analiz Yazılımı Fort&eacute; </td><td></td> Bio <td>Sürüm 9.0.0.4</td></tr><tr><td>Daldırma ve Okuma Anti-hIgG Fc Yakalama (AHC) Biyosensörleri</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-5060</td><td>Bir tepsi 96 biyosensör&nbsp;</td></tr><tr><td>384 Kuyu Eğimli Alt Plaka&nbsp;</td><td>Kale ve eacute; Bio</td><td>18-5080</td><td></td></tr><tr><td>Biyosensör Dispenseri</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-5016</td><td></td></tr><tr><td>Kinetik Tampon 10x</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-1092</td><td>10x konsantrasyon. ProClin 300 içerir.</td></tr><tr><td>IBIS MX96 SPRi Sistemi</td><td>Wasatch Mikroakışkanlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroakışkanlar Sürekli Akışlı Mikrospotter (CFM) Yazıcı</td><td>Wasatch Mikroakışkanlar</td><td></td><td>Sürüm 2.0</td></tr><tr><td>SensEye COOH-G çipi</td><td>Wasatch Mikroakışkanlar</td><td></td><td>1-09-04-004</td></tr><tr><td>Veri Analiz Yazılımı</td><td>Wasatch Mikroakışkanlar</td><td></td><td>Sürüm 6.19.3.17</td></tr><tr><td>SPRint Veri Analiz Yazılımı</td><td>Wasatch Mikroakışkanlar</td><td></td><td>Sürüm 6.15.2.1</td></tr><tr><td>Yıkayıcı 2</td><td>BioLogic Yazılım</td><td></td><td>Sürüm 2</td></tr><tr><td>Pierce Rekombinant Protein A/G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr></tbody></table>

dört biyosensör platformları kullanma yüksek yakınlık antikor-antijen cilt kinetiklerinin belirlenmesi

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Etiket içermeyen optik biyosensörler biomoleküler etkileşimlerin karakterizasyonu için ilaç keşfi güçlü araçlardır. Bu çalışmada, bağlanma afinitesi, insan minimal bölünme sinyalini hatırlatmaktadır subtilisin kexin tip 9 karşı on yüksek afiniteli monoklonal antikorlar (mAb&#39;ler) (PCSK9) kinetiklerini değerlendirmek için laboratuarda dört rutin olarak kullanılan biyosensör platformları kullanılmasını tarif eder. Biacore T100 ve ProteOn XPR36 hem köklü Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) teknolojisi elde edilir olsa da, önceki yapımı bir 6 x 6 CrissCross ile paralel Bu tutucu ise 36 Reaksiyon noktalar, seri akış konfigürasyonu ile bağlı dört akış hücresinin sahip mikroakışkan kanal konfigürasyonu. IBIS MX96 da mekansal yönlenmede algılama sağlayan ek bir görüntüleme özelliği ile, SPR sensor teknolojisine dayalı olarak çalışır. Sürekli Akış Microspotter (CFM) ile bağlandığında, bu algılama tekniği e oranını önemli ölçüde genişletirAynı anda 96 reaksiyon sporları çoklu dizi baskı ve algılama nabling. Bunun aksine, Sekizli RED384 fiber optik prob girişim deseni tespit etmek için biyosensör olarak hareket ile BioLayer İnterferometri (BLI) optik prensibine dayanan uç yüzeyinde etkileşimleri bağlanması üzerine değişir. SPR tabanlı platformlar farklı olarak, BLI sistemi sürekli akış akıskanlar tekni˘gi dayanmaz; onlar yörünge ajitasyon sırasında 384 mikroplakanın analit çözümleri dalmış iken yerine, sensör ipuçları okumaları toplar. Bu biyosensör platformları her biri kendi avantajları ve dezavantajları vardır. 1 moleküler etkileşim modeli: anlatılan protokoller basit 1 uygun bir antikor-antijen kinetiği karakterize etmek için aynı deney formatı ve aynı yüksek kalitede reaktif maddeleri deneyleri göstermektedir kalite kinetik veri sağlamak için bu araçların kabiliyetinin doğrudan karşılaştırma sağlamak için .

Şekil 1, iki hareketsizleştirme yöntemleri ile CFM ve benekli mAb düzeyde antikor dizisi görüntü gösterir, ve Şekil 2, bu mAb dizileri çoklu döngüsünden MX96 kinetik oluşturulan karşılık gelen bağlama sensörgramları tek döngülü kinetik ölçümleri göstermektedir . 6 - bağlanması ve dört biyosensör platformlarda üretilen çoklu antikor kaplı yüzeylerden kinetik donatılmış eğrileri gerçek zamanlı, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Şekil 7, bu bağlanma eğrilerinin, küresel analizinden elde edilen nihai kinetik oranları ve denge bağlanma sabitleri karşılaştırılmasını göstermektedir. Birey (k a), ayrılma (kd) ve denge (KD), bağlanma sabitleri Tablo 1 &#39;de sunulmaktadır. aynı alet içinde üretilen veri setleri değişkenliğini göstermek için, <stRong&gt; Şekil 8, farklı bir mAb yüzey yoğunluklarında k a, k, d, K, D grafiklerini gösterir ve Şekil 9, ayrıca biyo-algılayıcı platformlarında mAb yüzeyleri hesaplanan bağlanma aktivitelerini karşılaştırır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> Amin-bağlı (A) ve IBIS MX96 CFM baskı (B) Antikor yüzeyleri Fc ele Şekil 1. Multipleks Ligand dizileri. Baskılı dizilerin görüntüleri kırmızı kareler ile kapalı gri alanlar, antikorun varlığını gösterir sol panel, gösterilmiştir. Aktif antikor noktalar arasında yer alan koyu interspots referans çıkarma için kullanılır. Her bir sütun altında ve resmin solunda tespit titrasyon konsantrasyonlarda basılmış bir antikor içerir. di hesaplamak suretiyle ölçülür baskılı antikor miktarlarıAktif ve referans konumları arasında yığın vardiyada fference sağ paneller gösterilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> Çok döngüsü (A) &#39;dan, sensor Bağlama Gerçek zamanlı ve tek döngülü (B) IBIS MX96 Kinetik Deneylerin Şekil 2. karşılaştırılması. 10 x 8 antikoru diziler arasında artan konsantrasyonlarda insan PCSK9 sıralı enjeksiyon her biri karşılık gelen sensorgram kesimi üzerinde belirtilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <stBiacore T100 1 kinetik model uygunluğundan Yerpaylaşımları: Rong&gt; Şekil 3. İnsan PCSK9 ve 1 ile etkileşim Yakalanan Antikorların sensor bağlanması. Etkileşimleri Yüksek- (üst panel), orta (orta panel) ve düşük (alt paneller) yoğunluk yüzeyleri üzerinde değerlendirilir. 1 etkileşimi modeli: kaplanmış düz siyah çizgiler bir 1 farklı insan PCSK9 konsantrasyonda (renkli çizgiler) de bağlama cevap sinyallerinin kinetik uyum gösterir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> ProteOn XPR36 1 kinetik model uygunluğundan Yerpaylaşımları: Şekil 4. İnsan PCSK9 ve 1 ile etkileşim Yakalanan Antikorların sensor bağlanması. Etkileşimleri yüksek (üst panel), medi üzerinden değerlendirilirum- (orta panel) ve düşük (alt paneller) yoğunluk yüzeyler. 1 etkileşimi modeli: kaplanmış düz siyah çizgiler bir 1 farklı insan PCSK9 konsantrasyonda (renkli çizgiler) de bağlama cevap sinyallerinin kinetik uyum gösterir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> Sekizli RED384 1 kinetik model uygunluğundan Yerpaylaşımları: Şekil 5. İnsan PCSK9 ve 1 ile etkileşim Yakalanan Antikorların sensor bağlanması. Etkileşimleri Yüksek- (üst panel), orta (orta panel) ve düşük (alt paneller) yoğunluk yüzeyleri üzerinde değerlendirilir. kaplanmış kırmızı çizgileri 1&#39;e farklı insan PCSK9 konsantrasyonda (renkli çizgiler) de bağlama cevap sinyallerinin kinetik uyum temsil etmektedir:<html> 1 etkileşimi modeli. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> IBIS MX96 1 kinetik model uygunluğundan Yerpaylaşımları: Şekil 6. İnsan PCSK9 ve 1 ile etkileşim Amin bağlanmış (A) ve Fc yakalanan (B) Antikorların sensor bağlanması. Bağlama profilleri Şekil 1 &#39;de bir dizi plaka harita takip 10 x 8 panel olarak düzenlenir. Siyah çizgiler farklı insan PCSK9 konsantrasyonlarda Kaydedilen bağlanma yanıt sinyallerini temsil eden ve kaplanmış kırmızı çizgiler donatılmış eğrilerini göstermektedir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> Güre gösterir 7&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg&quot; /&gt; Şekil Esas 7. karşılaştırması dört Biyosensör Platformlar tarafından oluşturulan bağlama sabitleri A (a), Ayrışma Kd (B) k ve denge KD (C). 6 - kinetik parametreler Şekil 3 bağlanma eğrileri genel analizinden türetilmiştir. aşağıdaki gibi enstrümanlar temsil edilir: Biacore T100 (mavi), ProteOn XPR36 (yeşil), Sekizli RED384 (kırmızı), amin çiftli (mor) IBIS MX96 ve IBIS MX96, (turuncu) Fc yakalanan. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> Biac Çoklu Antikor Yüzey Sıklıklarında Üzeri Kinetik Hız Sabitlerinin Kıvamı Şekil 8. Karşılaştırılması<html> cevher T100 (A) ProteOn XPR36 (B) Sekizli RED384 (C) IBIS MX96, amin bağlanmış olan (D), ve yakalanan Fc IBIS MX96, (E). Kinetik parametreler (üst alt paneller) k d (orta alt paneller) k ve KD (alt alt paneller) tek tek antikor yüzeyi yoğunluğunda grup analizi elde edilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 9," src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> Şekil dört Biyo-algılayıcı Platformlar Antikor yüzeyleri ve standart sapmalar (hata çubukları) 9. bağlama aktivitesi. Değerleri araştırma makalelerinde 17&#39;de tarif denklemler kullanılarak hesaplanmıştır.large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> k bir </td><td> k d </td><td> K D </td></tr><tr><td> (M-1 s-1) </td><td> (s-1) </td><td> (nM) </td></tr><tr><td> mAb 1 </td><td> (7.8) 11.7 10 5 x </td><td> (4.18) 4.89 10 -5 x </td><td> 0.052 (0.05) </td></tr><tr><td> mAb 2 </td><td> (0.28) 1.53 10 5 x </td><td> (1.54) 1.30 10 -5 x </td><td> 0.092 (0.12) </td></tr><tr><td> mAb 3 </td><td> (8.3) 11.4 10 5 x </td><td> (11.0) 27.6 10 -5 x </td><td> 0.333 (0.20) </td></tr><tr><td> mAb 4 </td><td> (1.6) 3.61 10 5 x </td><td> (12.3) 20.1 10 -5 x </td><td> 0.659 (0.54) </td></tr><tr><td> mAb 5 </td><td> (0.21) 0.59 10 5 x </td><td> (2.50) 3.46 10 -5 x </td><td> 0.663 (0.46) </td></tr><tr><td> mAb 6 </td><td> (0.78), 1.19 10 5 x </td><td> (3.83) 7.21 10 -5 x </td><td> 0.894 (0.64) </td></tr><tr><td> mAb 7 </td><td> (0.53) 1.29 10 5 x </td><td> (5.63) 16.4 10 -5 x </td><td> 1.57 (1.02) </td></tr><tr><td> mAb 8 </td><td> (2.23), 4.02 10 5 x </td><td> (10.7) 22.8 10 -5 x </td><td> 0.768 (0.68) </td></tr><tr><td> mAb 9 </td><td> (2.13) 4.20 10 5 x </td><td> (4.3) 6.67 10 -5 x </td><td> 0.197 (0.16) </td></tr><tr><td> mAb 10 </td><td> (0.49) 1.20 x 10 5 </td><td> (7.64) 12.5 10 -5 x </td><td> 1.27 (0.80) </td></tr></tbody></table> Tablo 1: 1 Etkileşim Modeli: Kinetik Oranları ve Denge 1 Dört Biyosensör Araçlardan Cilt Eğrilerin Küresel uydurularak elde edilen 10 mAb&#39;nin Bağlanma Sabitlerinin.

Burada tarif afinite ve dört yaygın biçimde kullanılan biyosensör platformları kullanarak kinetiği bağlayıcı antikor-antijen ölçümü için protokolleri.

Dört Biyosensör Platformları kullanma Yüksek yakınlık Antikor-antijen Cilt Kinetiklerinin Belirlenmesi

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Bu biyosensör çalışmasının amacı, rutin olarak kullanılan dört biyosensör platformunun kaliteli kinetik veriler sağlama yeteneğini karşılaştırmak ve yüksek afiniteli antikor-antijen etkileşimlerini değerlendirmeye yönelik deneysel tasarımlardaki teknik zorluklar ile hususlara dair içgörüler sunmaktır. Bu çalışma, terapötik antikor adayları değerlendirilirken en güvenilir sonuçları sağlayan biyosensör platformlarının ve assay formatlarının seçimi konusunda ilaç keşfi alanındaki temel sorulara yanıt vermektedir. Bu çalışmanın temel avantajı, çeşitli biyosensör platformlarının veri tutarlılığı, kalitesi ve operasyonel verimliliği açısından doğrudan ve kapsamlı bir karşılaştırmasını sunmasıdır.Dört protokolün video gösterimi, sınırlı uygulamalı deneyime sahip yeni kullanıcıların bu cihazlarda deneyleri nasıl kuracaklarını öğrenmelerine yardımcı olduğu için kritik öneme sahiptir. Biacore T100 ile kinetik ölçümler yapmak için Dosya, Yeni Yöntem Aç seçeneklerine tıklayın ve yöntem dosyasını açın. Yöntemdeki parametreleri gözden geçirin.Döngü Tipleri'nde (Cycle Types), akış yolu 2 üzerinden 1. yakalama için temas süresini 220 saniye, akış yolu 3 üzerinden 2. yakalama için 110 saniye ve akış yolu 4 üzerinden 3. yakalama için 55 saniye olarak ayarlayın. Tüm yakalama döngüleri için akış hızı dakikada 10 mikrolitredir. Örnek 1'i seçin ve değişken olarak örnek çözeltiyi işaretleyin.Ardından, akış yolu 1, 2, 3 ve 4 üzerinden temas süresini 600 saniye, ayrışma süresini ise 2.700 saniye olarak ayarlayın. Akış hızı dakikada 30 microliters olarak belirlenir. Daha sonra, Rejenerasyon 1'i seçin, çözelti alanına glycine HCl pH 1.5 girin ve akış yolu 1, 2, 3 ve 4 üzerinden temas süresini 20 saniye olarak ayarlayın.Değişken Ayarları (Variable Settings) kısmına, 1-3. döngüler için 100 nanomolar ile 6,25 nanomolar arası, 4-8. döngüler için 50 nanomolar ile 3,12 nanomolar arası ve 9-10. döngüler için 5 nanomolar ile 0,323 nanomolar arası iki kat seyreltmeli titrasyon konsantrasyonlarını girin. Çalışma Kurulumu (Setup Run) kısmında, 2-1, 3-1, 4-1 deteksiyon akış yolunu seçin ve ardından sonraki (next) butonuna tıklayın. Çalıştırmadan önce hazırlama (prime before run) seçeneğini işaretleyin ve tekrar sonraki (next) butonuna tıklayın.Numune ve Reaktif Rafı 1'i seçin ve reaktiflerin konumlarını tanımlayın. Reaktifleri ilgili bireysel numune tüplerine pipetleyin ve rafı cihaza yerleştirin. Numune tepsisi bölmesi kapısını açmak için Rafı Çıkar'a (Eject Rack) tıklayın ve ardından numune rafını cihaza yerleştirin.Ardından, çalışmayı başlatmak için Start'a tıklayın ve kaydedilecek bir deney adı girin. ProteOn XPR36'daki kinetik ölçümler için, Protocols ve ardından Samples seçeneklerini belirleyerek immobilizasyona başlayın. H1-H6 kuyucuklarında aktivatör olarak EDC/Sulfo-NHS'yi, G1-G6'da ligand olarak protein A/G'yi, F1-F6'da deaktivatör olarak etanolamin'i, E1-E6'da rejeneratör olarak glisin'i, D1-D6'da boşluk (blank) olarak PBS-T-EDTA'yı, C1-C6'da ligand olarak monoklonal antikor X örneğini ve B1-B6 kuyucuklarında analit olarak insan PCSK9'u tanımlayın.Protokol düzenleyicide önce Steps'i seçin ve ardından Immobilization seçeneğine çift tıklayın. Adımlar; EDC/Sulfo-NHS, protein A/G ve bir molar etanolaminin birbirini takip eden üç yatay enjeksiyonunu içerir. Her enjeksiyonun akış hızı 30 µL/dakika ve temas süresi 300 saniye olmalıdır.Ardından, Regenerate (Yeniden Oluştur) düğmesine tıklayın. Hem yatay hem de dikey yönlerde, dakikada 100 µL hızında üç adet 18 saniyelik glisin darbesi uygulayın. Bunu, yine her iki yönde, dakikada 25 µL hızında iki adet 60 saniyelik PBS-T-EDTA darbesi ile takip edin.Ardından, Ligand'a tıklayın ve 25 µL/dk akış hızı ile 160 saniyelik bir temas süresi kullanarak, dikey yönde monoklonal antikor 1 ve monoklonal antikor 2'yi enjekte edin. Analyte'a tıkladıktan sonra, altı yatay kanal üzerinden eş zamanlı olarak boş bir tampon çözelti içinde beş farklı konsantrasyondaki insan PCSK9'u enjekte edin. 600 saniyelik bir asosyasyon süresi için 40 µL/dk akış hızı kullanın ve bunu 700 saniyelik bir disosyasyon süresi ile takip edin.Ardından, Regenerate seçeneğine tıklayın ve hem yatay hem de dikey yönlerde, dakikada 100 microliters hızında iki adet 18 saniyelik glisin darbesi uygulayın. Sonra, örnekleri ve reaktifleri, belirlenen reaktif konumlarına göre tek bir 96 kuyucuklu plakaya hazırlayın. Plakayı cihaza yerleştirin ve ardından Run sekmesine tıklayıp protokolü seçerek Start butonuna tıklayın.Canlı deneysel verilerin kaydedilmesinde altı iğneli paralel enjeksiyon yöntemi gösterilmektedir. Octet RED384'teki kinetik ölçümler için veri toplama yazılımında önce Experiment, ardından New Experiment Wizard, New Kinetics Experiment ve son olarak Basic Kinetics seçeneğine tıklayarak deneysel yöntemi ayarlayın. Ardından Modify Plates seçeneğine tıklayın ve hem Plate 1 hem de Plate 2 için 96 Wells ifadesini 384 Wells olarak değiştirin.Numune türlerini ve plakadaki konumlarını metin protokolünde açıklandığı şekilde tanımlayın. Deneysel düzeni tanımlamak için analiz tanımına gidin. Deneysel düzen; 30 saniyelik bir baz hattı süresi, 30 saniyelik bir rejenerasyon süresi, 18 saniyelik bir dengeleme süresi, 200 saniyelik bir yükleme süresi, 500 saniyelik bir asosiasyon süresi ve 1.800 saniyelik bir disosiasyon süresi olarak tanımlanır.Çalkalama hızı 1,000 RPM olarak ayarlanır. Adımları analiz adımları listesine eklemek için önce bir adıma tıklayın ve ardından örnek veya reaktif plakasında bulunan kuyucuklara tıklayın. İlk olarak, anti-human Fc yakalama sensörlerini ön koşullandırmak için glisin içindeki 15 saniyelik daldırmalarla 1XKB içindeki 15 saniyelik daldırmaların birbirini izlediği üç döngüden oluşan dengeleme rejenerasyon talimatlarını girin.Ardından, monoklonal antikor örneklerini anti-human Fc yakalama sensörlerine 200 saniye boyunca tutturmak için yükleme talimatlarını girin. Daha sonra, asosyasyon adımından önce biyokatman interferometrisi sinyalini oluşturmak için 60 saniyelik bazal çizgi talimatlarını girin. Sensörleri, farklı konsantrasyonlarda human PCSK9 içeren kuyucuklara 500 saniyelik bir asosyasyon süresi boyunca daldırmak için asosyasyon adımını girin.PCSK9'a bağlı sensörleri, 1 800 saniyelik bir disosiyasyon süresi için 1XKB içeren yeni kuyucuklara daldırmak üzere disosiyasyon adımına geçin. Son olarak, rejenerasyon adımı için, monoklonal antikor PCSK9'a bağlı sensörleri, her bağlama döngüsü arasında iki adet 18 saniyelik darbe şeklinde glisin içeren kuyucuklara daldırın. Deneyleri Gözden Geçir (Review Experiments) kısmına gidin, adımlar arasında ilerleyin ve ardından örnek bölmesini açmak için yeşil açma düğmesine tıklayın.Numune plakalarını cihaza yerleştirin. Deneyleri Çalıştır (Run Experiments) sekmesine gidin, 60 saniyelik bir gecikme süresi girin ve beklerken numune plakasını sallayın. Plaka sıcaklığını 25 °C olarak ayarlayın, deney çalışma adını girin ve ardından Go düğmesine basın. Canlı veri toplama işlemi burada gösterilmektedir.IBIS-MX96'da çok döngülü kinetik ölçümler için sensör çipini sürekli akışlı mikro spotlayıcıya yerleştirin. CFM2.0 yazılımını açın, ardından Ayarları Yükle (Load Settings) ve 96 Amine Couple seçeneklerine tıklayın. İki örnek ve reaktif plağını CFM yazıcısına yerleştirin.Antikor dizisini oluşturmak için, yazıcıyı başlatmak amacıyla Run'a basın ve reaktif plakasının üst yarısındaki EDC/Sulfo-NHS'yi 48 mikrokanal kullanarak sensöre iletin ve bunları beş dakika boyunca sensör yüzeyi üzerinde döngüye sokun. Kaynak plakasının üst yarısındaki monoklonal antikor örneklerini sensöre iletin ve bunları aktive edilmiş yüzeyler boyunca 10 dakika boyunca döngüye sokun. Ardından, 50 milliliter'lik konik bir tüpten immobilizasyon tamponunu beş dakika boyunca antikor yüzeyi üzerine iletin.Basılı sensör çipini cihaza yerleştirin. Kontrol yazılımında Dosya, Ölçümü aç, Mevcut ölçüm seçeneklarına tıklayın ve yöntem dosyasını seçin. Basılı sensör çipini cihaza aktarın.Genel menüde, Full system script başlığı altından G-System Prime'ı seçin. Ardından, 150 µL 1 M etanolamin enjekte ederek monoklonal antikor yüzeylerinile deactivate etmek için G-Quench'i seçin. Analysis Cycle kısmında, IBIS Scripts altında A-AP Standard Run'ı seçin.Baz hattı için 1,0 dakika, ilişkilendirme için 10,0 dakika ve ayrışma için saniyede sekiz mikrolitre hızla 90 adım ayarlayın. Döngüler içinde, beş tampon enjeksiyonunu takiben, insan PCSK9'u her seferinde bir konsantrasyonda enjekte edin. Her bağlanma döngüsü arasında monoklonal antikor yüzeylerini glisin ile rejenere edin.Dört farklı cihazda insan PCSK9 ile etkileşen antikorlar için bire bir kinetik model uyumu üst üste bindirilmiş kayıtlı bağlanma sensogramları gösterilmiştir. Antikorların farklı yoğunluklardaki bağlanma profilleri cihazlar arasında benzerlik göstermektedir. Her bir antikorla ilişkili hız sabitleri cihazlar arasında farklılık gösterse de, sıralamaları çoğunlukla aynı kalmıştır.Birden fazla antikor yüzeyinde kinetik hızlardaki afinitelerin tekrarlanabilirliği ve tutarlılığı incelenmiştir. Burada gösterildiği üzere, Biacore T100 ve ProteOn XPR36 kullanılarak elde edilen tüm hız sabitleri için güçlü bir lineerlik gözlemlenmiştir. Ancak, Octet RED384 tarafından üretilen hız sabitleri, bazı ayrılma hızlarındaki dalgalanmalar nedeniyle daha az lineerdi.Bu durum, mikroplakadaki örneklerin zamanla buharlaşmasından kaynaklanmış olabilir. IBIS-MX96 tarafından üretilen hız sabitleri, yüzey heterojenliklerindeki dalgalanmalar nedeniyle daha az lineerdi. Sistemlerin çoğuna ilişkin antikor bağlanma aktiviteleri tutarlıydı, ancak IBIS-MX96'dan elde edilen amin-kuplaj yöntemi için yaklaşık on kat daha düşük bir aktivite gözlemlendi.Bu durum, muhtemelen antikor inaktivasyonundan veya antijen bağlanmasına uygun olmayan antikor oryantasyonlarının oluşmasından kaynaklanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, dört biyosensör platformunun her birinde deneylerin nasıl kurulacağı ve kendi araştırma amacınız için uygun biyosensör teknolojisinin nasıl seçileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Karşılaştırmalı çalışmamız, her bir biyosensör platformunun kendine özgü avantajları ve dezavantajları olduğunu göstermektedir.Enstrümantasyondaki bazı doğal sistematik kısıtlamalara rağmen, hem birliktelik hem de ayrışma hız sabitlerinin doğrudan sıralamaları bu cihazlar arasında yüksek korelasyon gösterdi. Aday sıralaması amacıyla, örnek sayısının ve malzeme miktarının sınırlayıcı faktörler olmadığı varsayıldığında, kullanılan cihaza bakılmaksızın antikorları benzer şekilde ayırt edebildikleri için bu cihazların herhangi biri kullanılabilir. Veri güvenilirliği ile örnek işlem kapasitesi arasında bir ödünleşim söz konusudur.Biacore T100 ve ardından ProteOn XPR36R, en iyi veri kalitesini ve tutarlılığını sergilemiştir. Öte yandan Octet RED384 ve IBIS-MX96, veri doğruluğu ve tutarlılığından ödün vererek yüksek esneklik ve işlem kapasitesi sunmaktadır. Hassas ve güvenilir tespit gerektiren çalışmalar için Biacore T100 veya ProteOn XPR36 en uygun seçeneklerdir.Hızın kritik bir faktör olduğu ve çok sayıda örneğin söz konusu olduğu çalışmalar için Octet Red384 veya IBIS-MX96 tercih edilir. Sürekli akışlı sıvı X sistemine sahip cihazlar, yavaş disosiasyon hızlarına sahip etkileşimlerin çözümlenmesi için yüksek kaliteli veriler sağlar. BRI sıvı ex-a-fray cihazı için temel kısıtlama, mikroplakadaki örneğin zamanla buharlaşmasıdır; bu durum, veri doğruluğunu bozan yukarı yönlü bir sapmaya (drift) yol açabilir.

determination-high-affinity-antibody-antigen-binding-kinetics-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, bir antikorun bir dönüştürücü çip üzerinde hareketsiz hale getirilmiş bir hedef antijen ile etkileşimini incelemek için iletken bir biyosensör testini göstermektedir. Biyosensör, iki işlevli bir kimerik proteine sahip olacak şekilde tasarlanmıştır - hareketsizleştirilmiş hedef antijene bağlanmak için bir nano gövdeye kaynaşmış fonksiyonel bir katalitik bölgeye sahip bir β-laktamaz enzimi. Bağlanma üzerine, bir antibiyotik substratının β-laktamaz enzimi tarafından katalitik hidrolizi,...

Protein-Protein Etkileşimleri için β-Laktamaz Tabanlı Kondüktimetrik Biyosensör Testi

Burada protokolleri Bio-tabaka interferometrisi ile protein-protein etkileşimleri kinetik analizleri tarif eder. Hücresel enerji metabolizmasında yer alır F tipi ATP sintaz, bakteriler kendi ε alt birimi ile inhibe edilebilir. Biz, ε inhibitör C-terminal alanı ile katalitik kompleksinin etkileşimleri incelemek için Bio-tabaka interferometre adapte edilmiştir.

Protein-protein etkileşimleri ve Allosterik Ligand Etkileri Kinetiği Ölçüm Bio-katman Interferometri

Bu çalışmada, protein-protein etkileşimleri hibrid β-lactamase teknolojisini temel alan bir conductimetric Biyoalgılayıcı kullanarak eğitim için yeni bir yöntem rapor. Bu yöntem proton β-lactams hidroliz üzerine sürümü kullanır.

Biyomoleküler etkileşimleri algılamak için bir Conductimetric Biyoalgılayıcı β-lactamase tabanlı tahlil kullanımı

Burada açıklamak için geliştirme ve insan örneklerinde tüm IFN-α türlerinden Ultra-duyarlı algılama sağlayan bir tek molekül dizi dijital ELISA yöntemi, doğrulama iletişim kuralı mevcut.

Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Biz kitle fotometri (MP) kullanarak antijen-antikor afinite ölçümleri için tek moleküllü bir yaklaşım açıklar. MP tabanlı protokol hızlı, doğru, malzeme çok az miktarda kullanır ve protein modifikasyonu gerektirmez.

Kitle Fotometrisi ile Antikor-Antijen Affinitesinin Hızlı Tayini

Bu çalışma, ilaç-peptit etkileşimlerini tanımlamak için bir strateji sunmayı amaçlamaktadır. Strateji, bir kuvars-kristal mikro denge (QCM) biyosensörüne dayanan ilaç tanıyan kısa peptitlerin biyopannasyonunu ve ardından ilaç tanıma ve ilaç bağlayıcı bölgelerin proteinler üzerinde ek açıklama için elde edilen bilgileri nicel olarak değerlendirmek için biyoinformatik analizini içerir.

İlaç-protein Etkileşimlerinin Küresel Doğrulanması için Biyosensör Tabanlı Yüksek Verimli Biyopanning ve Biyoinformatik Analiz Stratejisi

Alan etkili biyosensing (FEB), biyomoleküler etkileşimleri tespit etmek için etiketsiz bir tekniktir. Elektrik akımını, bağlanma hedeflerinin hareketsiz bırakıldığı grafen biyosensörü aracılığıyla ölçer. Hsp90 ve Cdc37 arasındaki biyomoleküler etkileşimleri değerlendirmek için FEB teknolojisi kullanıldı ve iki protein arasında güçlü bir etkileşim tespit edildi.

Moleküler Chaperone Hsp90 ve İstemci Protein Kinaz Cdc37 Arasındaki Biyomoleküler Etkileşimi Alan Etkili Biyosensing Teknolojisini Kullanarak Keşfetmek

Bu makale, streptavidin bazlı bir biyokatman interferometrisi (BLI) sistemi kullanarak DNA-protein etkileşimlerini incelemek için bir protokolü açıklamaktadır. Etkileşimin denge bağlanma afinitesini(KD) belirlemek için temel veya ileri bağlanma kinetiğini kullanmak için temel adımları ve hususları ana hatlarıyla belirtir.

DNA-Protein Etkileşimlerinin Streptavidin Tabanlı Biyotabaka İnterferometrisi ile İncelenmesi

MicroScale Thermophoresis (MST), aptamer-hedef etkileşimlerini karakterize etmek için hassas bir teknolojidir. Bu el yazması, aptamer-küçük molekül etkileşimlerini karakterize etmek için bir MST protokolünü açıklamaktadır.

Mikro Termoforesis kullanarak ATP bir aptamer Bağlama Sitesi Haritalama

Öğrenin dört biyosensör platformu kullanarak antikor-antijen bağlanma kinetiğini ölçme yöntemlerini. Bu çalışma, ilaç keşfi araştırmalarında güvenilir kinetik veri elde etmek için platform seçiminde rehberlik eder.

Dört Biyosensör Platformları kullanma Yüksek yakınlık Antikor-antijen Cilt Kinetiklerinin Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet